專利名稱：一種豬瘟活疫苗的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種豬瘟活疫苗，尤其是一種含有適量滅活草分枝桿菌菌體的豬瘟活疫苗。
背景技術：
豬痕(Classicalswine fever, CSF)是由豬痕病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起豬的一種高度接觸性、致死性的傳染病。該病唯一的自然宿主是豬，是危害養豬業最嚴重的傳染病之一，死亡率能夠達到90%以上(殷震，劉景華，動物病毒學(第一版)fMl，北京，科學出版社，1997，652-653)。20世紀50年代，在各國研制出較為理想的滅活苗(Dalsgaard K, Overby E. Vaccination of pigs against hog cholera(classical swine fever)with a detergent split vaccine[J]. Acta Vet Scand. 1976,17 :465-474)的同時，我國學者周泰沖等研究的中國系(C系)豬瘟兔化弱毒疫苗、日本的細胞弱毒疫苗、和法國的Thiverval 株等都獲得成功并在豬瘟控制中起了得重要的作用。這三大品系疫苗的廣泛應用，改變了全世界豬瘟防制的窘迫局面。目前，國內普遍使用的豬痕活疫苗是1954年培育出豬痕病毒兔化弱毒株(Hog Cholera Lapinized Virus, HCLV)制備而成的。該疫苗具有免疫力快、免疫譜寬、遺傳穩定、無殘毒、不引起胎兒畸變等優點。隨著畜牧業的不斷發展，對疫苗品質的要求也在不斷提高，高效的豬瘟疫苗更是大勢所趨。其中，使用免疫增強劑是一種常用的提高疫苗效力的方法。草分枝桿菌是分枝桿菌中的一種，由于分枝桿菌胞壁酰二肽(MDP)具有很強的免疫治療作用，草分枝桿菌多糖MPS在免疫調節、抑制病毒復制方面有很好的效果(周莉婷、 趙晶晶等，分枝桿菌多糖免疫調節劑研究進展[J]，藥物生物技術，2011，18 (2) :176-179)， 因而草分枝桿菌是一種優秀的免疫增強劑。草分枝桿菌可用于豬瘟活疫苗中，通過提高宿主自身的免疫應答能力來提增強疫苗免疫力，安全可靠。由于草分枝桿菌發酵方便、成本低廉，便于臨床大面積推廣使用。草分枝桿菌菌體在添加到豬瘟活疫苗半成品之前需要滅活。由于普通的甲醛滅活劑有殘留的風險，能對豬瘟病毒產生影響，我們考慮使用β -丙內酯對草分枝桿菌菌體進行滅活。由于β-丙內酯水溶液半衰期短(10°C時僅為18hr，25°C時為3. 5hr，50°C時為 20min，75°C時為5min)，能在疫苗液體中完全水解，不必考慮在成品疫苗中的殘留，滅活的草分枝桿菌菌體中無滅活劑殘留，能夠有效保護豬瘟病毒的免疫原性。

發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種更加高效的豬瘟活疫苗，從而在將豬瘟活疫苗的免疫水平提高到一個新的高度，更加有效的預防免疫豬群豬瘟的發生。為解決上述技術問題，本發明的技術方案為
將編號為CGMCC AS 4. 1180的草分枝桿菌菌株，制備成草分枝桿菌菌體；按常規方法用豬痕病毒(Classical swine fever virus,CSFV)兔化弱毒株(CVCC AV1412)制備成兔源抗原后，按每頭份疫苗中含O. 01 O. lmg，優選量為O. 06mg加入草分枝桿菌草分枝桿菌(CGMCC AS 4. 1180菌株)菌體后，再經過混勻、凍干等步驟，制成豬瘟活疫苗(兔源)；按常規方法用豬瘟病毒兔化弱毒株(CVCC AV1412)制備成細胞源抗原后，按每頭份疫苗中含O. 01 O. lmg，優選量為O. 06mg加入草分枝桿菌菌體后，再經過混勻、凍干等步驟，制成豬瘟活疫苗(細胞源)。
具體實施例方式I.草分枝桿菌菌株來源本發明涉及到的草分枝桿菌(Mycobacterium phlei)CGMCC AS 4. 1180菌株購于北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所中國普通微生物保藏管理中心，編號CGMCC AS 4. 1180(中國微生物菌種保藏管理委員會，中國菌種目錄，機械工業出版社，1992，p285)。2.草分枝桿菌菌體的制備(I)種子培養將草分枝桿菌CGMCC AS 4. 1180株置于種子罐中進行培養，37°C通氣培養，pH值為7. 0，培養時間為3 4天，得到發酵用種子液；種子罐中的培養基配方酵母提取粉I. Og 5. 0g，濃縮麥芽汁(購自濟南雙麥啤酒物資有限公司)2. Og 10. Og,葡萄糖5. Og 50g,磷酸氫二銨I. Og 4. Og,磷酸氫二鉀
O.5g I. Og,注射用水加至IOOOmlo(2)草分枝桿菌發酵培養將配制好的液體培養基與所培養的種子液一起放入種子罐進行發酵培養，37°C通氣培養，pH值為7.0，培養時間為5天；發酵罐中培養基配方酵母提取粉5. Og 10. 0g，濃縮麥芽汁(購自濟南雙麥啤酒物資有限公司)5. Og 20g,葡萄糖20g IOOg,磷酸氫二銨I. Og 4. Og,磷酸氫二鉀
O.5g I. Og,注射用水加至IOOOmlo⑶后處理將發酵液用的β -丙內酯(V/V終濃度為1/5000 1/3000，優選1/4000)滅活， 4°C滅活24h，然后再于37°C水解2h，離心濃縮，棄去上清液，取下層菌體用適量生理鹽水重懸浮3次，離心除去雜質，測定水分，計算干菌體重量，即得滅活的草分枝桿菌菌體。3.豬瘟活疫苗的制備本發明的豬瘟活疫苗用的毒種為豬瘟病毒兔化弱毒株，購自中國獸醫藥品監察所，中國獸醫微生物菌種保藏管理中心，編號為CVCC AV1412(中國獸醫藥品監察所，中國獸醫微生物菌種保藏管理中心，中國獸醫菌種目錄，第二版，中國農業科學技術出版社，2002， pl45)。(I)半成品制備工藝一
I)生產用毒種的制備(兔源脾毒)選擇營養良好的家兔，將凍干的豬瘟兔化弱毒株毒種用滅菌生理鹽水制成50倍稀釋的乳劑，每兔耳靜脈注射1ml。選擇定型熱反應兔，從體溫下降及其以后的24小時內剖殺。無菌采取脾臟冷凍或凍干保存，作為生產用毒種。2)制苗用病毒的制備①將生產用毒種用無菌生理鹽水稀釋50倍后每兔耳靜脈注射1ml。②選定定型熱和輕熱反應兔，從體溫下降及其以后的24小時內剖殺，無菌采取脾臟和淋巴結，得到高效豬瘟活疫苗半成品，立即配苗或迅速凍結保存后配苗。工藝二I)生產用毒種的制備(細胞毒)用細胞維持液將脾毒制成O. 3% O. 5%的病毒懸液，接種生長良好的牛睪丸或羊腎單層細胞，置36 37°C繼續培養。每隔4 5日收獲換液一次，取二收、三收細胞培養毒液作為生產用毒種。2)細胞的制備①無菌采取牛睪丸，并去除被膜、附睪、腎盂、腎蓋，將組織剪成I 2mm小塊，用 Hank’ s液沖洗至上清液清亮。②將組織塊放入消化瓶中，加入5 8倍的O. 25%胰酶溶液，37°C水浴消化。③棄去胰酶溶液后，脫酶I 3次，再加入營養液，以玻璃珠振搖法分散細胞后，用紗布濾過，收取細胞懸液，分裝于培養瓶中，置36 37°C進行旋轉培養，轉速為10 12r/ h,3 5日長成單層。④原代細胞長成單層后，以(I : 3) (I : 5)制成次代細胞懸液，繼續旋轉培養至形成良好單層。3)制苗毒液的制備①取形成良好單層的牛睪丸次代細胞，棄去培養液，接種含3% 5%生產用細胞毒種，置36 37 °C繼續培養。②接毒后5日做第一次收獲換液，以后每隔4日收獲換液I次，得半成品，置于-15°C以下保存。(2)配苗按照每頭份疫苗加入O. 01 O. Img (優選O. 06mg)菌體的量，在豬瘟活疫苗半成品中加入草分枝桿菌菌體，并且按照比例加入5%蔗糖脫脂牛奶穩定劑或其他凍干保護劑， 攪拌均勻后分裝，最后進行冷凍真空干燥，根據抗原的不同分別制成豬瘟活疫苗(兔源)和豬瘟活疫苗(細胞源)。4.對比試驗(I)分別制備不添加草分枝桿菌菌體的豬瘟活疫苗(細胞源)、豬瘟活疫苗(兔源)和每頭份添加O. 06mg草分枝桿菌菌體的豬瘟活疫苗(細胞源)、豬瘟活疫苗(兔源)，備用。(2)取四種豬瘟活疫苗，用生理鹽水稀釋成I頭份/ml，分別肌肉注射無豬瘟中和抗體的豬20頭。
(3)免疫后15日采集免疫豬血清，采用阻斷ELISA方法檢測豬瘟抗體水平。(4)診斷試劑豬瘟抗體ELISA試劑盒為法國LSI豬瘟抗體檢測試劑盒，購自北京天之泰生物科技有限公司，生產批號為5-VETPPC-002。(5)判定標準阻斷率30陰性；< 40而> 30為可疑；> 40為陽性。(6)試驗結果
權利要求
1.一種豬痕活疫苗,其特征是該疫苗含有豬痕病毒(Classical swine fever virus, CSFV)兔化弱毒株(CVCC AV1412)和滅活的草分枝桿菌菌體。
2.一種如權利要求I所述一種豬瘟活疫苗，其特征在于其中滅活的草分枝桿菌菌體是利用草分枝桿菌(Mycobacterium phlei)CGMCC AS 4. 1180菌株發酵培養后，使用β-丙內酯進行滅活的產物。
3.一種制備權利要求I所述的豬瘟活疫苗的制造方法，其特征在于按常規方法用豬瘟病毒(Classical swine fever virus)兔化弱毒株(CVCC AV1412)制備成兔源抗原后，按每頭份疫苗中含O. 01 O. lmg，優選量為O. 06mg加入滅活的草分枝桿菌菌體，再經過混勻、 凍干等步驟，制成豬瘟活疫苗(兔源)。
4.一種權利要求I所述的豬瘟活疫苗的制造方法，其特征在于按常規方法用豬瘟病毒 (Classical swine fever virus)兔化弱毒株(CVCC AV1412)制備成細胞源抗原后,按每頭份疫苗中含O. 01 O. lmg，優選量為O. 06mg加入滅活的草分枝桿菌菌體后，再經過凍干等步驟，制成豬瘟活疫苗(細胞源)。
全文摘要
本發明涉及一種豬瘟活疫苗及其生產方法。該疫苗是在普通商品化豬瘟活疫苗中加入了適量的草分枝桿菌菌體，注射后通過提高宿主自身的免疫應答能力，并與豬瘟病毒兔化弱毒株抗原協同作用，達到增強疫苗免疫力的作用，安全可靠。由于草分枝桿菌發酵方便、成本低廉，可應用于高效豬瘟活疫苗的生產中。本發明提高了豬瘟活疫苗的免疫效果，能夠更加有效的預防豬瘟的發生，具有直接的經濟效益和社會效益。
文檔編號A61P31/14GK102600469SQ20121005730
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月7日 優先權日2012年3月7日
發明者劉紅娟, 吳昊, 徐龍濤, 王蕾, 鮑海忠 申請人:齊魯動物保健品有限公司