專利名稱：克服b細胞免疫耐受的免疫微球及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及免疫領域，特別涉及一種克服B細胞免疫耐受的免疫微球及其應用。
背景技術：
抗原(Ag)是指能與T、B淋巴細胞的TCR或BCR結合，促使其增殖、分化，產 生抗體或致敏淋巴細胞，進而發揮免疫效應的物質。抗原的分類方法很多，根據誘生抗 體時需否Th細胞參與，可分為胸腺依賴性抗原(TD-Ag)和胸腺非依賴性抗原(TI-Ag)。 絕大多數蛋白質抗原，如病原微生物、血細胞、血清蛋白等均屬TD-Ag。胸腺依賴性抗 原誘導的抗體產生過程需要T細胞的參與。抗體產生的指令來自兩種信號抗原與B細 胞表面抗原受體結合和輔助性T淋巴細胞(Th)的輔助刺激信號。抗原蛋白表位與B細胞膜受體結合并發生內化，是第一信號。B細胞吞噬免疫 微球后在B細胞內體(endosome)或溶酶體(Iysome)中釋放抗原并被蛋白酶水解，其中合 適的片斷與細胞MHCII結合提呈給Th細胞。實現Th細胞活化并釋放細胞因子作為第二 信號促使B細胞轉化成分泌抗體的漿細胞。接種疫苗是人類抵御和控制傳染性疾病的有效手段之一。傳統意義上的疫苗主 要是預防性疫苗，其應用對象是健康群體的易感動物及人群，其疫苗成分一般均為微生 物保護性抗原，可在健康肌體中激活特異性免疫應答，產生特異性抗體和細胞毒T淋巴 細胞(CTL)，從而獲得對該病原體的免疫預防能力，但對已發病的個體不能產生有效的 免疫應答。治療性疫苗(Therapeutic Vaccine)是近年建立和發展起來的免疫治療新概念，是
指能夠打破慢性感染者體內免疫耐受，重建或增強免疫應答的疫苗。治療性疫苗能在已 患病個體誘導特異性免疫應答，消除病原體或異常細胞，使疾病得以治療，是抗病毒、 抗腫瘤的新治療手段。腫瘤是治療疫苗重點研究領域。用于制備疫苗的抗原有生長因子(EGF、TGF、 VEGF)及相應受體(EGFR、Her2、VEGFR)腫瘤相關抗原CEA、MUCl等用于實體腫 瘤治療。CD20用于B細胞淋巴病的疫苗。Idiotype是另一類用于B細胞和T細胞淋巴 細胞白血病。默克制藥公司目前正對一種用于非小細胞肺癌(最常見的肺癌種類)治療的疫苗 進行第三期臨床試驗，試驗計劃于2010年結束。該疫苗被設計用于誘發癌細胞表面的 MUCl分子產生一種免疫反應。1300名參與此項試驗的患者遍布全球，其中包括巴西、 中國、印度和墨西哥這些發展中國家。這一大范圍的受試者征集反映肺癌是一個全球性 的問題。全球首個癌癥治療性EGF疫苗在古巴獲準上市用于肺癌治療。瑞士醫藥集團塞托斯生物技術公司和英國Protherics公司兩家都在對高血壓疫苗 進行二期臨床試驗。是以血管緊張素為疫苗，產生封閉抗體。法國Neovacs公司Zagury等將人腫瘤壞死因子連接一種免疫促進劑——鑰孔蟲戚血藍蛋白(KLH)。用此復合物免疫接種轉基因小鼠，可完全保護小鼠免于重復注射腫 瘤壞死因子的傷害，用于類風濕疾病治療。擬用以代替昂貴的單克隆抗體和受體治療用 途。針對IgE的疫苗用于過敏性疾病、可能突現技術突破。TGF用于肝硬化及動脈高壓 研究。治療性疫苗極有可能復制甚至超越單克隆抗體過去10年的輝煌。以上的疫苗均以人體內自身蛋白為抗原，產生抗體為目標，通過中和反應封閉 特定分子的功能，或通過抗體的ADCC效應和補體殺傷效應實現治療目的由上可知，目前的治療性疫苗所采用的抗原通常選用人體或者動物的自身蛋 白，或稱內源性蛋白。內源性蛋白不能誘導動物或人產生高滴度抗體。稱之謂B細胞免疫耐受。實際上但是針對自身蛋白反應的B細胞還是會少量產生。在二級淋巴細胞組織 中因體細胞突變機制使B細胞V區基因突變。不能產生能針對自身蛋白抗體的機理在于 輔助T細胞免疫耐受。目前認為維持體內自身免疫耐受狀態的主要機制是在中樞免疫器官發生的T細 胞克隆清除，在外周中誘導自身潛能細胞進入免疫無能(anergy)狀態，及部分淋巴細胞 對自身蛋白的免疫忽視(ignorance)。內源性蛋白的表位可與B細胞結合，但不能誘導B 細胞產生抗體現有的技術是與外源性強抗原蛋白，免疫學上稱之謂免疫載體(immunocarrier) 的蛋白化學偶聯，引入外源性蛋白用于活化Th細胞。經載體蛋白活化Th細胞，才可誘 導B細胞產生抗體。在免疫應答中，B細胞識別內源性蛋白抗原表位，并提呈載體蛋白 表位給CD4+Th細胞，Th細胞識別載體蛋白表位，這樣載體就可把特異T-B細胞連接起 來(T-B橋聯)，T細胞才能激活B細胞。除了將內源性蛋白與免疫載體(immonocarrier)蛋白化學交聯方法，還用基因工 程技術構建含有免疫載體的融合蛋白作為異源分子。由此帶來了新的問題由于針對內源蛋白的B細胞在發育過程中克隆清除，與 外源載體蛋白表位結合的B細胞的豐度比與內源性蛋白表位結合的B細胞的豐度高幾個 數量級，從而存在交聯蛋白(或融合蛋白)分子內蛋白表位免疫競爭的問題。當疫苗進 入人體或動物體內，外源載體蛋白表位具有競爭優勢，B細胞受體有更高機率結合外源 載體蛋白表位并吞噬，產生針對外源載體蛋白的高滴度抗體。而內源性蛋白的相應抗體 受抑制，只能產生低滴度抗體，很難實現臨床治療價值。本發明與文獻中報道的免疫微球區別在于已有的免疫微球是將抗原吸附或化 學交聯于微球表面或將抗原包裹于微球內部。功能是緩釋作用或促進巨噬細胞吞噬。不 能起到克服B細胞免疫耐受，也不適用于內源性蛋白。

發明內容
為了解決上述問題，本發明提供一種的免疫微球，從而克服現有技術中化學交 聯蛋白或融合蛋白分子內表位的免疫競爭問題。一種克服B細胞免疫耐受的免疫微球，其包括微球介質，所述微球介質外部包 覆有疫苗抗原，所述微球介質內部包裹有用于活化T細胞的免疫載體蛋白。所述疫苗抗原的B細胞表位位于所述免疫微球的表面，所述免疫載體蛋白的T細胞表位位于所述免疫微球的內部，從而實現B細胞表位與T細胞表位的物理隔離。所述的免疫載體蛋白選自嘁血蛋白、牛血清白蛋白、卵白蛋白、基因工程表 達的破傷風病毒蛋白片斷、乙肝病毒殼蛋白、腦膜炎球菌蛋白、HIV外殼蛋白、感冒病 毒蛋白。所述的疫苗抗原選自表皮生長因子、血管生長因子、血管生長因子受體、 IgE,表皮生長因子受體EGFR及突變體、表皮生長因子受體腫瘤壞死因子、轉化生長因 子血管緊張素、CD20。所述微球介質選自海藻酸鈣、聚乳酸、聚乳酸-乙醇酸、瓊脂糖、葡聚糖。所述疫苗抗原通過常規化學方法與所述微球介質偶聯。利用雙功能交聯試劑實現氨基-氨基、羧基-氨基、氨基-锍基的偶聯。利用戊二醛試劑實現氨基與氨基的偶聯。所述的克服B細胞免疫耐受的免疫微球在疫苗制備上的應用。所述的克服B細胞免疫耐受的免疫微球在免疫佐劑上的應用。通過上述技術方案，本發明提供的免疫微球通過抗原與B細受體結全被B細胞 吞噬，載體蛋白在細胞內釋放、降解；并通過B細胞MHCII提呈給Th細胞，激活Th細 胞釋放細胞因子，從而促使B細胞活化、增殖；經過親和力成熟過程產生高滴度抗體。 通過將抗原蛋白及免疫載體蛋白分置于微球表面及內部，避免了抗原蛋白表位與Th細胞 活化表位同B細胞受體的競爭。根據本發明的一個優選實施例，提供一種表皮生長因子(EGF)構建的微球。EGF疫苗，這種具有靶向性質的新藥早已引起世界各國醫藥界的關注。該疫苗 由古巴分子免疫學中心研發，臨床研究證實用于治療非小細胞肺癌(NSCLC)治療有效。該研究成果10年前轉讓給美國cancerVax公司進行臨床研究。美國已經通過藥 品的臨床試驗，預計將在未來2到3年內投入應用。ASCO(美國臨床腫瘤學)大會連續 幾年均報道了 EGF疫苗臨床研究進展報告。晚期不可切除的非小細胞肺癌患者在接受一 線化療后，隨機分為兩組，一組接種EGF疫苗，另一組接受最佳支持治療，接種時間為 第0、7、14、21、51天，之后每月接種1次。研究結果顯示試驗組患者總生存期比對 照組患者提高4 5個月，患者身體素質顯著改善，抵抗力增強。開發治療性疫苗研究 將具有重大的理論意義，擁有巨大的經濟及社會效益。目前，秘魯正在進行對藥品的審核，預計年底能夠上市，在中國，由北京百泰 生物藥業有限公司負責該藥臨床研究及產業化生產，并在2008年底在中國開展大規模臨 床研究，進一步驗證該藥對非小細胞肺癌患者的療效。腫瘤細胞區別于正常細胞主要特征之一是失控性生長，腫瘤細胞本身可以生成 某些生長因子促進細胞無限制生長，EGF (表皮生長因子)是近年發現的在細胞增殖和分 化中起重要作用的分子。EGF疫苗正是運用特異性主動免疫的方法，以腫瘤組織高表達 的EGF-EGFR(表皮生長因子受體)系統信號通路為作用靶點。患者接種該疫苗后，刺 激免疫系統產生針對EGF的抗體，阻斷由EGF-EGFR介導的下游信號傳導通路，從而誘 導腫瘤細胞凋亡，為腫瘤分子靶向治療提供了更新的選擇。在本發明的優選實施例中，用海藻酸鈣為材料制備微球，微球內包裹有牛血清 白蛋白(BSA)作為活化T細胞的免疫載體蛋白(Immunocarrier)。表面復以殼聚糖提供連按抗原的氨基。以小鼠內源的表皮生長因子(mEGF)為疫苗抗原，通過化學方法偶聯于 微球表面。免疫微球經尾靜脈注射免疫小鼠，4周后取血常規ELISA方法測定EGF抗體 滴度。結果顯示EGF抗體滴度大于8000 ；常規方法皮下免疫，EGF滴度小于200。從而證明未經化學交聯的小鼠自身蛋白可以成為完全抗原免疫獲得高滴度抗 體。根據本發明的一個優選實施例，本發明提供的表皮生長因子(EGF)構建的微球為 EGF-微球疫苗治療腫瘤提供實驗基礎。根據本發明的一個優選實施例，提供一種血管生長因子(VEGF)構建的微球。腫瘤血管形成在腫瘤生長、侵襲和轉移中具有重要意義，如果沒有新生血管進 入腫瘤為其帶來足夠的氧氣和營養，并運走代謝產物，腫瘤直徑將很少超過2 3_， 因為僅靠周圍的血管對腫瘤彌散作用是完全不夠的，腫瘤只能處于休眠狀態或發生退 化。如果血管一旦長入腫瘤組織，提供給腫瘤組織營養和氧氣的方式由彌散轉變成血流 灌注，其代謝產物將能夠被及時和徹底地清除，則腫瘤呈指數生長，顯現出無限制擴張 的趨勢。腫瘤的生長和血管生成是相輔相成的。腫瘤細胞產生的促血管生成因子能夠刺 激內皮細胞的生長及生存，而血管的生成不僅是提供營養、氧氣和運走代謝物，血管內 皮細胞還可向腫瘤提供生長啟動的因子。VEGF(血管內皮生長因子)是得到最好定性的 腫瘤血管形成誘發因子，阻斷VEGF的功能已經成為癌癥治療中的一個重要工具。在本發明的優選實施例中，以血管內皮細生長因子(mVEGF)為抗原，以聚乳 酸-乙醇酸(PLGA)制備免疫微球，以雞卵白蛋白為免疫載體蛋白。微球復以殼聚糖提供 偶聯氨基。戊二醛方法偶聯VEGF。免疫條件與EGF微球相同。6周后取血常規ELISA 方法測定mVEGF抗體滴度。結果顯示，mVEGF抗體滴度達到64000。獲得較海藻酸 鈣微球更好的結果。因此，本發明的微球為腫瘤血管抑制提供了免疫制劑。根據本發明的一個優選實施例，提供一種小鼠IgE C ε 3多肽構建的微球。IgE 介導性疾病是一類由IgE引發的變態反應性疾病的統稱，因其易感者在接觸環境中變應原 時往往產生過多的IgE抗體，通常伴有一種以上的變態反應性疾病而得名。當變應原初 次進入機體后，選擇性誘導特異性B細胞產生IgE抗體應答，而血清中游離的IgE可在 不結合抗原的情況下通過其Fc片段與肥大細胞和嗜堿性粒細胞表面受體結合使機體處于 致敏狀態。機體再次接觸變應原后，多價變應原與致敏細胞表面兩個或者兩個以上相鄰 的IgE抗體結合，使細胞膜表面受體發生交聯，觸發致敏細胞脫顆粒，合成及釋放生物活 性介質，從而引起局部或者全身過敏反應。IgE介導性疾病通常包括特應性皮炎(Atopic Dermatitis, AD)、變應性鼻炎(Allergic Rhinitis，AR)、支氣管哮喘(Asthma，AS)等， 癥狀重者可導致過敏性休克，危及生命。變態反應性疾病發病率逐年提高趨勢，已嚴重 干擾了患者的工作和生活，由此帶來的社會負擔也是相當可觀的。由于IgE在變態反應 性疾病的發生發展環節中的重要作用，目前已經成為抗變態反應性疾病治療的一個新的 靶點和研究熱點。IgE的分子結構已清楚，在IgE抗體分子與胞大細胞受體結合的分子表 位，位于抗體分子Fc的C ε 3結構域。雖然針對此區域的單克隆抗體已經FDA批準上 市并在臨床應用中顯示出了良好的效果，但是，造價的昂貴和使用上的不便限制了其廣 泛應用，因此，由被動地接受這種抗體蛋白轉向尋求針對該蛋白的主動免疫疫苗有著更 好的應用前景。研究構建能夠誘導出針對IgE受體結合位點(C ε 3結構域)特異性中和 抗體的治療性疫苗，通過抗原抗體封閉IgE Fc片段上與IgE Fc受體結合的部位，進而阻斷由IgE介導的變態反應性疾病效應途徑，為IgE介導性疾病的治療提供新的途徑。在本發明的優選實施例中，用化學合成方法合成了小鼠IgEFc的C ε 3結構域特 異的多肽。序列為GYGYQCIVDHPDFPKPIVRSITKTPGQR。該多肽相應單克隆抗體
被證實能阻斷IgE與肥大細胞受體結合并對過敏性疾病治療有效。微球材料為PLGA/殼 聚糖，包裹雞卵白蛋白作為免疫載體。戊二醛方法將多肽偶聯微球。按實例1的方法免 疫小鼠和測定抗體。結果顯示6周后小鼠IgE C ε 3結構域多肽抗體滴度大于32000。優于目前常 用即與BSA化學交聯常規方案。因此，本發明的微球為過敏性疾病提供了免疫治療的基 石出。根據本發明的一個優選實施例，提供一種表皮生長因子受體III型突變體 (EGFRvIII)構建的微球。表皮生長因子受體III突變體(EGFRvIII)是EGFR最常見的一 種缺失型突變體。相對于野生型E G F R蛋白而言，EGFRvIII在其胞外段缺失了 256個 氨基酸從而失去了和配體結合的功能，但是在不和配體結合的情況下其胞內段也可以發 生組成性磷酸化并激活下游信號通路。研究表明，EGFRvIII僅在腫瘤細胞上表達，如腦 膠質瘤，乳腺癌，卵巢癌，前列腺癌等，在正常細胞檢測不到EGFRvIII的存在。體外體 內實驗證明EGFRvIII的表達可以促進細胞轉化，腫瘤細胞增殖和侵襲，并與腫瘤病人的 預后密切相關。因此EGFRvIII是一個腫瘤診斷及治療的理想靶點。針對EGFRvIII的抗體可被應用于臨床治療，由于正常組織不表達EGFRvIII，所 以EGFRvIII抗體的特異性更強。YlO是特異針對人EGFRvIII的一種鼠源性抗體，可同 時識別人和鼠的腫瘤特異抗原。體外研究發現，YIO可以抑制腫瘤DNA合成和細胞增 殖，可產生補體或抗體介導的細胞毒作用。腹腔注射YlO可使穩定表達EGFRvIII的B16 黑色素瘤小鼠動物模型長期生存(η = 20 ； P < 0.001)。YlO在體內作用機制可能依賴于 Fc受體。單克隆抗體mAb806是用表達EGFRv m的成纖維細胞NR6免疫小鼠來制備 的。mAb806顯著抑制表達EGFRvIII的U87MG移植荷瘤鼠的腫瘤生長，呈劑量依賴 方式；它同時也可抑制EGFR過表達的A431細胞移植荷瘤鼠的腫瘤生長，正常組織中 沒有EGFRvIII，所含有的腫瘤相關抗正常組織中沒有EGFRvIII所含有的腫瘤相關抗原 表位，所以此表位可以作為腫瘤疫苗的一個潛在靶標。針對EGFRvIII抗原表位觸發 的反應，包括體液免疫與細胞免疫反應。eimberger等用單一肽段偶聯血藍蛋白免疫小 鼠后，皮下接種腫瘤細胞，結果免疫后小鼠70%未見腫瘤生長，腫瘤生長顯著低于對 照組(P < 0.05)。將免疫鼠血清轉移到未免疫鼠體內可以阻止31%小鼠的腫瘤生長P < 0.05)，其機制可能與抗體介導的細胞毒作用有關。Ciesielski等將EGFRvIII特異表 位(LEEKK-GNYVVTDH)的多個拷貝，用賴氨酸作為橋梁連接起來形成的多重抗原多肽 (multiple antigenic peptide)免疫Fisher大鼠，并檢測其細胞免疫效應。多重抗原多肽免疫 主要產生特異針對表達EGFRvIII靶抗原的F98膠質瘤細胞的抗腫瘤細胞免疫反應。在本發明的優選實施例中，首先合成人源EGFRVIII特異表位多肽。序列為 CGADSYEMEEDGVRKC。 該多肽相應抗體已證實對腫瘤治療有效。EGFRvIII多 肽-PLGA微球構建按實例2方法實施。在通過氨基連接于PLGA/殼聚糖微球(含有 BSA+OVA作為免疫載體)。按實例1的方法免疫小鼠和測定抗體。
結果顯示6周后EGFRvIII特異表位多肽抗體滴度。微球疫苗獲得良好效果， 血清抗體滴度大于32000。根據本發明的一個優選實施例，提供一種表皮生長因子受體HER2/neu構建的免 疫微球。HER2/neu是表皮生長因子受體家族的第二位成員。表皮生長因子受體(EGFR) 家族，也稱為HER或ErbB2家族，在細胞信號轉導中發揮重要作用，是細胞生長、分化 及存活的重要調節者。此家族包括EGFR (HERI或ErbBi)、HER2/neu (neu或ErbB2)、 HER3(ErbB3)及HER4(tyro2或Erb_B4)，人HER2/neu基因定位于17號染色體短臂，表 達產物為分子量185kDa的單鏈跨膜糖蛋白，含有1255個氨基酸殘基，細胞內段(ICD) 具有酪氨酸激酶活性。HER2/neu通過多種細胞內分子參與信號傳導，其主要下游物質包 括絲裂原活化已知有9種配體能直接與EGFR、HER3或HER4結合，在組織中EGFR家 族成員很少單獨表達.而是形成不同組臺，構成同源或異源二聚體，放大信號轉導而發揮 生物學作用由HER2/neu組成的受體復合物比其他受體聯合更有效。因為①HER2受體 復合物具有較高的配體結合能力，且內化率低能在漿膜上停留更長時間，延長受體信號 傳導的持續時間；②HER2是一種非常活躍的酪氨酸激酶，其自身突變及過度表達也能 產生結構上活化。通常情況下，HER2/neu只在胎兒時期表達，到成年以后，用免疫組 化染色只能在極少組織內發現其低水平表達于細胞表面。在人類癌癥，HER2/neu的分子 改變通常是正常基因產物的過度表達。多種人類癌癥存在HER2/neu過度表達，如乳腺 癌(25 30)、卵巢癌(25 32)、肺腺癌(30 35)、原發性腎細胞癌(30 40)等由于 HER2/neu蛋白定位于漿膜，即使中等水平HER2過度表達也能產生受體結構上活化。免 疫組化染色發現乳腺癌細胞的HER2蛋白水平比鄰近正常乳腺上皮高10 100倍。人類 腫瘤常見HER2/neu擴增及過度表達，表明HER2/neu在腫瘤發生中起重要作用。HER2/ neu的過度表達通過啟動多種轉移相關機制而增加轉移能力.包括細胞遷移率、體外侵襲 力、IV型腔原酶活性、實驗性肺轉移等。HER2/rieu過度表達也影響某些粘附分子如上 皮細胞鈣粘蛋白(E-cadherin)等合成.從而促進轉移。HER2/neu過度表達乳腺癌細胞對 雌激素治療不敏感。HER2/neu過度表達腫瘤細胞對某些化療藥物治療也不敏感。Tsai 等人在20種非小細胞肺癌細胞系中發現原發化療耐藥與HER2/neu表達顯著相關。HER2 過度表達誘導乳腺癌細胞對紫杉醇、紫杉萜耐藥。HER2/neu蛋白是癌癥主動免疫治療的 理想靶點。因為HER2/neu蛋白與細胞惡性轉化有關，是癌癥病因學中一種生物學相關 蛋白；某些腫瘤病人存在HER2/neu特異性抗體，表明HER2/neu疫苗能誘導免疫反應； 已證明被動免疫療法如HER2/neu抗體抗腫瘤作用，預測主動免疫可能也是有效的。在本發明的一個優選實施例中，首先合成人源HER2特異表位多肽 CQMWAPQ WGPDC O針對該多肽的特異抗體已被證實對腫瘤治療有效。免疫微球構建 材料為瓊脂糖。微球含有BSA+OVA作為免疫載體，多肽抗原用戊二醛通過氨基連接于 瓊脂糖/殼聚糖微球。結果顯示6周后Her2特異表位多肽構建的免疫微球免疫小鼠血清抗體滴度大 于32000。 比常規BSA_Her2方法高5倍以上。


圖1是免疫微球模擬圖，其中1表示免疫載體蛋白，2表示疫苗抗原。
圖2是表皮生長因子構建的微球免疫小鼠血清中EGF抗體測定結果圖，其中橫 坐標表示血清稀釋比例，縱坐標表示OD450值，每組柱狀圖中的A表示實驗組，B表示 對照組，C表示空白。圖3是表皮生長因子(EGF)構建的微球的West-blot檢測結果圖，其中3表示 BSA, 4 表示 EGF。
具體實施例方式下面結合附圖和具體實施例進一步說明本發明的技術方案，但本發明不僅局限 于實施例。實施例1包裹牛血清白蛋白的硅藻酸鈣/殼聚糖微球制備一、包裹牛血清白蛋白(BSA)的硅藻酸鈣微球制備海藻酸鈉(sodium alginate) 2g溶于90ml雙蒸水中，加牛血清白蛋白(BSA)至終 濃lmg/ml。0.5M NaOH調PH至7.3，加水定容至IOOml配置成2% (m/v)溶液。氯化 鈣(CaC12)配制成10% (m/v)溶液。2%海藻酸鈉溶液4ml氣泵噴筆霧化噴入IOOml氯 化鈣溶液中，500轉/分磁力攪拌成球。磁力攪拌平衡lh，離心收集微球，雙蒸水攪拌 平衡lh，離心洗滌3次。顯微鏡檢視大小和微球均一性。根據紅細胞大小對照判斷微球直徑約為5-8微 米，顯微鏡觀察分散性良好。相同方法制備不含BSA的海藻酸鈣微球用于對照試驗。微球直徑大小與上述相 似。顯微鏡觀察分散性良好二、微球中BSA含量測定Iml微球懸浮于5ml、0.1M、pH7.6的磷酸緩沖液中。二小時后海藻酸鈣微球解 體溶介。BSA釋放于溶液中，測定BSA的紫外光吸收OD2SO。濃度lmg/ml的OD28tl 值為0.56。按此推算，微球中BSA濃度約為0.75mg/ml。三、包復殼聚糖的海藻酸鈣微囊制備該步驟的目的是在包裹蛋白的外表面引入可以偶聯蛋白的氨基，同時用殼聚糖 包復微球表面克服蛋白從微球中漏出殼聚糖(chitosan)MW 18000 20000取0.5g溶于醋酸溶液，定容至 100ml，終濃度為 0.5% (m/v)。藻酸鈣微球與0.5%殼聚糖溶液混合，室溫磁力攪拌4小時。離心收集微囊，振 蕩器打散緩慢加入生理鹽水至懸液，離心收集微囊，洗滌重復5次。包復殼聚糖的微球分散性較海藻酸鈣微球略差但滿足實驗要求。四、聚糖氨基定量1.三硝基苯磺酸鈉(TNBS)可與殼聚糖中游離氨基產生橙紅色反應，加入終止液 后335nm比色。按消光系數(E335 = 14000)計算氨基濃度2.TNBS (5% m/v)稀釋到0.01% (m/v)工作液。反應緩沖液為PH8.50.1M碳酸
緩沖液。3.不含有BSA的微球用于氨基測定，因蛋白氨基同時顯色。微球體積定量微 球懸生理鹽水，用帶刻度的離心管中1000轉/分離心。觀察離心后的微球體積(以下稱之謂壓積)，然后根據需要稀釋到需要濃度。以下微球的百分濃度均為壓積百分濃度4、10%微球樣品取樣 2ml，加入 0.01 % (m/v) TNBS 0.5ml，于 37°C水浴 2h，再 加入0.5ml 10% SDS和0.25ml IM鹽酸終止。5分鐘后于335nm比色。測得OD335 = 0.75。5、氨基估算(0.75+ 14000 X 6.023 X IO23) + 微球數 / 升海藻酸鈣微球接近紅細胞大小，估算約為2000萬/μ ，即按2Χ1013/升計算。 每個微球估算大約有150000個氨基。以下微球氨基測算均以此方法。實例2、包裹卵白蛋白(OVA)的聚乳酸-乙醇酸(PLGA)/殼聚糖微球制備本實施例中所采用的微球制備操作可參考文獻(1)載藥微球的制備、表征與 體外緩釋研究；清華大學研究生論文(2008)王逸蔚，崔福齋。(2)聚乳酸微球的制備； 吉林大學學報(理學版)V ol.43N ο.6Νον 2005 842-846。一、聚乳酸-乙醇酸共聚物購于SIGMA公司(成份比為50 50)，IOOmg溶 于5mL有機溶劑二氯甲烷中。秤取5mgOVA，干粉用細菌研磨器將OVA顆粒研細。懸 浮于含有PLGA的有機溶劑。并緩慢倒入50mL含聚乙烯醇(PVA)的水相中，冰浴 下以300W功率超聲乳化30s。隨后將復乳倒入150mL雙蒸水中常壓磁力攪拌5h以揮發 有機溶劑，15000r/min離心IOmin收集，去離子水洗滌3次，冷凍干燥48h去除微球中水 分，于-20°C保存。顯微鏡下觀察微球粒徑，根據視覺粒徑及顯微放大倍數判斷，重復制備的微球 平均粒徑均為2.0 3.0 μ m。分散性良好二、微球包裹OVA含量測定Iml用于測定的微球懸于3ml 二氯甲烷，輕輕震搖使微球溶解，加入3ml0.1M、 pH7.2的磷酸緩沖液溶介OVA。離心取上層水相測定OD280。lmg/ml為E2800.74。結 果顯示，PLGA微球中OVA濃度約為0.9mg/ml三、PLGA微球包復殼聚糖。操作條件如實例1。TNBS比色法測定氨基，估 算大約每亇微球有30000個氨基四、包裹BSA的PLGA微球操作條件與上相同，僅用BSA取代OVA蛋白。五、包裹BSA+OVA的PLGA微球操作條件與上相同，用BSA+OVA蛋白代替單
一蛋白。實例3包裹BSA的瓊脂糖微球制備一、制備方法低凝固溫度瓊脂糖購于SIGMA公司。瓊脂糖用蒸餾水加熱熔 化，濃度為4%。執置于45C度水浴。BSA溶解于0.05MPH7.2磷酸緩沖液中，濃度為 0.2%。等體積蛋白溶液與瓊脂糖混合使最終濃度瓊脂糖為2%，蛋白濃度為與0.5%。微球制備用膜乳法制備，其具體操作可參考文獻快速膜乳化法制備粒徑均一 的PLGA微球和微囊。田瑞，王連艷等。過程工程學報Vol.9No.4。2009年8月。 754-761。膜乳化法制備微球是將溶化的瓊脂糖在高壓不通過陶瓷膜微孔(孔徑0.1-5微 米)分散進入油相形成微球。油相成份為含有2% SPAN80的食用豆油。陶瓷膜孔徑為 0.5微米，乳化時油溫保持45度。磁力攪拌下獲得1-3微米的含有蛋白的瓊脂糖微球。 撤去加熱后使冷卻到室溫使瓊脂糖微球凝固。離心收集微球。微球用25-75%逐步增加酒精濃度在低溫下(0-5度)洗滌除去油相成份并固定蛋白。二、微球鏡檢結果根據視覺粒徑及顯微放大倍數判斷，制備的微球平均粒徑 均為2.0-3.0 μ m。分散性良好。三、蛋白含量測定IOOmg乙醇干燥的微球懸浮于5.0ml磷酸緩沖液(0.05M pH7.2)中。冰箱中放置 48小時使蛋白充分釋放于溶液中。OD2SO測定卵白蛋白含量。結果顯示每IOOmg干微 球含卵白蛋白2.5mg四、包的復殼聚糖的結果方法與實例3相同，用不含蛋白的微球做包復殼聚糖氨基測定(蛋白干擾氨基測 定)。估算每亇微球(按平均直經2.5微米計)含有殼聚糖氨基大于30000個五、包裹OVAA的瓊脂微球操作條件與上相同，僅用OVA取代BSA蛋白。六、包裹BSA+OVA的瓊脂微球操作條件與上相同，用BSA+OVA蛋白代替單一 蛋白。實例4微球與抗原蛋白的連接一戊二醛方法連接一、以EGF為例說明微球與抗原的偶聯二、取洗滌過的海藻酸鈣/殼聚糖微球離心壓積0.5ml重懸于2.5ml的碳酸緩沖 液(0.1M、pH8.5)。加入2.5ml 0.5%戊二醛，室溫混合2h活化后離心收集洗滌3次。三、微球重新懸于3ml的碳酸緩沖液中。加入500微克小鼠來源mEGF (sigma 公司)。置于混合器上冰箱中混合反應4小時后，加入乙醇胺100微升封閉余下戊二醛基 團。然后用生理鹽水洗滌三次。四、微球偶聯EGF結果抗小鼠EGF抗體、辣根過氧化物酶標記的親和素(Avidin) TMB顯色底物工作液 購于武漢新啟迪生物科技有限公司。EGF-海藻酸鈣微球懸浮于試管中，按操作說明書相 繼加入Biotin-EGF抗體、HRP_avidin、TMB。用肉眼及顯微鏡可觀察到微球顯蘭色。
實例5EGF微球疫苗動物試驗結果一.動物免疫1.20只昆明種小鼠隨機分為3組實驗組8只，對照組8只，空白組4只。2.免疫微囊以生理鹽水重懸。實驗組注射含BSA的微囊，2% (ν/ν)微囊0.1ml 尾經脈注射；10% (V/V)0.2ml背部皮下多點免疫注射。對照組注射不含BSA的微囊， 方法同上。空白組注射生理鹽水，方法同上。3.初免后14d再次免疫一次，10日后小鼠處死，眼球采血，分離血清。二 .ELISA 檢測抗體l.mEGF和BSA分別以0.05M PH9.6碳酸緩沖液配制20ug/ml包被液，0.1ml每
孔過夜包被酶標板。2.PBST洗滌3次，每孔以0.3ml無蛋白封閉液室溫封閉2h。3.洗滌3次分別加入梯度稀釋的小鼠血清各0.1ml，37°C孵育2h。4.PBST洗滌5次加入1 2000兔抗鼠-HRP每孔0.1ml，室溫孵育lh。洗滌5 次后分別加入O.lmlTMB顯色，顯色15min各加入50ul IM硫酸三、動物試驗結果
EGF抗體測定結果見圖2。
EGF抗體平均滴度為8000。
四1West—blot檢測
1．mEGF和BSA分別以20ug上樣做SDS—PAGE電泳。
2．100mA恒流轉膜lh。
3．無蛋白封閉液封閉2h。
4．1500小鼠血清37℃結合2h。
5．PBST洗滌5次加入l2000兔抗鼠一HRP，室溫孵育lh。
6．洗滌5次，加入DAB顯色
7．結果如圖3，實驗組小鼠產生抗BSA和mEGF抗體。
在BSA及EGF電泳位置顯色。
實施例6血管生長因子(VEGF)構建的微球
一1鼠源血管內皮細胞生長因子(mVEGF)購于sigma公司。
PLGA／殼聚糖微球制備見實例2。
mVEGF與微球的偶聯用戊二醛方法連接。
見實施例4。[Ol 23] 二1偶聯結果鑒定
用于鑒定異硫氫酸熒光素標記兔抗小鼠VEGF多克隆抗體，購于上海晶天生物科技有限公司。
按說明書操作用熒光標記抗體檢測微球表面的mVEGF。
用熒光顯微鏡觀察結果。
在熒光顯微鏡視野下可見微球發明亮熒光。
實驗小鼠(昆明種，來自上海實驗動物中心)分四組，每組七只小鼠[Ol 27] l1lo％mVEGF一微球(PLGA微球包含有OVA)靜脈注射免疫
2110％mVEGF一微球(PLGA空白微球)靜脈注射免疫
31lo u g mVEGF用Friend佐劑常規皮下注射免疫[Ol 30] 41沒有任何處理的小鼠血清為陰性血清對照
低速離心壓積為o．5ml免疫微球懸浮于5ml PBS中。
注射量為100微升第一次免疫后周后加強免疫，以后每周加強一次。
六周后摘眼球取血。
常規ELISA方法測定血清中抗體滴度。
結果見表l[Ol 32] 表1VEGF微球免疫小鼠血清抗體測定(OD450±SD)
權利要求
1.一種克服B細胞免疫耐受的免疫微球，其包括微球介質，其特征在于，所述微球 介質外部包覆有疫苗抗原，所述微球介質內部包裹有用于活化T細胞的免疫載體蛋白。
2.如權利要求1所述的克服B細胞免疫耐受的免疫微球，其特征在于，所述疫苗抗原 的B細胞表位位于所述免疫微球的表面，所述免疫載體蛋白的T細胞表位位于所述免疫 微球的內部，從而實現B細胞表位與T細胞表位的物理隔離。
3.如權利要求1所述的克服B細胞免疫耐受的免疫微球，其特征在于，所述的免疫載 體蛋白選自嘁血蛋白、牛血清白蛋白、卵白蛋白、基因工程表達的破傷風病毒蛋白片 斷、乙肝病毒殼蛋白、腦膜炎球菌蛋白、HIV外殼蛋白、感冒病毒蛋白。
4.如權利要求1所述的克服B細胞免疫耐受的免疫微球，其特征在于，所述的疫苗 抗原選自表皮生長因子、血管生長因子、血管生長因子受體、IgE、表皮生長因子受體 EGFR及突變體、表皮生長因子受體腫瘤壞死因子、轉化生長因子血管緊張素、CD20。
5.如權利要求1所述的克服B細胞免疫耐受的免疫微球，其特征在于，所述微球介質 選自海藻酸鈣、聚乳酸、聚乳酸-乙醇酸、瓊脂糖、葡聚糖、蛋白。
6.如權利要求1所述的克服B細胞免疫耐受的免疫微球，其特征在于，所述疫苗抗原 通過常規化學方法與所述微球介質偶聯。
7.如權利要求6所述的克服B細胞免疫耐受的免疫微球，其特征在于，利用雙功能交 聯試劑實現氨基-氨基、羧基-氨基、氨基-锍基的偶聯。
8.如權利要求7所述的克服B細胞免疫耐受的免疫微球，其特征在于，利用戊二醛試 劑實現氨基與氨基的偶聯。
9.如權利要求1-8中任一項所述的克服B細胞免疫耐受的免疫微球在疫苗制備上的應用。
10.如權利要求1-8中任一項所述的克服B細胞免疫耐受的免疫微球在免疫佐劑上的應用。
全文摘要
本發明涉及一種克服B細胞免疫耐受的免疫微球及其應用，所述免疫微球包括微球介質，微球介質外部包覆有疫苗抗原，所述微球介質內部包裹有用于活化T細胞的免疫載體蛋白。所述的克服B細胞免疫耐受的免疫微球在疫苗制備和免疫佐劑上的應用。通過上述技術方案，本發明提供的免疫微球通過抗原與B細受體結合被B細胞吞噬，載體蛋白在細胞內釋放、降解；并通過B細胞MHC II提呈給Th細胞，激活Th細胞釋放細胞因子，從而促使B細胞活化、增殖；經過親和力成熟過程產生高滴度抗體。通過將抗原蛋白及免疫載體蛋白分置于微球表面及內部，避免了抗原蛋白表位與Th細胞活化表位同B細胞受體的競爭。
文檔編號A61K39/39GK102008719SQ20101057127
公開日2011年4月13日 申請日期2010年12月2日 優先權日2010年12月2日
發明者張尚權, 談立松, 陳宇光 申請人:上海微球生物科技有限公司