專利名稱：一種可溶性酵母葡聚糖的制備方法
技術領域：
本發明涉及葡聚糖技術領域，尤其是涉及一種制備可溶性酵母葡聚糖的方法。
背景技術：
酵母β -D-葡聚糖(簡稱酵母β -葡聚糖或酵母葡聚糖)是一種擁有良好生理功能的免疫調節劑(非特異性免疫增強劑)，具有增強免疫力、抗腫瘤、抗菌消炎、抗氧化、促進傷口愈合、抗輻射、降低血脂等生理功效，但是它不溶于水和絕大多數其它溶劑，僅微溶于二甲亞砜，這嚴重限制了酵母葡聚糖的應用。為了提高酵母葡聚糖的溶解度，國內外學者對其進行了修飾和改性研究，包括化 學方法和物理方法。主要的化學修飾法有磷酸化、羧甲基化、硫酸酯化和磺基化修飾,通過在葡聚糖上連接這些極性基團來增加其溶解度。但是這類反應通常都要在液態均相或非均相體系中進行，需要消耗大量的溶劑，甚至是不安全有機溶劑以及酸、堿等，不僅成本高、污染嚴重，還可能造成安全隱患。主要的物理方法為超聲解聚和氧化降解法，通過降低葡聚糖的分子量來增加其溶解度。但是超聲解聚只能降低葡聚糖的分子量到一個極限恒定值，而氧化降解則會在葡聚糖中引入氧化劑等雜質。

發明內容
針對現有技術存在的上述問題，本申請人提供了一種可溶性酵母葡聚糖的制備方法。采用本方法制備的酵母葡聚糖可以有效溶于水中，并具有優良的免疫活性，同時本方法具有簡便、快速、高效、不使用有機溶劑和強酸、強堿試劑的特點。本發明的技術方案如下
一種可溶性酵母葡聚糖的制備方法，采用機械化學方法，在固相體系中，通過固態化學反應對酵母葡聚糖進行化學修飾和改性。具體過程如下
(1)將粉末狀酵母葡聚糖原料與固態小分子修飾試劑按質量比I:f10混合好后，采用機械化學方法處理4飛Omin ；
(2)將步驟(I)處理后得到的葡聚糖混合物溶于水中得到溶解液，葡聚糖混合物與水的質量比為1:5 20 ;如果產生沉淀，則通過離心除去不溶物，從而得到溶解液；
(3)對步驟(2)得到的溶解液進行透析或超濾，除去多余的修飾試劑，得到酵母葡聚糖溶液。將步驟(3)所得酵母葡聚糖溶液進行濃縮后，可以得到酵母葡聚糖濃縮液；將步驟(3)所得酵母葡聚糖溶液進行噴霧干燥或冷凍干燥后，可以得到酵母葡聚糖干粉。所述機械化學方法為行星式球磨。所述固態小分子修飾試劑包括硫酸鹽、磷酸化合物或氯乙酸鹽。制得的酵母葡聚糖的化學修飾度，即磷酸基團、硫酸基團或羧甲基基團的取代度為O. 4 60%。所述硫酸鹽包括且不限于硫酸銨、硫酸銅、硫酸鈣、硫酸鉀、硫酸鈉、硫酸鋁鉀；磷酸化合物包括且不限于磷酸鈣、次磷酸鈣、磷酸氫二銨、磷酸二氫銨、磷酸氫鈣、焦磷酸鈣、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、酸式焦磷酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸鈉、焦磷酸鈉、聚偏磷酸鉀、多聚磷酸、多聚磷酸鈉；氯乙酸鹽包括且不限于一氯乙酸鈉、二氯乙酸鈉。本發明有益的技術效果在于
本發明制備方法屬于機械化學方法，機械化學是一種不同于熱化學、電化學和光化學的第四種化學活化形式，是指固體顆粒物質在摩擦、碰撞、沖擊、剪切等機械力作用下，使晶體結構及物化性能發生改變，把機械能高效轉化成固體物質內能，提高固體物質化學活性，反應過程只需低反應溫度和較低的能量消耗，并且可以實現清潔生產。本發明采用行星式球磨(簡稱為行星磨)，在固態體系中對酵母葡聚糖進行修飾和改性，從而達到快速、高效的酵母β-葡聚糖增溶效果，提高它們的生物活性。本發明不使用有機溶劑和強酸、強堿試劑，幾乎沒有污染，制得的酵母β -葡聚糖能夠完全溶于水，且具有優良的免疫活性，因此有望有效地應用于食品、保健品、醫藥、飼料等行業中，提升酵母
葡聚糖作為生物免疫調節劑的應用價值。
具體實施例方式以下通過實施例來進一步闡明本發明，下列實施例用于說明目的而非用于限制本發明范圍。以下實施例中所用酵母葡聚糖原料為上海杰康諾生物科技有限公司生產的酵母β _匍聚糖GNP-80。實施例I :機械化學法制備磷酸化酵母葡聚糖方案I
酵母葡聚糖與磷酸鈣以質量比1:1混合均勻后，采用行星磨進行機械化學處理，功率為900 W，處理時間為4 min;處理后的酵母葡聚糖混合物以質量比1:5溶解于水后，使用離心機在4000 rpm轉速下離心20 min，其中42%的酵母葡聚糖溶于水，58%的酵母葡聚糖不溶于水；將溶于水的溶解液用水進行多次透析，以除去多余的磷酸化合物。透析后的酵母葡聚糖濃度為12. I mg/ml，磷酸基團取代度為O. 4%。實施例2 :機械化學法制備硫酸化酵母葡聚糖方案I
酵母葡聚糖與硫酸鈉以質量比1:6混合均勻后，采用行星磨進行機械化學處理，功率為900 W，處理時間為12 min ;處理后的酵母葡聚糖混合物以質量比1:5溶解于水后，使用離心機在4000 rpm轉速下離心20 min，其中36%的酵母葡聚糖溶于水，64%的酵母葡聚糖不溶于水；將溶于水的溶解液用水進行多次透析，以除去多余的硫酸鹽。透析后的酵母葡聚糖濃度為8. 8 mg/ml，硫酸基團取代度為I. 9%。實施例3 :機械化學法制備硫酸化酵母葡聚糖方案2
酵母葡聚糖與硫酸銨以質量比1:6混合均勻后，采用行星磨進行機械化學處理，功率為1200 W，處理時間為16 min ;處理后的酵母葡聚糖混合物以質量比1:20溶解于水中，使用離心機在4000 rpm轉速下離心20 min后沒有沉淀；將溶解液用水進行多次透析，以除去多余的硫酸鹽。透析后的酵母葡聚糖濃度為6. O mg/ml,硫酸基團取代度為6. 6%。將透析后的酵母葡聚糖經O. 22 μ m濾膜過濾除菌，再稀釋至合適濃度后進行小鼠脾淋巴細胞增殖實驗。結果顯示，濃度為50 g/ml時對小鼠脾淋巴細胞的增殖率為117. 7%，濃度為200 g/ml時增殖率為196. 6%，說明硫酸化酵母葡聚糖對小鼠脾淋巴細胞具有刺激增殖作用。實施例4 :機械化學法制備磷酸化酵母葡聚糖方案2酵母葡聚糖與焦磷酸鈉以質量比1:6混合均勻后，采用行星磨進行機械化學處理，功率為1200 W，處理時間為20 min ;處理后的酵母葡聚糖混合物以質量比1:20溶解于水中，使用離心機在4000 rpm轉速下離心20 min后沒有沉淀；將溶解液用水進行多次透析，以除去多余的磷酸鹽。透析后的酵母葡聚糖濃度為20. 6 mg/ml，磷酸基團取代度為1.4%。將透析后的酵母葡聚糖經O. 22 μ m濾膜過濾除菌，再稀釋至合適濃度后進行小鼠脾淋巴細胞增殖實驗。結果顯示，濃度為50 g/ml時對小鼠脾淋巴細胞的增殖率為121. 8%，濃度為200 g/ml時增殖率為123. 8%，說明磷酸化酵母葡聚糖對小鼠脾淋巴細胞具有刺激增殖作用。實施例5 :機械化學法制備羧甲基化酵母葡聚糖方案I
酵母葡聚糖與一氯乙酸鈉試劑以質量比1:4混合均勻后，采用行星磨進行機械化學處理，功率為1200 W，處理時間為16 min ;活化后的酵母葡聚糖混合物以質量比1:20溶解于水中，使用離心機在4000 rpm轉速下離心20 min后沒有沉淀；將溶解液用水進行多次透 析，以除去多余的小分子鹽類。透析后的酵母葡聚糖濃度為24. 8 mg/ml，羧甲基取代度為2. 0%。將透析后的酵母葡聚糖經O. 22 μ m濾膜過濾除菌，再稀釋至合適濃度后進行小鼠脾淋巴細胞增殖實驗。結果顯示，濃度為50 g/ml時對小鼠脾淋巴細胞的增殖率為120. 4%，濃度為200 g/ml時增殖率為215. 0%，說明羧甲基化酵母葡聚糖對小鼠脾淋巴細胞具有刺激增殖作用。實施例6 :機械化學法制備羧甲基化酵母葡聚糖方案2
酵母葡聚糖與二氯乙酸鈉試劑以質量比1:10混合均勻后，采用行星磨進行機械化學處理，功率為1200 W，處理時間為60 min ;活化后的酵母葡聚糖混合物以質量比1:10溶解于水中，使用離心機在4000 rpm轉速下離心20 min后沒有沉淀；將溶解液用水進行多次透析，以除去多余的小分子鹽類。透析后的酵母葡聚糖濃度為7. 6 mg/ml，羧甲基取代度為59. 8%。上述實施例中，磷酸基團取代度、硫酸基團取代度、羧甲基基團取代度統稱為化學修飾度。酵母葡聚糖濃度的測定采用測定植物糖濃度的蒽酮法。磷酸基團取代度的測定采用定磷法測定磷酸化酵母葡聚糖中磷酸基團的摩爾濃度，磷酸化酵母葡聚糖的磷酸基團摩爾濃度與它的葡萄糖基團摩爾濃度之比即為磷酸基團取代度。硫酸基團取代度的測定采用濁度法測定硫酸化酵母葡聚糖中硫酸基團的當量濃度，硫酸化酵母葡聚糖的硫酸基團當量濃度與它的葡萄糖基團摩爾濃度之比即為硫酸基團取代度。硫酸基團的當量濃度測定用3%三氯乙酸將硫酸化酵母葡聚糖中的硫酸基釋放出來，與鋇離子在明膠中形成渾濁，于波長500nm下測定濁度，以硫酸鉀作標準曲線后，計算硫酸化酵母葡聚糖中的硫酸基團含量。羧甲基取代度的測定化學絡合滴定法。取I mL羧甲基化酵母葡聚糖溶液，力口50 mL 水，20 mL NH4Cl 緩沖溶液，再用 O. I mol/L HCl 或 O. I mol/L NaOH 將溶液 pH 調至7. 5 8. O。轉移至250 mL容量瓶中，加入50 mL CuSO4溶液，搖勻，放置15 min。稀釋至刻度，搖勻，過濾，取濾液100 mL，用紫脲酸銨作指示劑，用EDTA標準溶液滴定至終點。相同條件下測硫酸銅溶液空白。羧甲基取代度為162A/(8100-80A)，其中A=C(Ki) X2X0. 162+W，C為EDTA標準溶液的濃度，K為CuSO4空白用去EDTA的體積，K為樣品用去EDTA的體積，W為樣品中葡聚糖的質量。小鼠脾淋巴細胞增殖率的檢測(1)小鼠淋巴細胞的制備將小鼠頸椎脫臼處死，取脾臟，用PBS沖洗:Γ4次。將脾臟磨碎后過100目篩，過篩后的混懸液以400 rpm離心6min。吸去上清液,沉淀中按每只小鼠I. 5 mL的量加入氯化銨紅細胞裂解液,反復沖打,靜置10 min后,加PBS至50 mL,然后以400 rpm離心6 min,吸去上清液,加PBS緩沖液沖洗并離心2遍后，吸去上清，加入RPMI1640培養基混勻，用細胞計數儀計數并稀釋成2 X IO6個/mL細胞液備用。(2)細胞培養將2X IO6個/mL淋巴細胞懸浮液加至96孔板中，每孔加180 μ L，同時加入20 μ L樣品液，以20 μ L PBS和20 μ L 60 μ g/mL的PHA溶液分別作陰、陽性對照。于37°C、含5%的CO2條件下培養3d。(3)淋巴細胞增殖率的測定在上述細胞培養的96孔板中，每孔分別加入20 μ I 5mg/ml的MTT溶液，繼續培養4 h，終止培養，將96孔板于2000 rpm離心6 min,小心吸去孔內培養液,每孔加入150 μ I 二甲基亞砜,置搖床上低速振蕩10 min使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀OD57tlnm處測量各孔的吸光值。 同時設置調零孔和對照孔。增殖率(％) = (0D570sample/0D570_tMl) X 100%。以上所述的僅是本發明的優選實施方式，本發明不限于以上實施例?？梢岳斫?，本領域技術人員在不脫離本發明構思的前提下直接導出或聯想到的其他改進和變化，應包含在本發明的保護范圍之內。
權利要求
1.ー種可溶性酵母葡聚糖的制備方法，其特征在于采用機械化學方法，在固相體系中，通過固態化學反應對酵母葡聚糖進行化學修飾和改性。
2.根據權利要求I所述的可溶性酵母葡聚糖的制備方法，其特征在于具體過程如下 (1)將粉末狀酵母葡聚糖原料與固態小分子修飾試劑按質量比I:f 10混合好后，采用機械化學方法處理4飛Omin ； (2)將步驟(I)處理后得到的葡聚糖混合物溶于水中得到溶解液，葡聚糖混合物與水的質量比為1:5 20 ;如果產生沉淀，則通過離心除去不溶物，從而得到溶解液； (3)對步驟(2)得到的溶解液進行透析或超濾，除去多余的修飾試劑，得到酵母葡聚糖溶液。
3.根據權利要求2所述的可溶性酵母葡聚糖的制備方法，其特征在于將步驟(3)所得酵母葡聚糖溶液進行濃縮后，可以得到酵母葡聚糖濃縮液；將步驟(3)所得酵母葡聚糖溶液進行噴霧干燥或冷凍干燥后，可以得到酵母葡聚糖干粉。
4.根據權利要求I或2所述的可溶性酵母葡聚糖的制備方法，其特征在于所述機械化學方法為行星式球磨。
5.根據權利要求2所述的可溶性酵母葡聚糖的制備方法，其特征在于所述固態小分子修飾試劑包括硫酸鹽、磷酸化合物或氯こ酸鹽。
6.根據權利要求I或2所述的可溶性酵母葡聚糖的制備方法，其特征在于制得的酵母葡聚糖的化學修飾度，即磷酸基團、硫酸基團或羧甲基基團的取代度為O. 4飛0%。
7.根據權利要求5所述的可溶性酵母葡聚糖的制備方法，其特征在于所述硫酸鹽包括且不限于硫酸銨、硫酸銅、硫酸鈣、硫酸鉀、硫酸鈉、硫酸鋁鉀； 磷酸化合物包括且不限干磷酸鈣、次磷酸鈣、磷酸氫ニ銨、磷酸ニ氫銨、磷酸氫鈣、焦磷酸鈣、磷酸ニ氫鉀、磷酸氫ニ鉀、酸式焦磷酸鈉、磷酸ニ氫鈉、磷酸氫ニ鈉、磷酸鈉、焦磷酸鈉、聚偏磷酸鉀、多聚磷酸、多聚磷酸鈉； 氯こ酸鹽包括且不限于ー氯こ酸鈉、ニ氯こ酸鈉。
全文摘要
一種可溶性酵母葡聚糖的制備方法，采用機械化學方法，在固相體系中，通過固態化學反應對酵母葡聚糖進行化學修飾和改性，具體過程(1)將粉末狀酵母葡聚糖原料與固態小分子修飾試劑按質量比1:1~10混合好后，采用機械化學方法處理4~60min；(2)將步驟(1)處理后得到的葡聚糖混合物溶于水中得到溶解液，葡聚糖混合物與水的質量比為1:5~20；如果產生沉淀，則通過離心除去不溶物，從而得到溶解液；(3)對步驟(2)得到的溶解液進行透析或超濾，除去多余的修飾試劑即可。采用本方法制備的酵母葡聚糖可以有效溶于水中，具有優良的免疫活性，本方法具有簡便、快速、高效、不使用有機溶劑和強酸、強堿試劑的特點。
文檔編號A61P37/02GK102838688SQ201210336178
公開日2012年12月26日 申請日期2012年9月12日 優先權日2012年9月12日
發明者史鋒, 李永富, 石紀奎 申請人:江南大學