專利名稱：一種干涉GDF9基因表達的 siRNA及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學以及生物工程技術領域，具體涉及抑制水牛生長分化因子9 (⑶F9)基因表達的SiRNA片段。
背景技術：
RNAi (RNA interference),即RNA干擾，是真核生物中普遍存在的抵抗病毒入侵、抑制轉座子活動、調控基因表達的監控機制。RNAi是通過雙鏈RNA誘導與之同源的mRNA降解，導致目標基因轉錄后緘默的現象或機制。此現象于1998年在對線蟲的研究中首次發現。siRNA是進入細胞內的外源dsRNA或內源產生的dsRNA，被Dicer酶切割成為21_23nt長的小分子，這種siRNA是RNAi機制中的關鍵中間產物，具有非常強的RNAi效應。 RNAi 途徑中，RISC (RNA induced silencing complex)的形成發揮了極大的作用。RISC是由小分子RNA(siRNA / miRNA), Dicer, DadR蛋白和Argonaute家族蛋白組成的復合體，其作用是直接造成與復合體中siRNA高度互補的mRNA被降解。RISC作用過程中，mRNA的切割發生在對應的siRNA 5’端10 11位核苷酸間，切割將mRNA —分為二，切割后mRNA從RISC上釋放。完成一次切割后，引導siRNA仍然結合在RISC中，繼續完成更多輪的切割。生長分化因子9(growth differentiation factor 9 ,GDF9)主要在卵泡中表達，同時在非性腺組織中有表達，能促進始基卵泡的發育，與FSH協同刺激卵泡生長，主要調控卵泡的生長發育和生殖功能。⑶F9基因敲除小鼠因初級卵泡發育受阻，從而影響生殖。而體外給予生物活性的⑶F9可誘導竇前卵泡生長和細胞分泌。以上表明⑶F9對卵泡的生長發育影響是有階段依耐性。Hanrahan等(2004)發現⑶F9的FecGH突變(G8突變)能顯著提高雜合綿羊的排卵率。siRNA作為一種新型的基因工具來抑制特定基因的表達，目前大規模應用于生物細胞、組織和個體，特別是用來制備基因敲低模式動物，從動物整體水平研究基因的功能，siRNA的抑制特定基因的優點是其他基因技術都無法比擬的。而對于水牛生長分化因子9的siRNA還未見研究報道。

發明內容
本發明的目的在于通過下調GDF9基因的部分功能來提高水牛的繁殖率，由于水牛繁殖率普遍較低，本發明提供了一種抑制水牛生長分化因子9(⑶F9)基因表達的siRNA。本發明通過以下技術方案實現上述目的
一種抑制水牛生長分化因子9 (⑶F9)基因表達的siRNA，分別命名為⑶F9-1、⑶F9-2和⑶F9-3，其核苷酸雙鏈中正義鏈序列如下
⑶F9-1 SEQ ID NO: I ；
⑶F9-2 SEQ ID NO:2 ；
⑶F9-3 SEQ ID NO:3。
所述siRNA與⑶F9基因mRNA反向互補，其長度為19 27bp。含有上述siRNA 的 shRNA。上述shRNA的編碼基因，兩端帶有I和I酶切位點的序列，便于構建表達質粒，雙鏈核苷酸序列如下
⑶F9-ldsDNA :正義鏈具有如SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列，反義鏈具有如SEQ IDNO:5所示的核苷酸序列；
⑶F9-2dsDNA :正義鏈具有如SEQ ID N0:6所示的核苷酸序列，反義鏈具有如SEQ IDNO:7所示的核苷酸序列；
⑶F9-3dsDNA :正義鏈具有如SEQ ID N0:8所示的核苷酸序列，反義鏈具有如SEQ ID N0:9所示的核苷酸序列。一種表達載體，由上述shRNA的編碼基因與出發載體構建的，即將shRNA編碼基因插入出發載體上構建而成。慢病毒載體可以直接高效率地感染分裂期和非分裂期細胞，且轉染效果更加穩定，作為上述出發載體中的優選方案，其中病毒載體最優選pshRNA-copGFP Lentivector。該載體具有完整的shRNA插入位點以及綠色突光蛋白(green fluorescence protein,GFP)報告基因，實現了靶基因shRNA的高效表達、病毒包裝以及轉基因的直觀展示。本發明的siRNA可以制備成基因藥物或其他合適的制劑用于下調水牛生長分化因子9的表達，從而提聞水牛的繁殖性能。與現有技術相比，本發明具有以下有益效果
本發明的siRNA沉默效果好，能夠特異性的下調GDF9基因的表達。通過實時定量Real-time PCR檢測發現各干擾片段能使⑶F9 mRNA表達量有的發生100%的抑制現象，ELISA檢測⑶F9蛋白表達量也相應降低。發明人構建了含有上述siRNA的編碼基因的pshRNA-copGFP Lentivector慢病毒干擾質粒，并對其進行了體外細胞水平的實驗，并制備了轉基因小鼠模型，結果證明了pshRNA-copGFP Lentivector慢病毒干擾質粒轉入細胞后能表達shRNA，并對水牛⑶F9基因進行特異性的抑制，從而在制備用于GDF9下調的生物制劑中有應用價值。


圖I. pcDNA3. I (+/_)載體圖 2. pPUC19-GDF9 酶切電泳圖，M DL15000 makeer, I :空質粒，2 : BanR I 單酶切，3 Bam^ I/ BcoR I 雙酶切；
圖 3. pcDNA3. I (-)載體酶切圖，I -.BatiiA I/ I 雙酶切，2 -.BamR I 單酶切，3 :空質粒，M 15000bp make ；
圖4.重組質粒pcDNA3. I-⑶F9菌落鑒定電泳圖，箭頭所指⑶F9基因擴增片段；
圖 5. pshRNA-copGFP Lentivector 載體圖 6. pshRNA-copGFP Lentivector 載體酶切圖，I :空質粒,2 -.BamW I 單酶切，3 -.BanfAI/ I雙酶切；
圖7.退火產物鑒定電泳圖 8.重組質粒 Lv-shRNA 鑒定，1、2 Lv-shRNAl, 3、4 Lv-shRNA2, 5 Lv-shRNA3, M 50bp maker ；
圖9.細胞總RNA電泳檢驗 圖10.水牛pcDNA3. I㈠-GDF9及LV_siRNA共轉染CHO細胞48h熒光顯微鏡圖(40X)；
圖11.慢病毒干擾質粒對水牛⑶F9 mRNA表達水平的影響，其中*表示差異顯著Gd< O. 05)；
圖12.轉染空質粒和慢病毒質粒后CHO細胞裂解液中GDF9蛋白濃度變化，其中*表不差異顯者(/* < O. 05)。
具體實施方式
以下結合具體實施方式
對本發明作進一步的詳細描述。實施例I構建P⑶NA3. I-⑶F9真核表達載體
I.合成水牛生長分化因子9 (⑶F9)序列(GenBank登錄號NM_174681)，連接于載體PUC19上，酶切為點為I與BamH。雙酶切(&oR I與BamH)和測序證明合成片段正確(見圖2)。2.構建pCDNA3. 1-GDF9真核表達質粒
(I)酶切反應
反應體系WcoR I與BamH I雙酶切PCR產物。BcoR I與BamH I雙酶切pcDNA3. I (-)，酶切體系10 X Buffer K 2 μ UEcoR I I μ L，BamH I I μ L，質粒 6 μ L，蒸餾水 10 μ L，總體積20yL。反應條件37°C作用I. 2h，進行1%瓊脂糖凝膠電泳。酶切產物用DNA純化試劑盒純化，最后各以30 μ L水洗脫DNA，-20°C保存。(2)連接反應
反應體系線性化pcDNA3. 1(_) 4μ , IOXLigation Buffer 2μ ,Τ4 DNA Ligase μ ,⑶F9目的片段13μ ，總體積為20 μ L。反應條件16°C連接過夜，獲得重組pCDNA3. 1-GDF9真核表達質粒。3.重組質粒轉化大腸桿菌
篩選步驟2中P⑶NA3. 1-GDF9真核表達質粒的陽性克隆，通用引物(T7和BGH)，序列號分別為SEQ ID NO: 10和SEQ ID NO: 11 ;擴增有1300bp左右長度的插入片段釋放出者視為陽性重組體(見圖4)。從上述方法鑒定的陽性克隆中挑選2個克隆，接種于LA培養基中制備新鮮菌液，經測序鑒定插入片段正確，構建PCDNA3. 1-GDF9真核表達載體成功。實施例2構建pshRNA-copGFP Lentivector慢病毒干擾質粒
I.根據水牛生長分化因子9的mRNA序列設計方法和原則篩選出靶序列，設計siRNA，與水牛生長分化因子9基因mRNA反向互補，分別命名為⑶F9-1、⑶F9-2、⑶F9-3，其正義鏈序列如下
⑶F9-1 SEQ ID NO: I ；
⑶F9-2 SEQ ID NO:2 ；
⑶F9-3 SEQ ID NO:3。2.再根據siRNA靶序列設計構建抑制水牛生長分化因子9基因表達的siRNA載體所需的DNA序列⑶F9 shRNA模板，兩端引入I和I酶切位點，送上海生物工程技術服務有限公司合成。具體序列如下(F表示正義鏈，R表示反義鏈)
⑶F9-lshRNA F SEQ ID NO:4 ；
⑶F9-lshRNA R SEQ ID NO:5 ；
⑶F9-2shRNA F SEQ ID NO:6 ；
⑶F9-2shRNA R SEQ ID NO:7 ；
⑶F9-3shRNA F SEQ ID NO:8 ；
⑶F9-3shRNA R SEQ ID NO:9。3.將合成好的上述寡核苷酸序列溶解并稀釋至濃度為I μ g/μ L，將上述6條序 列分成 3 對，其中⑶F9-lshRNA F 和⑶F9_lshRNA R 為 I 對，⑶F9_2shRNA F 和⑶F9_2shRNAR為I對，⑶F9-3shRNA F和⑶F9_3shRNA R為I對。3對序列分別進行退火反應。退火反應體系如下DNA模板單鏈I (⑶F9-lshRNA F)1 μ I,DNA模板單鏈2 (⑶F9_lshRNA R)1 μ 1，IOX退火溶液I μ 1，ddH20 17 μ I。反應條件混勻，95°C加熱IOmin ;室溫靜置過夜；稀釋至終濃度 IOng/μ I。-20°C備用。⑶F9-2shRNA F 和⑶F9_2shRNA R，以及⑶F9_3shRNA F和⑶F9-3shRNA R的退火反應體系同上，DNA模板單鏈替換成相應核苷酸序列即可。4. LV-shRNA-GFP 空質粒載體(即 pshRNA-copGFP Lentivector 空質粒,見圖 6)酶切，酶切體系如下:漢·H I I μ I,BcoR I I μ 1，10XBuffer K 2 μ I，LV-shRNA-GFP空質粒6 μ I, ddH20 10 μ I。37°C作用lh，進行I %瓊脂糖凝膠電泳，電泳結果見圖6。Omega凝膠片斷回收純化試劑盒回收載體片段。將步驟3所得的退火產物與酶切質粒載體連接，連接體系如下雙酶切質粒LV-ShRNA-GFP (O. I μ g/μ I) I μ I，退火產物 I μ 1，Τ4 DNA Ligase Buffer 2 μ 1，T4 DNALigase I μ l，ddH20 15 μ I。充分混勻，16 1水浴連接，反應過夜。5.轉化與陽性克隆的PCR鑒定轉化連接產物，挑取單個菌落，接種到LA液體培養基中，37°C恒溫振蕩培養3h。PCR鑒定陽性克隆，采用引物設計軟件Primer 5設計引物，其中上游引物序列為SEQ ID NO: 12，下游引物序列為SEQ ID NO: 13，由上海生物工程技術服務有限公司合成。擴增包括插入目的基因的DNA片段。PCR擴增片段為156bp，反應采用50μ 反應體系。體系的組成為=IOXPCR緩沖液5PL，2. 5mM dNTP 4μ ，上游引物(10pmol/>L) μ ，下游引物(10pmol/>L) μ ，步驟 5 中轉化后的菌液3PL，Taq DNA聚合酶(5U/^L) 0. 3μ ,補加ddH20至50μ 。按以下條件進行PCR反應-MV，5min ；94°C，30sec ；60°C，30sec ；72°C, 30sec，共 35 個循環；72°C, IOmin 延伸后結束反應。分別取5PL PCR產物，2%瓊脂糖凝膠電泳，檢查目的基因的擴增效果，電泳結果見圖8。6.陽性克隆測序挑選陽性克隆菌液測序(由Invitrogen公司進行3730型測序儀進行測序分析)。利用生物分析軟件DNAMAN進行同源性分析。構建成功的三種慢病毒干擾質粒分別命名為LV-siRNA I、LV-siRNA II和LV_siRNA III (LV_siRNA是對于用pshRNA-copGFP Lentivector構建的干擾質粒的簡稱,里面插入了 RNA干擾的dsDNA的序列)。實施例3 RNA干擾有效靶點的篩選 I.三種慢病毒干擾質粒轉染真核細胞
將 pcDNA3. 1-GDF9 分別和 LV-siRNA I ,LV-siRNA II 和 LV-siRNA III共轉染入 CHO 細胞進行表達。設pcDNA3. I-⑶F9和LV-shRNA-GFP空質粒共轉染CHO細胞作為對照，目的為與處理組轉染背景一致，每個處理設6個重復。其中pcDNA3. I-⑶F9與慢病毒干擾質粒的比例為1:1。脂質體轉染，按照Polyfect (購自QIAGEN公司)試劑說明書進行。(I)轉染前一天，在新六孔板培養皿中接種細胞，完全吹散細胞以保證細胞均勻的分布。當轉染時細胞最好鋪滿培養皿的40-90%。(2)將pcDNA3. I-⑶F9和慢病毒干擾質粒按I: I共4ug，加RPMI-1640培養基補至IOOul,溫柔地上下顛倒混勻6-8次,室溫孵育5min ；
(3)取IOul的Polyfect加入到IOOul DNA/RPMI-1640培養基中溫柔地上下顛倒混勻6-8次,室溫孵育lOmin。
(4)在第3步孵育形成轉染混合物的同時，用不含血清和抗生素的RPMI-1640洗細胞一次，然后加入I. 5mL含10%血清和1%抗生素的RPMI-1640完全培養基。(5)將第3步中產生的DNA/ RPMI-1640試劑混合物逐滴加入第4步中處理的六孔板培養皿中，輕輕地將混合物和培養基混勻，C02培養箱中37°C培養48小時，熒光倒置顯微鏡觀察轉染效率，部分細胞用Trizol收集，_70°C保存，用于RNA提取。2.轉染細胞總RNA提取
采用Invitrogen公司TRIzol Reagent提取轉染細胞總RNA。所用器材均經O. 1%DEPC水浸泡過夜，高壓滅菌后在鼓風干烤箱中烤干，操作過程均在超凈臺中進行。具體操作步驟如下
(1)在六孔板中立刻加入ImlTrizol/孔,裂解5min后轉移到RNase-free的I. 5ml的離心管中；
(2)每管加入200ul氯仿；
(3)旋潤振蕩器上混勻2min,室溫靜置lOmin,4°C 12000rpm離心15min ；
(4)離心后分三層，吸取上層清液(小心盡量不要吸到中層蛋白)到新的離心管中，力口入等體積的異戊醇；
(5)混勻，-20°C靜置沉淀40min, 4°C 12000rpm 離心 15min ；
(6)離心后可見白色沉淀于管底，小心棄掉上清，加入500ul75%乙醇，4°C，7500rpm離心 5min ；
(7)棄去乙醇后再洗滌一次，干燥，加入適量RNase-free水溶解；
(8)RNA定量取IulRNA樣品，加入99ul無RNA酶水中，混勻，稀釋100倍，用無RNA酶水做空白對照，于核酸蛋白分析儀中測OD值，RNA濃度；
(9)RNA電泳檢測取Iul樣品上樣，電壓90V，跑30min，照膠。為了防止質粒DNA的污染，提取的RNA用無RNase的DNA酶消化(IOXbuffer2yL，DNA酶O. luL，17.9yL RNA，反應總體系20uL，37°C，lh)。然后按加入酚一氯仿抽提，去除DNA酶，異丙醇沉淀，最后用O. P/oDEPC水溶解。I %瓊脂糖凝膠電泳，結果拍照。(見圖9)。3. Real time-PCR檢測細胞內⑶F9的表達豐度
GDF9的引物如下，GDF9上游引物SEQ ID NO: 14，下游引物SEQ ID NO: 15, PCR擴增片段為151bp。同體系設倉鼠β-actin基因為內參(β-actin上游引物SEQ ID N0:16，下游引物SEQ ID NO: 17)，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，擴增片段為428bp。以提取的總RNA為模板，以Oligo-dT為引物(工作濃度為IOpmol/μ L)進行RT反應。取總RNA 10μ L，65°C水浴lOmin，加Oligo-dT引物1μ L，70°C預變性5min，立即冰浴 5min ;在冰浴狀態下加入 5 X AMV 緩沖液 6 μ L, Rnasin O. 4 μ L(40U, Promega)，dNTP
I.5μ L, AMV O. 2μ L(8U, Promega)，用水補足至總體積 30μ L，混勻后于 42°C反應 Ih,80°C滅活5min。所有反轉錄產物用IXTE稀釋4倍，_20°C保存備用。以RT反應產物為模板，進行PCR反應(⑶F9擴增片段151bp ； β -actin擴增片段428bp)，體系的組成為10\ 0 緩沖液541^，2· 5mM dNTP 4μ ，上、下游引物(10pmol/>L)各1KL，模板2PL，Taq DNA聚合酶(5U/^L)0. 3μ ，補加ddH20至50μ 。反應條件95°C預變性5min ；95°C 30sec,56°C 30sec，72°C，30sec，35 個循環；72°C 延伸 lOmin。。
首先在熒光定量PCR專用96孔PCR板(置于冰上)的每個孔里分別加入 μ 模板(樣本的RT產物或系列標準品)，然后加入19μ1預混溶液(包括10μ1 Realtime PCRMaster Mix、l. 2 μΙΙΟμΜ引物、7. 8μ1滅菌雙蒸水)，總反應體系為20μ1。用小心將熒光定量PCR專用的96孔PCR板封口膜(ABgene公司，英國)覆蓋在PCR板上，壓緊，保證每個孔不透氣，短暫離心。每個處理設3個重復，并在每塊板上同時設陰性對照(以水為模板)。按ΑΒΙ7500型熒光定量PCR儀的操作說明放入96孔PCR板，設置PCR反應條件為95 °C /lmin預變性；95°C /15s變性，56°C /15s退火，72°C延伸40s，循環40圈。在確認目的基因與內參照β-actin基因實時熒光定量PCR擴增效率基本接近時(差異小于5% )，目的基因⑶F9的擴增效率為93%，內參β -actin的擴增效率為91. 3%。目的基因mRNA表達豐度可以用
^ (I+ Em)Ctx
At/ Am= P計算得到。轉染CHO細胞系熒光圖見圖 ο。
￠+Erfrr結果發現，與共轉染pcDNA3. 1-GDF9 質粒和 pshRNA-copGFP Lentivector 空質粒48h后相比，細胞共轉染pcDNA3. 1-GDF9和慢病毒干擾質粒LV- siRNA以后，⑶F9 mRNA表達極顯著下降(見圖11)。結果顯示三個慢病毒干擾質粒都一定程度抑制了⑶F9的表達，數據分析表明LV- siRNA I和LV- siRNA II抑制效率為均達到100%，LV- siRNA III抑制效率為90%以上(見圖11)。轉染慢病毒質粒后的CHO細胞裂解液中GDF9蛋白濃度明顯下降(見圖12)。綜上所述，體外細胞實驗表明本發明涉及的⑶F9 shRNA干擾質粒可有效地干預⑶F9基因的表達,可用于制造下調水牛生長分化因子9基因表達的制劑,提聞水牛繁殖率。
權利要求
1.一種抑制水牛生長分化因子9基因表達的siRNA，其特征在于，所述SiRNA的正義鏈具有以下任一序列GDF9-1 SEQ ID NO:I ；GDF9-2 SEQ ID NO:2 ；GDF9-3 SEQ ID NO:3。
2.—種shRNA，其特征在于含有權利要求I所述的siRNA。
3.如權利要求2所述shRNA，其特征在于，是以下任一雙鏈核苷酸序列 ⑶F9-ldsDNA :正義鏈具有如SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列，反義鏈具有如SEQ IDNO:5所示的核苷酸序列； ⑶F9-2dsDNA :正義鏈具有如SEQ ID N0:6所示的核苷酸序列，反義鏈具有如SEQ IDNO:7所示的核苷酸序列； ⑶F9-3dsDNA :正義鏈具有如SEQ ID N0:8所示的核苷酸序列，反義鏈具有如SEQ IDN0:9所示的核苷酸序列。
4.一種表達載體，其特征在于是由權利要求3所述的shRNA編碼基因與出發載體構建。
5.如權利要求4所述的表達載體，其特征在于所述出發載體為慢病毒載體pshRNA-copGFP Lentivector0
6.如權利要求I所述的siRNA在制備抑制水牛生長分化因子9表達的藥物中的應用。
7.如權利要求I所述的siRNA在提高水牛繁殖率上的應用。
全文摘要
本發明公開了一種抑制水牛生長分化因子9(growthdifferentiationfactor9，GDF9)基因表達的siRNA，屬于基因工程技術領域。本發明所述的siRNA正義鏈具有SEQ ID NO:1～3所示的任一序列。本發明還公開了含有該siRNA的shRNA編碼基因及由其構建的慢病毒干擾質粒pshRNA-copGFPLentivector。通過實時定量Real-timePCR檢測，相對表達量公式計算，其中兩個siRNA片段分別對水牛GDF9mRNA抑制效率超過100%，ELISA檢測GDF9蛋白表達量也相應降低。本發明的siRNA片段及其表達載體可用于制備抑制水牛GDF9表達的制劑，能夠顯著下調GDF9基因的表達量。
文檔編號A61P43/00GK102965372SQ20121043802
公開日2013年3月13日 申請日期2012年11月6日 優先權日2012年11月6日
發明者習欠云, 張永亮, 施振旦, 肖敏, 蕉莉, 石德順, 劉慶友 申請人:華南農業大學