專利名稱：：肝素復合物及其制備方法與應用的制作方法肝素復合物及其制備方法與應用
技術領域：
：本發明涉及一種肝素復合物及其制備方法與應用，尤其涉及一種共價接枝肝素復合物及其制備方法與應用。
背景技術：
：肝素(h印arin)是一種陰離子粘多糖，具有抗凝血抗血栓活性Kwon0H，NhoYCetal.Biocompatiblesurfacesbyimmobilizationofheparinondi咖ond-likecarbonfilmsdepositedonvarioussubstrates.Surf.InterfaceAnal.2000，29:386L低分子肝素(L麗H)是由肝素經降解得到低分子量的肝素片段或經分級法得到的低分子量肝素組分，相對分子質量范圍一般在30008000，臨床上主要用于預防和治療血栓栓塞性疾病。肝素共價接枝到材料上形成的復合物具有諸多優點，如可以達到肝素固定化的目的，有效防止肝素在用藥部位被血流帶走。同時，復合物具有生物相容性和抗凝血性。近年來已有大量的共價接枝肝素的復合物合成出來，如聚氨基甲酸酯-PEO-肝素，這些材料顯示了較好的物化特性。有報道肝素隨著大分子表面的聚乙烯氧化物(PE0)親水間隔臂的長度的增加，其抗凝活性而增加。但目前制備的肝素復合物安全性、穩定性和對蛋白藥物的載藥能力仍不夠理想。
發明內容本發明要解決的技術問題是針對現有肝素復合物的不足之處，提供一種肝素復合物，其作為藥物載體或藥用輔料具備更好穩定性、安全性和載藥能力。本發明要解決的另一個技術問題是要提供一種具備更好穩定性、耐壓性和載藥能力的肝素復合物的制備方法。本發明另一個目的是開發肝素與泊洛沙姆合成的新復合物在醫藥和生物學領域的應用。為解決上述技術問題，本發明采用了以下的技術方案—種肝素與泊洛沙姆形成的復合物具有以下通式Y-X-Y或Y-g-X-g-Y或X-Y或X-g-Y其中X為泊洛沙姆，g為間臂分子，Y為肝素，X、g、Y或者X、Y通過共價鍵結合。上述的泊洛沙姆為聚氧乙烯聚氧丙烯醚，S卩a-氫-"羥聚(氧乙烯)a-聚(氧丙烯)b-聚(氧乙烯)c嵌段共聚物，結構式為H0(CH2CH20)a(0CHCH3CH2)b(CH2CH20)c，在共聚物中，a和c為2150，b為1567。上述的肝素包括重組肝素、天然肝素、衍生肝素、肝素鹽、低分子量肝素及其鹽、能與泊洛沙姆及其衍生物的官能團反應的化學改性肝素和類肝素分子及其鹽類。上述的低分子肝素包括但不局限于低分子肝素鈉、低分子肝素鈣、依諾肝素，替地肝素。上述的間臂分子g是指任何用來連接肝素和泊洛沙姆的大分子或小分子結構，其中大分子為合成高聚物或生物高聚物，包括聚己內酯、聚乙二醇、多糖、蛋白質，小分子是指含有氨基和/或羧基官能團，能夠與肝素分子內的羧基或氨基反應的小分子，包括乙二胺?！N肝素復合物的制備方法，利用泊洛沙姆的末端羥基和肝素分子內的羧基或氨基的活性基團反應得到所述肝素復合物，該反應過程為泊洛沙姆或連有間臂分子的泊洛沙姆羥基末端羧酸化，而后與肝素的氨基反應；或者泊洛沙姆或連有間臂分子的泊洛沙姆羥基末端氨基化，而后與肝素的羧基反應?！N肝素復合物的應用，該肝素復合物作為藥用輔料或遞送載體應用。上述的該復合物作為藥用輔料是指上述的該復合物用來制備水溶液分散體，包括乳劑、脂質體、膠束、微粒；或作為長循環、溫度或ra敏感性的藥物載體材料應用。上述的該復合物作為遞送載體應用是指上述的該復合物可以作為與肝素相親的化學物質、酶或大分子蛋白，包括成纖維細胞生長因子的遞送載體。上述的該復合物形成的制劑或材料應用于口服、注射、經皮、粘膜給藥系統中或外科、植入手術中。具體實施方式泊洛沙姆(poloxamer)，商品名為pluronic，是白色或微黃色半透明蠟狀固體，用作表面活性劑、乳化劑、栓劑基質、賦形劑等。泊洛沙姆因有防止溶血作用，可以用于靜脈注射，對某些藥物可以起到助溶作用。利用泊洛沙姆和肝素直接或間接地共價結合，并作為載體材料制成相應的制劑，可以達到抗凝血、抗血栓和緩釋藥物的目的。本發明的肝素與泊洛沙姆形成的復合物具有以下通式Y-X-Y或Y-g-X-g-Y或X-Y或X-g-Y其中X為泊洛沙姆，g為間臂分子，Y為肝素，X、g、Y或者X、Y通過共價鍵結合。上述的泊洛沙姆為聚氧乙烯聚氧丙烯醚，S卩a-氫-"羥聚(氧乙烯)a-聚(氧丙烯)b-聚(氧乙烯)c嵌段共聚物，結構式為HO(CH2CH20)a(0CHCH3CH2)b(CH2CH20)c，在共聚物中，a和c為2150，b為1567。上述的肝素包括重組肝素、天然肝素、衍生肝素、肝素鹽、低分子量肝素及其鹽、能與泊洛沙姆及其衍生物的官能團反應的化學改性肝素和類肝素分子及其鹽類。上述的低分子肝素包括但不局限于低分子肝素鈉、低分子肝素鈣、依諾肝素，替地肝素。上述的間臂分子g是指任何用來連接肝素和泊洛沙姆的大分子或小分子結構，其中大分子為合成高聚物或生物高聚物，包括聚己內酯、聚乙二醇、多糖、蛋白質，小分子是指含有氨基和/或羧基官能團，能夠與肝素分子內的羧基或氨基反應的小分子，包括乙二胺。肝素接枝到泊洛沙姆形成復合物的制備方法是利用了泊洛沙姆的末端羥基和肝素分子內的羧基或氨基的活性基團。可以是泊洛沙姆或連有間臂分子的泊洛沙姆羥基末端羧酸化，而后與肝素的氨基反應；也可以是泊洛沙姆或連有間臂分子的泊洛沙姆羥基末端氨基化，而后與肝素的羧基反應。具體反應過程如下a.泊洛沙姆或連有間臂分子的泊洛沙姆羥基末端羧酸化，而后與肝素的氨基反應—定量的泊洛沙姆或連有間臂分子的泊洛沙姆、丁二酐、4-二甲基氨基吡啶、三乙胺，置于二氧六環中，攪拌反應過夜，所得反應物的末端為羧基。利用EDC/NHS方法，加入一定量的肝素，攪拌反應24h，然后透析3天，透析袋內溶液經過冷凍干燥得到肝素與泊洛沙姆形成的復合物凍干固體。b.泊洛沙姆或連有間臂分子的泊洛沙姆羥基末端氨基化，而后與肝素的羧基反應—定量的泊洛沙姆或連有間臂分子的泊洛沙姆在三乙胺催化下與乙二胺反應，得末端為氨基的產物，然后利用1-乙基-3，3-二甲基氨丙基碳化二亞胺(EDC)/N-羥基于二酰亞胺(NHS)方法與肝素的羧基進行反應，可得肝素與泊洛沙姆形成的復合物。上述的該復合物作為藥用輔料或遞送載體應用，亦在以抗凝血、抗血栓為目的醫學和生物學中應用。作為藥用輔料時，上述的該復合物用來制備水溶液分散體，包括乳劑、脂質體、膠束、微粒；或作為長循環、溫度或ra敏感性的藥物載體材料應用。上述的復合物結合與肝素相親的化學物質、酶或大分子蛋白，包括成纖維細胞生長因子，達到分離這些化學物質或蛋白的目的，亦可以作為運送載體與這些化學物質或蛋白制成緩釋制劑，達到緩慢釋放的目的。上述的該復合物作為涂層劑應用于人造器官或醫療器械的表面改性。上述的該復合物形成的制劑或材料應用于口服、注射、經皮、粘膜給藥系統或外科、植入手術中。以下從幾個具體實施例進一步說明本發明。實施例一、低分子肝素_泊洛沙姆的合成與其體外抗凝血實驗1-1.低分子肝素_泊洛沙姆_低分子肝素的合成稱取泊洛沙姆407(相對分子量M=12000，其中a=c=101，b=56)12g，于一圓底燒瓶中，加入2mmo1的丁二酐、2mmo1的4-二甲基氨基吡啶及0.55ml三乙胺，并溶解于200ml二氧六環中，攪拌反應24h得末端為羧基的泊洛沙姆，以其為反應物，利用1-乙基-3，3-二甲基氨丙基碳化二亞胺(EDC)/N-羥基于二酰亞胺(NHS)方法，加入10g的低分子肝素鈉，攪拌反應24h。反應產物經透析袋透析3天，所得產物通過冷凍干燥得到固體粉末，即為低分子肝素_泊洛沙姆_低分子肝素。1-2.低分子肝素_泊洛沙姆_低分子肝素的體外抗凝血實驗運用下面的玻片法，測定不同濃度低分子肝素_泊洛沙姆_低分子肝素溶液的體外抗凝血時間，同法操作以0.lg/ml低分子肝素、生理鹽水分別為陽性對照和空白對照。含有0.66g/ml、0.44g/ml、0.22g/ml的低分子肝素_泊洛沙姆_低分子肝素溶液分別為高、中、低三個濃度分組。玻片法分別用含有高、中、低濃度的低分子肝素_泊洛沙姆_低分子肝素溶液以及低分子肝素和生理鹽水浸泡干凈的載玻片，取出晾干。用毛細玻管將Wistar大鼠做眼眶內眥取血，迅速滴血于載玻片上，血滴直徑約510mm，立即開始記時，此后每隔30s用干燥潔凈針頭挑動血液1次至針頭能挑起纖維蛋白絲為止，即為凝血時間。實驗結果如下5<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>對照空白組和陽性組結果，表明低分子肝素_泊洛沙姆_低分子肝素復合物保留了肝素的抗凝血效果。實施例二、低分子肝素_泊洛沙姆復合物膠束的制備取上述制備的低分子肝素_泊洛沙姆_低分子肝素50mg，分散于20ml蒸餾水中，在37t:下超聲處理2min，形成膠束混懸液，然后冷凍干燥，制成固體凍干品，通過實施例一的體外抗凝血實驗觀察，低分子肝素-泊洛沙姆復合物膠束具有抗凝血作用，可以單用或作為藥用輔料應用于溶栓制劑中。實施例三依諾肝素-聚己內酯-泊洛沙姆的合成與酸性成纖維細胞生長因子(aFGF)緩釋脂質體的制備3-1.依諾肝素_聚己內酯_泊洛沙姆_聚己內酯_依諾肝素的合成泊洛沙姆188(M=8350，a=c=80，b=27)2,1與3ml己內酯在Sn-Oct為催化劑、Ar氣保護下真空狀態進行聚合，攪拌24h后停止反應，反應產物以10ml氯仿溶解，加入10倍量體積的乙醚沉淀，過濾，重復兩次以純化所得產物。將產物在4mmo1丁二酐(SA)、2mmo14-二甲基氨基吡啶(DMAP)、0.55ml三乙胺(TEA)，30ml二氧六環為溶劑下攪拌反應24小時，以10ml氯仿溶解，加入10倍量體積的乙醚沉淀，過濾，重復兩次以純化所得產物。利用1-乙基-3，3-二甲基氨丙基碳化二亞胺(EDC)/N-羥基于二酰亞胺(NHS)方法，所得產物與依諾肝素反應，攪拌反應24h，反應最終產物經透析袋透析3天，最后透析袋內溶液通過冷凍干燥得到固體粉末，即依諾肝素_聚己內酯_泊洛沙姆_聚己內酯_依諾肝素。3-2.載aFGF緩釋脂質體的制備取一定量上述制備的依諾肝素_聚己內酯_泊洛沙姆_聚己內酯_依諾肝素，卵磷脂、膽固醇按2:10:l溶解在氯仿中，攪勻，真空干燥，將所得粉末與10ml左右80IU/ml的aFGF水溶液混合，加入1.2mg聚山梨酯80，50rmin-l攪拌2h，制成載有aFGF的脂質體。載有aFGF的脂質體通過公式包封率WX二(Ct-CL)/CtX100%計算，包封率平均值達65%，體外釋放實驗表明載有aFGF的脂質體，沒有突釋現象，12小時內的釋放量要求達到90%，具有較好的緩釋效果。實施例四、替地肝素_乙二胺_泊洛沙姆的合成及其作為藥用輔料的應用1、替地肝素-乙二胺-泊洛沙姆的合成泊洛沙姆338(M=15000，a=c=141，b=44)15g，在100ml二氯甲烷為溶劑，0.6ml三乙胺做催化劑作用下與2mmo1的Cl6'-0^j^N02室溫下反應4h，然后，加入2.5mmo1乙二胺，繼續反應12h，反應的產物為末端氨基，利用1-乙基_3，3-二甲基氨丙基碳化二亞胺(EDC)/N-羥基于二酰亞胺(NHS)方法，將其與10g依諾肝素的羧基反應，攪拌反應24h，反應最終產物經透析袋透析3天，冷凍干燥，即得形成新材料為替地肝素_乙二胺-泊洛沙姆。2、含替地肝素-乙二胺-泊洛沙姆的維生素E乳膏的制備2.1處方維生素E20g、十八醇6g、單甘酯6g、液體石蠟3g、甘油4g、十二烷基硫酸鈉0.7g、尿囊素0.5g、低分子肝素-泊洛沙姆(57IU/mg)10g、氮酮1.Og、尼鉑金乙脂0.05g，蒸餾水50ml，制備乳膏總量100g2.2制備方法取處方量的十八醇、單甘酯、液體石蠟、尼鉑金乙脂加熱至7(TC融化后為油相備用；取甘油、十二烷基硫酸鈉、尿囊素加入到蒸餾水中，加熱至7(TC溶解后為水相，過濾，將油相加入到水相中，混合攪拌，待溫度降至55t:以下時，加入低分子肝素-泊洛沙姆、氮酮、維生素E，繼續攪拌至均勻，得到含低分子肝素-泊洛沙姆的維生素E乳膏。此制劑中，低分子肝素_泊洛沙姆作為新型藥用輔料，既具有表面活性劑的作用，又起到固定緩釋肝素的作用。在上述實施例中，僅對本發明進行了示范性描述，但是本領域技術人員在閱讀本專利申請后可以在不脫離本發明的精神和范圍的情況下對本發明進行各種修改。權利要求一種肝素復合物，其特征在于具有以下通式Y-X-Y或Y-g-X-g-Y或X-Y或X-g-Y；其中X為泊洛沙姆，g為間臂分子，Y為肝素，X、g、Y或者X、Y通過共價鍵結合。2.根據權利要求1所述的肝素復合物，其特征在于所述的泊洛沙姆為聚氧乙烯聚氧丙烯醚，g卩a-氫-"羥聚(氧乙烯)a-聚(氧丙烯)b-聚(氧乙烯)c嵌段共聚物，結構式為H0(CH2CH20)a(0CHCH3CH2)b(CH2CH20)c，在共聚物中，a和c為2150，b為1567。3.根據權利要求1所述的肝素復合物，其特征在于所述的肝素包括重組肝素、天然肝素、衍生肝素、肝素鹽、低分子量肝素及其鹽、能與泊洛沙姆及其衍生物的官能團反應的化學改性肝素和類肝素分子及其鹽類。4.根據權利要求3所述的肝素復合物，其特征在于所述的低分子肝素包括低分子肝素鈉、低分子肝素鈣、依諾肝素，替地肝素。5.根據權利要求1所述的肝素復合物，其特征在于所述的間臂分子g是指任何用來連接肝素和泊洛沙姆的大分子或小分子結構，其中大分子為合成高聚物或生物高聚物，包括聚己內酯、聚乙二醇、多糖、蛋白質，小分子是指含有氨基和/或羧基官能團，能夠與肝素分子內的羧基或氨基反應的小分子，包括乙二胺。6.根據權利要求1至5任一項所述的肝素復合物的制備方法，其特征在于利用泊洛沙姆的末端羥基和肝素分子內的羧基或氨基的活性基團反應得到所述肝素復合物，該反應過程為泊洛沙姆或連有間臂分子的泊洛沙姆羥基末端羧酸化，而后與肝素的氨基反應；或者泊洛沙姆或連有間臂分子的泊洛沙姆羥基末端氨基化，而后與肝素的羧基反應。7.根據權利要求1至5任一項所述的肝素復合物的應用，其特征在于該肝素復合物作為藥用輔料或遞送載體應用。8.根據權利要求7所述的肝素復合物的應用，其特征在于該肝素復合物作為藥用輔料的應用包括該復合物用來制備水溶液分散體，包括乳劑、脂質體、膠束、微粒；或作為長循環、溫度或ra敏感性的藥物載體材料應用。9.如權利要求7所述的肝素復合物的應用，其特征在于該肝素復合物可以作為與肝素相親的化學物質、酶或大分子蛋白的遞送載體。10.根據權利要求89所述的肝素復合物的應用，其特征在于該肝素復合物形成的制劑或材料應用于口服、注射、經皮、粘膜給藥系統中或外科、植入手術中。全文摘要本發明涉及一種肝素復合物，該肝素復合物具有以下通式Y-X-Y或Y-g-X-g-Y或X-Y或X-g-Y，其中X為泊洛沙姆，g為間臂分子，Y為肝素，X、g、Y或者X、Y通過共價鍵結合。本發明還提供該肝素復合物的制備方法。該肝素復合物可作為藥用輔料或運送載體應用。文檔編號A61K9/107GK101766819SQ20091010493公開日2010年7月7日申請日期2008年12月31日優先權日2008年12月31日發明者周志彩,唐琴琴,張翼,徐艷艷,李校堃,田吉來,趙應征,靳卓,高慧升,魯翠濤申請人:溫州醫學院