專利名稱：包括生長激素和包括至少一種堿性氨基酸殘基和至少一種酸性氨基酸殘基肽的穩定的藥 ...的制作方法
技術領域：
本發明涉及包括生長激素的穩定的藥物制劑，制備這種制劑的方法，用于穩定生長激素制劑的包括至少一種堿性氨基酸殘基和至少一種酸性氨基酸殘基肽的用途和用于治療易受生長激素影響的疾病的方法。
背景技術：
人和常見家養動物的生長激素是垂體腺前頁合成和分泌的約191個氨基酸的蛋白。人類生長激素由191個氨基酸所組成。
生長激素是涉及不僅身體生長的調節，而且蛋白、碳水化合物和脂類代謝調節的一種關鍵性激素。生長激素的主要作用是促進生長。
生長激素影響的器官系統包括骨骼、結締組織、肌肉和內臟如肝臟、腸及腎臟。
直到現在的導致如人類生長激素(hGH)和Met-hGH以工業規模生產的重組技術和生長激素基因的克隆開發以前，人類生長激素僅可從人類尸體的垂體腺中提取而獲得。生長激素很有限的供應限制其用于童年和青春期侏儒癥治療中的縱向生長促進中，盡管已提議其特別用于治療矮的身材(由于生長激素缺乏，正常的矮身材及唐氏綜合癥)、成年人生長激素缺乏、不育、燒傷治療、傷口愈合、營養不良、骨頭接合、骨質疏松癥、迷散性胃出血以及偽關節(psendoarthrosis)。
此外，生長激素已被提議用于增加家養動物的生長速度或降低人類消費的宰殺動物的脂肪比例。
生長激素的藥物制劑趨于不穩定。產生了降解產物如脫酰胺或磺化(sulfoxydated)產物以及二聚體或多聚體形式-尤其在生長激素溶液中。
hGH顯著的降解反應為1)通過直接的水解的脫酰胺作用或通過環狀的琥珀酰亞胺中間體以形成不同量的L-asp-hGH、L-iso-asp-hGH、D-asp-hGH和D-iso-asp-hGH(參考1-3)，和2)位置14和位置125甲硫氨酸殘基的氧化作用(參考4-9)。在凍干狀態及溶液中hGH的主要降解產物為脫酰胺的hGH。
脫酰胺作用尤其發生于位置149的天冬酰胺并以較少的程度發生于位置152的天冬酰胺。
位置14和125的hGH也很容易被氧化，尤其在溶液中(4-8)。
hGH在溶液中形成磺化物(sulfoxides)的氧化一般是由于溶于制劑中的氧氣。氧氣在蒸餾水中的溶解性約200μM(9)。由于在制劑中包括4IU/ml的hGH的濃度相應于60nm的hGH為1.3mg/ml，故在正常的貯存條件下，氧氣將以超過約3000倍用于hGH氧化的化學計量的量存在。在封閉(taping)和包裝制劑以前通過去除緩沖液中的氣體以試圖解決此問題是不切合實際的。
目前，認為這些脫酰胺形式和氧化形式的hGH應該具有無毒或沒有改變的生物學活性或受體結合特性，但有跡象表明磺化物的構型穩定性較天然hGH降低。
為了開發包括hGH的穩定、溶解的制劑，知道脫酰胺和磺化物形成速度以及控制反應的方法是至關重要的。
降解的動力學依賴于hGH配方中的溫度、pH和不同的添加劑或佐劑。
由于不穩定性，為了最大限度地減少降解，目前，生長激素被凍干并于4℃以凍干形式貯存直至重新調配使用。
目前，包括hGH的凍干藥物制劑由病人重新調配且然后在達14天的使用期內于4℃作為溶液貯存，這其中將發生部分降解。
此外，凍干生長激素重新調配的方法讓病人為難。因此，目前優選在使用前盡可能晚地重新調配生長激素并以凍干狀態貯存和運輸制劑。從生產商到用藥的環節適宜于在控制的低溫如4℃處理制劑，在此溫度下允許達2年的長時間保存壽命(shelflife)。
然而，用于自我療法的筆式系統(pen systems for self-medication)的擴展使用和使用的擴展領域要求在終末使用者不可總得到“足夠”冷卻的條件下穩定足夠長時間的制劑。
優選地，對于終末使用者，制劑應以凍干狀態穩定約一種月并且在盒式使用的試用期(the intended period of use of a cartridge)在筆式裝置(in a pen device)以重新調配的狀態額外穩定一種月。
因此，需要更為穩定的生長激素制劑，其在凍干狀態在相對較高的溫度時穩定一段時間并且在溶液中相對較高的溫度時額外穩定一段使用期。當將生長激素的施用從診所轉移到不可得到上述最佳貯存的待治療個體家中時這種穩定作用是非常重要的。
此外，為了利于病人進行處理，生長激素施用方式換成使用筆式裝置要求包括生長激素的穩定的溶解制劑。可制備包括生長激素穩定的溶解制劑，病人易于使用的適于筆式裝置的小盒形式(in the form ofcartridges fitting into the pendevice)，然后病人可避免重新調配制劑并且，因此，將不必具有凍干的制劑，用于重新調配的合適賦形劑(vehicle)以及用于制劑無菌調配的必需技巧和無菌設備。
為了安全的原因，避免剛好制劑使用前重新調配凍干的制劑也將是必需的。
此外，避免生長激素制劑制備中的凍干步驟也將是個優勢。凍干是一種耗時且昂貴的方法并且由于冷凍干燥器有限的容量也經常是制備中的“瓶頸”。
因此，為了使溶解hGH的制劑在保存期和達一種月的使用期穩定需要降低降解過程的速度。
穩定hGH的以前嘗試在防止二聚體形成中沒有完全成功。Becker，G.W.，生物技術和應用生化9，478(1987)中記錄了與二聚體形成有關的問題。
國際專利公開No.WO89/09614和澳大利亞專利申請No.30771/89公布了一種含有人類生長激素甘氨酸和甘露醇的穩定藥物制劑。這種制劑在凍干狀態的正常處理和貯存過程中以及重新調配后的使用期內顯現出提高的穩定性。
公開的歐洲專利申請No.303 746公開了動物生長激素可以不同的穩定劑穩定以導致不溶物減少的形成和水環境中可溶性活性的保存，這種穩定劑包括某些多元醇、氨基酸、在生理pH時具有帶電側基的氨基酸聚合物和膽堿鹽。多元醇選自非還原性糖、糖醇、糖酸、季戊四醇、乳糖、水溶性葡聚糖和Ficoll；氨基酸選自甘氨酸、肌氨酸、賴氨酸或其鹽、絲氨酸、精氨酸或其鹽、甜菜堿、N，N-二甲基-甘氨酸、天冬氨酸或其鹽、谷氨酸或其鹽；在生理pH時具有帶電側基的氨基酸聚合物選自多聚賴氨酸、多聚天冬氨酸、多聚谷氨酸、多聚精氨酸、多聚組氨酸、多聚烏氨酸及其鹽；且膽堿衍生物選自膽堿氯化物、膽堿檸檬酸二氫鹽、膽堿酒石酸氫鹽、膽堿碳酸氫鹽、三膽堿檸檬酸鹽、膽堿抗壞血酸鹽、膽堿硼酸鹽、膽堿葡萄糖酸鹽、膽堿磷酸鹽、二(膽堿)硫酸鹽和膽堿mucate。
美國專利說明No.4,917,685公開了一種設計待輸入(implanted)的包括用與EP303746中提到的相同穩定劑穩定的生長激素的運載系統。
公開的歐洲專利申請No.374,120公開了一種包括hGH和具有三個羥基多元醇的穩定制劑。提到甘油和三(羥甲基)氨基甲烷。此外，公開了組氨酸鹽酸鹽與多元醇一起作為緩沖液的存在。
國際專利公開No.WO93/12811公開了以凍干粉形式或包括天冬酰胺水溶液形式的生長激素穩定制劑。
國際專利公開No.WO93/12812公開了以凍干粉形式或包括組氨酸水溶液形式的生長激素穩定制劑。在這種制劑中脫酰胺作用與相應的包括磷酸鹽緩沖液生長激素的制劑相比降低了25-30％。
國際專利公開No.WO93/19776公開了包括檸檬酸鹽作為緩沖液的包括生長激素的蛋白制劑，其較包括磷酸鹽緩沖液的制劑更為穩定。該制劑也可包括氨基酸如甘氨酸和丙氨酸和/或甘露醇或其它糖醇和/或甘油和/或其它碳水化合物及任選包括防腐劑如苯甲醇。
國際專利公開No.WO94/03198公開了一種穩定的水溶液，其中含有人類生長激素、緩沖液、非離子性表面活性劑，和任選含有中性鹽、甘露醇、或防腐劑。
發明簡述現已令人驚奇地發現包括至少一種堿性氨基酸殘基和至少一種酸性氨基酸殘基的肽作為添加劑的人類生長激素制劑對脫酰胺作用和氧化作用顯示出很高的穩定性。該產品的穩定性允許以凍干狀態或以溶解或重新溶解制劑的形式對其貯存和運輸。
根據本發明待用的包括至少一種堿性氨基酸殘基和至少一種酸性氨基酸殘基的肽可以是包括10到20個氨基酸殘基的肽，優選包括3到10個氨基酸殘基，更優選包括3到6個氨基酸殘基如3或4個氨基酸殘基。根據本發明的一種方面，較短肽的堿性和酸性氨基酸殘基由1個或2個氨基酸殘基所分離。
本發明的藥物制劑可配制用于任何合適方式的施用，如通過腸道外或口腔施用或施用于粘膜，如鼻腔施用。藥物制劑可以包括在小瓶(vial)或小室(cartridge)或任何其它合適的容器如預先填滿的注射器或筆式裝置(pen device)中的劑量形式存在。
因此，本發明的制劑可以是凍干粉的形式，該凍干粉后來用常規的賦形劑如蒸餾水或注射用水重新調配，或者是包括生長激素的溶液形式。這種賦形劑可包括常規的防腐劑如苯甲醇和酚類(phenoles)，如苯酚或間-甲酚或其混合物。
本發明的優選實施方案是人類生長激素的藥物制劑形式，其中包括至少一種堿性氨基酸殘基和至少一種酸性氨基酸殘基的肽并進一步包括以生長激素緩沖水溶液形式的載體。這種制劑是現成的(ready-to-use)形式并且可作為水溶液貯存和運輸而無任何重要的降解。
待用于生長激素溶液的緩沖液可以是，如，組氨酸、檸檬酸鹽、酒石酸鹽或磷酸鹽緩沖液。
為了穩定性的原因，溶液pH優選調至約2到8之間，優選從約5到7，更優選從約6.0到7.0，甚至更為優選從約6.0到6.8。
為了獲得穩定作用優選加入包括至少一種堿性氨基酸殘基和至少一種酸性氨基酸殘基的肽，其量達100mM，更為優選其量約1-10mM，優選約2-6mM，最優選約3-5mM。
此外，為了便于使用前重新調配制劑時對其處理，如，凍干和凍干制劑快速而完全的溶解，本發明的藥物制劑可包括用于調整增強性(tonicity)的鹽和任選地包括賦形劑。
賦形劑可選自二糖如乳糖繭密糖二霉菌酸酯(trehalose)和蔗糖，糖醇如山梨醇或甘露醇，多糖如作為葡聚糖產品的商品化聚合物如葡聚糖40，葡聚糖70或葡聚糖75以及Ficoll和多價醇如聚乙二醇或聚乙烯醇或這些物質中2種或更多種的組合。
本發明的進一步方面涉及制備包括生長激素和包括至少一種堿性氨基酸殘基和至少一種酸性氨基酸殘基肽的藥物制劑的方法，其中的生長激素通過以下方法溶于包括至少一種堿性氨基酸殘基和至少一種酸性氨基酸殘基肽的溶液中，包括溶解包括至少一種堿性氨基酸殘基和至少一種酸性氨基酸殘基的肽于任選含有苯甲醇的去離子水中，加入生長激素并且任選調節pH至約2到約8。
pH可通過加入酸而調節，該酸對生長激素無副作用，優選為生理上可接受的酸如無機酸，如鹽酸、硫酸或硝酸或有機酸如醋酸。
在本發明方法的實施方案中，任選加入鹽和賦形劑，之后將溶液裝入容器并凍干。
本發明的另一方面涉及包括至少一種堿性氨基酸殘基和至少一種酸性氨基酸殘基肽用于生長激素穩定制劑配制的用途。
本發明的另一方面涉及用于治療易受生長激素影響的疾病的方法，包括施用包括生長激素和包括至少一種堿性氨基酸殘基和至少一種酸性氨基酸殘基肽的制劑。
在本文中“生長激素”可以是任何來源的生長激素，如鳥、牛、馬、人類、羊、豬、鮭魚、真鱒(trout)或金槍魚的生長激素，優選為牛、人類或豬的生長激素，人類生長激素最為優選。用于本發明的生長激素可以是分離自自然來源的，如通過以常規方式提取垂體腺的天然生長激素，或者是通過重組技術，如E.B.Jensen和S.Carlsen在生物技術和生物工程。36，1-11(1990)中所描述而制備的生長激素。“生長激素”也可是截短形式的生長激素，其中的一種或更多個氨基酸殘基被刪除；其類似物，只要替代不具有任何副作用如抗原性或降低的功能，天然分子中的一種或更多個氨基酸殘基被別的氨基酸殘基，優選天然氨基酸殘基所替代；或者其衍生物，如具有N-或者C-末端延伸如Met-hGH。優選的生長激素為hGH。
術語生長激素“劑量”指在施用方案(regimen)中產生治療效應的量。制備其制劑，根據現成的制劑計算，其中含有至少約0.1mg/ml的hGH量，優選向上約10mg/ml的hGH量，優選從約1mg/ml到約40mg/ml，更優選從約1mg/ml至約40mg/ml，更優選從約1mg/ml到約25mg/ml，如從1mg/ml到約5mg/ml的hGH量。例如，對于使用這些施用組合物至患垂體機能不良侏儒癥的人類，這些制劑含有從約0.1mg/ml到約10mg/ml，相應于用于試圖治療(intended treatment)的當前期望的劑量方案(dosage regimen)。濃度范圍對本發明并不至關重要且可通過監督施用的內科醫生加以改變。
包括至少一種堿性氨基酸殘基和至少一種酸性氨基酸殘基的待用于本發明的肽優選包括自然產生的α氨基酸殘基。氨基酸可以為1個或d個氨基酸或其混合物。
“酸性氨基酸殘基”為如谷氨酸或天冬氨酸，且“堿性氨基酸殘基”為如賴氨酸或精氨酸。
在本文中當制劑較包括磷酸緩沖液的常規制劑更為穩定并優選與包括組氨酸作為穩定劑的相應配方一樣穩定，且其中的hGH脫酰胺作用與WO93/12812中公開的磷酸緩沖液相比減少約20％時，“高度穩定性”便獲得。
用于本發明方法的溶劑可以是水，醇如乙醇，n-丙醇或異丙醇、丁醇或其混合物。溶劑可以包括防腐劑如苯甲醇和酚類，如苯酚或m-甲酚或其混合物。
發明詳述本發明在下面的說明本發明的實施例中更為詳細地加以解釋。它們沒有被認為是限制了附屬權利要求所定義的本發明范圍。實驗部分實施例脫酰胺作用的減少在5mM包括至少一種堿性氨基酸殘基和至少一種酸性氨基酸殘基肽(Lys-Gly-Asp-Ser)的存在時于37℃測定pH6.8的包括4mg/ml hGH的hGH制劑的脫酰胺作用速度。
通過溶解8mg hGH于2ml 10mM的Lys-Gly-Asp-Ser或組氨酸溶液中而制備hGH制劑。因此，加入2ml 3.0％的苯甲醇以得到4mg/mlhGH、5mM Lys-Gly-Asp-Ser或組氨酸、1.5％苯甲醇、pH6-8(加入HCl或NaOH調節)的最終制劑。
下表中所述的hGH制劑于37℃貯存7天，并通過IE-HPLC分析脫酰胺的hGH含量。結果顯示于下表。
表
*偏離6.8每0.1個pH單位校正1％的脫酰胺(desamido)在起始物質中脫酰胺hGH的含量為2.0％從上表，似乎通過加入Lys-Gly-Asp-Ser，hGH的脫酰胺作用降低到至少與通過加入組氨酸而獲得的相同水平(與磷酸緩沖液相比25-30％，參考上面的WO93/12812)。
上面的結果表明通過加入達100mM，優選1-10mM，更優選2-6mM且最優選約3-5mM低濃度的Lys-Gly-Asp-Ser，脫酰胺作用的速度降低至很大的程度。因此，通過以Lys-Gly-Asp-Ser替代磷酸緩沖液，脫酰胺作用的速度可降低超過30％。
作為防腐劑的苯甲醇的使用似乎對脫酰胺速度沒有影響。
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權利要求
1.包括生長激素和包括至少一種堿性氨基酸殘基和至少一種酸性氨基酸殘基肽的藥物制劑。
2.權利要求1的藥物制劑，進一步包括以生長激素緩沖水溶液形式的載體，生長激素中含有包括至少一種堿性氨基酸殘基和至少一種酸性氨基酸殘基的肽。
3.權利要求1或2的藥物制劑，其中的pH調至從約2到約8之間的值。
4.以前權利要求中任一權利要求的藥物制劑，其中包括至少一種堿性氨基酸殘基和至少一種酸性氨基酸殘基的肽的濃度達到約100mM。
5.以前權利要求中任一權利要求的藥物制劑，進一步包括鹽和/或糖類。
6.權利要求1-5中任一權利要求的藥物制劑，其中的生長激素為hGH。
7.制備包括生長激素和包括至少一種堿性氨基酸殘基和至少一種酸性氨基酸殘基肽的藥物制劑的方法，該方法包括(a)將肽溶解于任選含有防腐劑的去離子水中以形成溶液，和(b)向該溶液中加入生長激素，和(c)任選調節pH至pH2到約pH8。
8.根據權利要求7的方法，任選向其中加入鹽和/或賦形劑，之后將溶液裝入容器中并凍干。
9.包括至少一種堿性氨基酸殘基和至少一種酸性氨基酸殘基肽用于制備穩定的生長激素制劑的用途。
10.治療易受生長激素影響的疾病的方法，包括施用權利要求1-6中任何一個權利要求的制劑。
全文摘要
包括生長激素和包括至少一種堿性氨基酸殘基和至少一種酸性氨基酸殘基的肽作為添加劑或緩沖物質的藥物制劑對脫酰胺作用,氧化作用和肽鍵的斷裂顯示出很高的穩定性。該產品的穩定性允許以凍干的狀態或在周圍溫度中以溶解或重新溶解制劑的形式貯存及其運輸。
文檔編號A61P1/16GK1190896SQ9619546
公開日1998年8月19日 申請日期1996年6月28日 優先權日1995年7月12日
發明者T·克里斯坦森, P·巴爾史密特, H·H·索里恩森, O·H·奧爾森, L·希姆 申請人:諾沃挪第克公司