專(zhuān)利名稱(chēng)：：預(yù)防或治療帕金森病的藥物組合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種藥物組合物，尤其涉及一種由刺五加有效成分按照特定配比組成的藥物組合物，本發(fā)明還涉及該藥物組合物在預(yù)防或治療帕金森病中的用途，屬于帕金森病的治療領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：帕金森病(Parkinson'sdisease,PD)是一種常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其發(fā)病率隨年齡增長(zhǎng)而增加。我國(guó)現(xiàn)有PD患者170萬(wàn)，并以每年新增10萬(wàn)人速度增長(zhǎng)。由于該病嚴(yán)重影響患者的活動(dòng)能力和生活質(zhì)量，致殘率高，病程長(zhǎng)，往往需要終生治療，因而給人類(lèi)帶來(lái)了嚴(yán)重的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。所以迫切需求尋找預(yù)防和治療帕金森病的有效中藥，以延緩帕金森病的進(jìn)程和防止病情的加重。近年來(lái)，隨著現(xiàn)代生物技術(shù)手段在天然藥的應(yīng)用，中藥中的活性單體開(kāi)始成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)，而且在神經(jīng)退行性疾病方面的研究已經(jīng)取得了一定進(jìn)展。刺五力口為五力口才直物刺五力口(Acanthopanaxsenticosus(Rupr.etMaXim.)Harms.)的干燥根和根莖。主產(chǎn)于黑龍江省山區(qū)。味辛、微苦、性溫、無(wú)毒，具有益腎健脾，補(bǔ)腎安神作用。目前刺五加復(fù)方和刺五加注射液已用于帕金森病的臨床治療，并取得了一定療效，但是迄今為止，尚未見(jiàn)有將刺五加有效成分配比用于帕金森病的治療，所以刺五加有效成分配比治療帕金森病具有廣闊的市場(chǎng)開(kāi)發(fā)前景。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種對(duì)于帕金森病具有顯著療效的藥物組合物。本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的一種預(yù)防或治療帕金森病的藥物組合物，由刺五加苷B,刺五加苷D,丁香樹(shù)脂酚雙葡萄糖苦和胡蘿卜苦組成；為了達(dá)到更好的治療效果，優(yōu)選的，各組分的用量配比范圍是:刺五加苷B10~20Mg/ml，刺五加苷D20~40jLig/ml,丁香樹(shù)脂酚雙葡萄糖苷40~80|lig/ml,胡蘿卜苷2080)ag/ml。更優(yōu)選的，由刺五加苷B,刺五加苷D，丁香樹(shù)脂酚雙葡萄糖苷和胡蘿卜苷按照1:2:8:8的重量配伍而組成。上述各化合物均可以通過(guò)商業(yè)途徑購(gòu)買(mǎi)得到，也可按照現(xiàn)有的文獻(xiàn)所公開(kāi)的方法制備得到。將藥學(xué)上可接受用量的本發(fā)明藥物組合物與藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑配合后，按本領(lǐng)域常規(guī)的制劑方法將其制備成任意一種適宜的臨床制劑。通常本發(fā)明組合物適合于口服給藥和注射給藥，也適合其他的給藥方法。該組合物可以是片劑、膠囊劑、粉劑、顆粒劑、錠劑、栓劑或口服液等液體制劑形式。基于前期工作確定刺五加治療帕金森病的有效組分，并分離鑒定出有效組分中的四個(gè)化合物的基礎(chǔ)上，為了系統(tǒng)深入地研究刺五加有效成分配比治療帕金森病的作用，本發(fā)明采用細(xì)胞培養(yǎng)的方法，以1-甲基-4苯基吡啶離子(MPP+)作為體外毒素的代表，造成PC12細(xì)胞的損傷，建立PD的細(xì)胞模型。采用MTT法檢測(cè)PCu細(xì)胞存活率，確定刺五加有效組分中各成分的劑量水平范圍。最終確定各成分的用量配比范圍是刺五加苷B10~20|ag/ml,刺五加苷D20~40jug/ml,丁香樹(shù)脂酚雙葡萄糖苷4080)ag/ml，胡蘿卜苷20~80mg/ml。依據(jù)刺五加苷B、刺五加苷D、丁香樹(shù)脂酚雙葡萄糖苷和胡蘿卜香的劑量水平范圍，分別針對(duì)其各成分設(shè)計(jì)3個(gè)劑量水平，本發(fā)明以刺五加苷B、刺五加苷D、丁香樹(shù)脂酚雙葡萄糖香和胡蘿卜普作為考察的4個(gè)因素，按"(34)正交設(shè)計(jì)表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，釆用MTT比色法，以細(xì)胞存活率為考察指標(biāo)，采用方差分析法確定刺五加苷B、刺五加苷D、丁香樹(shù)脂酚雙葡萄糖苷和胡蘿卜苷的最佳配伍比例。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，刺五加的4個(gè)有效成分即刺五加苷B,刺五加苦D,丁香樹(shù)脂酚雙葡萄糖苷和胡蘿卜苷按照1:2:8:8的重量配比組成為最佳配比，由此配比所組成的藥物組合物能顯著提高PC12細(xì)胞存活率，對(duì)MPP+引起的PC12多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。本發(fā)明所提供的刺五加有效成分化學(xué)成分簡(jiǎn)單明確，在生產(chǎn)中更易于藥物的質(zhì)量控制。利用本發(fā)明得到的刺五加有效成分質(zhì)量穩(wěn)定，具有保護(hù)神經(jīng)元的藥理作用，因此可以用來(lái)制備療效好，安全可靠的預(yù)防和治療帕金森病的藥物。本發(fā)明藥物組合物中的各化學(xué)成分制備工藝簡(jiǎn)單，成本低，其毒副作用小。各化學(xué)成分簡(jiǎn)單明確，在生產(chǎn)中更易于藥物的質(zhì)量控制。利用本發(fā)明得到的刺五加有效成分配比質(zhì)量穩(wěn)定，具有保護(hù)神經(jīng)元的藥理作用，因此可以用來(lái)制備療效好，安全可靠的預(yù)防和治療帕金森病的藥物。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。實(shí)驗(yàn)例11、實(shí)驗(yàn)細(xì)胞抹中科院上海細(xì)胞所2、實(shí)^驗(yàn)藥物MPP+SIGMA-RBI乂A司刺五加苷B標(biāo)準(zhǔn)品3、實(shí)驗(yàn)方法將PC12細(xì)胞配成單細(xì)胞懸液，以5x107ml接種于96孔培養(yǎng)板。連續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后換液，在每孔中分別加入不同濃度的刺五加苦B稀釋液，使它的終濃度分別為2.5,5,10，20,40,80|ig/ml,同時(shí)加入終濃度300jumol/LMPP+溶液。再繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后，每孔加入MTT溶液(5mg/ml)2Gjul，37°C孵育4小時(shí)。終止培養(yǎng)后小心吸空培養(yǎng)基，每孔加入150|alDMS0，振蕩10分鐘，使結(jié)晶充分溶解。酶標(biāo)儀檢測(cè)每個(gè)孔在490nm處吸收值，計(jì)算細(xì)胞存活率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表l,表2。(細(xì)胞存活率％=實(shí)驗(yàn)組光吸收值/空白組光吸收值x100%),數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。表l不同濃度的刺五加苷B對(duì)MPP+誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷的影響(又土s)組別濃度OD值存活率(°/。)對(duì)照組0.48±0.06'100模型組MPP+300jumol/L0.42±0.0487.5給藥組2.5pg/ml+MPP+300pmol/L5|ug/ml+MPP+300拜ol/L10ug/ml+MPF300|amol/L0.44±0.070.48±0.090.49±0.09*91.7100102.1注:與模型組比較，*p<0.05表2不同濃度的刺五加苷B對(duì)MPP+誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷的影響(又±s)組別濃度0D值存活率(％)對(duì)照組0.46±0.09'100模型組MPP+300jamol/L0.38±0.0582.6給藥組20|ag/ml+MPP+300nmol/L40jug/ml+MPP+300,1/L80pg/ml+MPP+300pmol/L0.46±0.09*0.38±0.060.37±0.0610082.680.4注:與模型組比較，*p<0.05從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，不同濃度的刺五加香B對(duì)MPP+誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷的影響存在明顯的差異。與模型組相比，10,20jLig/ml刺五加苷B組細(xì)胞存活率明顯高于模型組(P〈0.05,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)，說(shuō)明10,20jug/ml刺五加苷B能顯著減少M(fèi)PP+的損傷效應(yīng)，從而使細(xì)胞存活率有較大幅度的提高。實(shí)驗(yàn)例21、實(shí)驗(yàn)細(xì)胞林中科院上海細(xì)胞所2、實(shí)-瞼藥物MPP+SIGMA-RBI/^司刺五加苦D標(biāo)準(zhǔn)品3、實(shí)驗(yàn)方法將PC12細(xì)胞配成單細(xì)胞懸液，以5x10Vml接種于96孔培養(yǎng)板。連續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后換液，在每孔中分別加入不同濃度的刺五加苷D稀釋液，使它的終濃度分別為2.5,5，10，20,40，80ug/ml,同時(shí)加入終濃度300|amol/LMPP+溶液。再繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后，每孔加入MTT溶液(5mg/ml)20jli1，37°C孵育4小時(shí)。終止培養(yǎng)后小心吸空培養(yǎng)基，每孔加入150julDMSO,振蕩10分鐘，使結(jié)晶充分溶解。酶標(biāo)儀檢測(cè)每個(gè)孔在490nm處吸收值，計(jì)算細(xì)胞存活率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3,表4。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。6表3不同濃度的刺五加苷D對(duì)MPP+誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷的影響(又±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注與模型組比較，*p<0.05表4不同濃度的刺五加苷D對(duì)MPP+誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷的影響(又±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注與模型組比較，*p<0.05從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，不同濃度的刺五加苷D對(duì)MPP+誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷的影響存在明顯的差異。與模型組相比，20,40|ug/ml刺五加苷D組細(xì)胞存活率明顯高于模型組(P<0.05,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)，說(shuō)明20,40jag/ml刺五加苷D能顯著減少M(fèi)PP+的損傷效應(yīng)，從而使細(xì)胞存活率有較大幅度的提高。實(shí)驗(yàn)例31、實(shí)驗(yàn)細(xì)胞林中科院上海細(xì)胞所2、實(shí)—驗(yàn)藥物MPP+SIGMA-RBI/^司丁香樹(shù)脂酚雙葡萄糖苷3、實(shí)驗(yàn)方法將PC12細(xì)胞配成單細(xì)胞懸液，以5xlOVml接種于96孔培養(yǎng)板。連續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后換液，在每孔中分別加入不同濃度的丁香樹(shù)脂酚雙葡萄糖苷稀釋液，使它的終濃度分別為2.5,5,10,20,40,80jag/ml,同時(shí)加入終濃度300拜ol/LMPP+溶液。再繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后，每孔加入MTT溶液(5mg/ml)20y1，37°C孵育4小時(shí)。終止培養(yǎng)后小心吸空培養(yǎng)基，每孔加入150jLi1DMSO，振蕩10分鐘，使結(jié)晶充分溶解。酶標(biāo)儀檢測(cè)每個(gè)孔在490nm處吸收值，計(jì)算細(xì)胞存活率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5、表6。數(shù)據(jù)以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(x土s)表示，用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。表5不同濃度丁香樹(shù)脂酚雙葡萄糖苷對(duì)MPP+誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷的影響(又士s)組別濃度OD值存活率(％)對(duì)照組0.57±0.07'100模型組MPP+300nmol/L0.51±0.0589.5給藥組2.5pg/ml+MPP+300|amol/L0.53±0.0593.05lag/ml+MPP+300拜ol/L0.55±0.0496.510jag/ml+MPP+300|amol/L0.55±0.0496.5注與模型組比較，*p<0.05表6不同濃度丁香樹(shù)脂酚雙葡萄糖苷對(duì)MPP+誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷的影響(又士s)組別濃度OD值存活率(％)對(duì)照組0.52±0.04'100模型組MPP+300jumol/L0.44±0.0684.6給藥組20|ug/ml+MPP+300|amol/L40jag/ml+MPP+300拜ol/L80)ng/ml+MPP+300nmol/L0.49±0.090.57±0.09'0.57±0.08'94.2109.6109.6注與模型組比較，*p<0.05從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，不同濃度的丁香樹(shù)脂酚雙葡萄糖苷對(duì)MPP+誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷的影響存在明顯的差異。與模型組相比，40，80Mg/ml丁香樹(shù)脂酚雙葡萄糖苷組細(xì)胞存活率明顯高于模型組(P<0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)，說(shuō)明40，80jug/ml丁香樹(shù)脂酚雙葡萄糖苷能顯著減少M(fèi)PP+的損傷效應(yīng)，從而使細(xì)胞存活率有較大幅度的提高。8實(shí)驗(yàn)例41、實(shí)驗(yàn)細(xì)胞林中科院上海細(xì)胞所2、實(shí)—驗(yàn)藥物MPP+SIGMA-RBI/>司胡蘿卜苷3、實(shí)驗(yàn)方法將PC12細(xì)胞配成單細(xì)胞懸液，以5xl04/ml接種于96孔培養(yǎng)板。連續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后換液，在每孔中分別加入不同濃度的胡蘿卜苷稀釋液，使它的終濃度分別為2.5，5,10,20，40,80|ig/ml,同時(shí)加入終濃度300pmol/LMPP+溶液。再繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后，每孔加入MTT溶液(5mg/ml)20n1，37°C孵育4小時(shí)。終止培養(yǎng)后小心吸空培養(yǎng)基，每孔加入150julDMSO，振蕩10分鐘，使結(jié)晶充分溶解。酶標(biāo)儀檢測(cè)每個(gè)孔在490mn處吸收值，計(jì)算細(xì)胞存活率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表7、表8。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。表7不同濃度的胡蘿卜苷對(duì)MPP+誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷的影響(又±s)組別濃度OD值存活率(％)對(duì)照組0.34±0.04.100模型組MPP+300|amol/L0.31±0.0391.2給藥組2.5)jg/ml+MPP+300|amol/L5|ag/ml+MPP+300|araol/L10|ag/ml+MPP+300|araol/L0.31±0.030.33±0.080.34±0.0591.297.1100注與模型組比較，*p<0.05表8不同濃度的胡蘿卜苷對(duì)MPP+誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷的影響(又士s)組別濃度OD值存活率(％)對(duì)照組0.37±0.05.100模型組MPP+300)amol/L0.31±0.0383.8給藥組20pg/ml+MPP+300|amol/L40ng/ral+MPP+300拜ol/L80pg/ml+MPP+300|amol/L0.37±0.06'0.42±0.09'0.52±0.09*100113.5140.5注與模型組比較，*p<0.059從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，不同濃度的胡蘿卜苷對(duì)MPP+誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷的影響存在明顯的差異。與模型組相比，20,40,80(ig/ml胡蘿卜苷組細(xì)胞存活率明顯高于模型組(P〈0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)，說(shuō)明20,40，80Mg/ml胡蘿卜苷能顯著減少M(fèi)PP+的損傷效應(yīng)，從而使細(xì)胞存活率有較大幅度的提高。實(shí)驗(yàn)例51、實(shí)驗(yàn)細(xì)胞林中科院上海細(xì)胞所2、實(shí)^驗(yàn)藥物MPP+SIGMA—RBI/^司刺五加苷B、刺五加苷D、胡蘿卜苷丁香樹(shù)脂酚雙葡萄糖苷3、實(shí)驗(yàn)方法依據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，得到各成分的劑量水平范圍(見(jiàn)表9),分別針對(duì)各有效成分設(shè)計(jì)3個(gè)水平，按L9(34)正交設(shè)計(jì)表(見(jiàn)表10)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)將PC12細(xì)胞配成單細(xì)胞懸液，以5x107ml接種于96孔培養(yǎng)板。連續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后換液，在每孔中分別加入不同樣品稀釋液，使它的終濃度為250)ng/ml,同時(shí)加入終濃度300lamol/LMPP+溶液。再繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后，每孔加入MTT溶液(5mg/ml)20p1，37°C孵育4小時(shí)。終止培養(yǎng)后小心吸空培養(yǎng)基，每孔加入150ia1DMSO,振蕩10分鐘，使結(jié)晶充分溶解。酶標(biāo)儀檢測(cè)每個(gè)孔在490nm處吸收值，計(jì)算細(xì)胞存活率。(細(xì)胞存活率y產(chǎn)實(shí)驗(yàn)組光吸收值/對(duì)照組光吸收值xiooy。)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表ll,方差分析結(jié)果見(jiàn)表12.表9各有效成分的劑量水平范圍水平范圍(ug/ml)刺五加苦B10-20刺五加苷D20-40丁香樹(shù)脂酚雙葡萄糖苷40-80胡蘿卜脊20~80<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>由上表可知，D因素影響顯著。A、B、C無(wú)顯著差別，所以選定最佳配伍比例為AACA,即四種有效成分配比為刺五加苷B:刺五加苷D:丁香樹(shù)脂酚雙葡萄糖苷:胡蘿卜苷為1:2:8:8。權(quán)利要求1、一種預(yù)防或治療帕金森病的藥物組合物，其特征在于由刺五加苷B，刺五加苷D，丁香樹(shù)脂酚雙葡萄糖苷和胡蘿卜苷組成。2、按照權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于各組分的用量配比范圍是刺五加苦B10~20Mg/ml，刺五加香D20~40|ug/ml,丁香樹(shù)脂酚雙葡萄糖苷40-80jug/m1,胡蘿卜苷20~80)ag/ml。3、按照權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于該藥物組合物由刺五加苷B,刺五加苦D,丁香樹(shù)脂酚雙葡萄糖苷和胡蘿卜苷按照1:2:8:8的重量配伍而組成。4、按照權(quán)利要求1-3任何一項(xiàng)所述的藥物組合物，其特征在于將所述藥物組合物與藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑配合后，按本領(lǐng)域常規(guī)的制劑方法將其制備成任意一種適宜的臨床制劑。5、按照權(quán)利要求4所述的藥物組合物，其特征在于所述的制劑是口服制劑或注射制劑。6、權(quán)利要求1-3任何一項(xiàng)所述的藥物組合物在制備治療帕金森病藥物中的用途。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種預(yù)防或治療帕金森病的藥物組合物及其制備方法。該藥物組合物由刺五加苷B，刺五加苷D，丁香樹(shù)脂酚雙葡萄糖苷和胡蘿卜苷組成。本發(fā)明確定了上述4種組分的最佳劑量水平范圍，在此基礎(chǔ)上采用了正交試驗(yàn)篩選出了上述4種活性成分之間的最佳配伍比例。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，將刺五加苷B，刺五加苷D，丁香樹(shù)脂酚雙葡萄糖苷和胡蘿卜苷按照1∶2∶8∶8的重量配伍而成的藥物組合物能顯著提高PC12細(xì)胞存活率，對(duì)多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞損傷具有顯著的保護(hù)作用。本發(fā)明所提供的刺五加有效成分化學(xué)成分簡(jiǎn)單明確，在生產(chǎn)中易進(jìn)行于質(zhì)量控制。本發(fā)明藥物組合物可以用來(lái)制備療效好，安全可靠的預(yù)防和治療帕金森病的藥物。文檔編號(hào)A61K31/704GK101537011SQ20091013557公開(kāi)日2009年9月23日申請(qǐng)日期2009年4月27日優(yōu)先權(quán)日2009年4月27日發(fā)明者劉樹(shù)民,芳盧,安麗鳳,楊婷婷申請(qǐng)人:劉樹(shù)民