專利名稱：一種治療脊髓損傷的方法和治療劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種治療脊髓損傷(SCI)的新方法和治療劑。具體地說，本發明涉及通過向SCI忠者的脊髓的損傷部位局部注射CNS神經膠質細胞而治療脊髓損傷的方法和活性成分是CNS神經膠質細胞的治療劑。
背景技術：
脊髓損傷引起嚴重的癥狀截癱(雙下肢麻痹)或四肢癱瘓或甚至呼吸肌麻痹兼四肢癱瘓，因此輪椅和臥床不起的生活是不可避免的。至今仍未發現治療SCI的有效療法。由于瞬間的交通或運動事故而被剝奪手和腳自由的患者極渴望活動他或她自己的手和腳并通過恢復損傷的神經通路而再次行走。
自19世紀末期以來，人們已相信哺乳動物CNS通路根本不能再生或者很少再生，即使有，也無明顯的功能[例如Ra’mon y Cajal，Degeneration and Regeneration in the Nervous System，1959，Hafner，New York(1928)]。但是，過去二十年的研究披露哺乳動物CNS通路的功能上的明顯再生是可能的，因而否定了全世界認為的不能再生的觀念。
一種關于CNS環境的假說于最近出現并逐漸成為一個教條。它主張哺乳動物CNS的環境不允許軸突生長，因而必需使環境允許誘導軸突的再生。Schwab和他的合作者發現了CNS白質中與髓磷脂相關的生長抑制因子，并推測所述因子導致哺乳動物CNS不允許再生。事實上，他們報道由抗體導致的因子的中和誘導橫切之后錐體束的再生，且該束的外延越過整個成年大鼠的損傷部位[Nature，343(18)，269(1990)]。除了他們的報道之外，還進行了多種嘗試使CNS環境允許誘導成年大鼠脊髓的再生移植外周神經節、雪旺氏細胞、嗅覺鞘樣細胞(OEC，對嗅神經和嗅球具有特異性的神經膠質細胞)。Cheng和他的合作者報道在除去成年大鼠脊髓節段之后通過在空的脊髓間隙中橋接神經節發生功能恢復(Science，273(26)，510(1996)]。Guest和他的合作者報道通過移植雪旺氏細胞，即PNS的神經膠質細胞而發生脊髓的再生[Exp.Neurol.，148，502(1997)]。Li和他的合作者報道在部分橫切頸上脊髓之后通過將培養的OEC移植到損傷部位發生錐體束的再生和功能恢復[Science，277(26)，2000(1997)]。
但是通過這些嘗試使環境允許再生的投射數量小且長度短(至多10mm)，且大部分是異常的，達不到適當的目標。因此功能恢復程度小，因而后肢不能完全支持體重。為了使SCI患者從輪椅上解放出來并用他們自己的腳再次行走，重要的是開發一種新能夠重建類似于正常的神經投射的治療方法。
本發明的目的是提供一種新的在數量(投射神經元的數量)、長度(軸突的范圍)、通路和末端方面實現恢復類似于正常的神經投射的方法，并使SCI患者能夠再次行走。本發明還提供所述方法的治療劑。預期本發明能減少患者和他們的家庭護理者的生理和心理負擔，并節約沉重的醫療負擔和社會福利成本。

發明內容
本發明基于我們的假設，即局部損傷癥狀而不是CNS的整體不允許環境導致軸突再生失敗。所述假設與目前所持觀點相當不同，但與我們的脊髓損傷研究的發現一致我們發現被橫切的CNS通路中顯著的再生自發地發生在小于一個月齡的大鼠被急速切割之后。在2-3個月齡的成年大鼠中，自發性再生不發生，推測因為其CNS組織比年幼動物堅硬，因而橫切導致損傷部位的水腫。但是，當將胚胎大鼠脊髓組織移植到損傷部位時，類似于正常投射的軸索再生被誘導。因此，我們推測CNS環境不是整體不允許再生，而再生失敗是由于局部條件惡化，即使生長軸突能夠發現正確通路和目標的軸突指導線索紊亂導致的。似乎很有可能有多種因素使CNS環境允許破壞軸突指導線索的一致性，從而限制軸突再生的數量和范圍，導致異常投射。根據我們的推測，我們嘗試通過移植從新生大鼠脊髓收集的培養的混合的神經膠質細胞來改善損傷部位的局部條件，期望恢復損傷部位的微環境。在完全橫切成年大鼠胸節段水平的脊髓之后將神經膠質細胞移植到損傷部位。移植的動物從完全截癱恢復到幾乎正常行走。再生的投射在數量、范圍、通路和末端方面類似于正常。本發明通過對哺乳動物CNS再生的新認識來實現。與CNS神經膠質細胞妨礙軸突再生的常規觀念完全相反，我們使用這種細胞成功地實現脊髓的神經修復。神經連接恢復和功能復原的程度大大高于根據常規觀念進行嘗試的程度。
本發明提供一種通過將CNS神經膠質細胞移植到損傷的人或其它哺乳動物的脊髓而治療脊髓損傷的方法。用于移植的細胞包括除了II型星形膠質細胞之外的培養的CNS神經膠質細胞中的至少一種。本發明還提供適用于所述治療脊髓損傷的方法的治療劑。
所述治療劑包含至少一種除了I型星形膠質細胞之外的培養的CNS神經膠質細胞作為活性成分，并可以包含任何醫療允許的賦形劑。本發明的進一步特征和優點將在以下“本發明的最佳實施方式”中變得清晰。
本發明的最佳實施方式CNS神經膠質細胞由I型和II型星形膠質細胞、少突膠質細胞、小膠質細胞和它們的祖細胞組成。本發明的治療劑包含至少一種除了I型星形膠質細胞之外的培養的CNS神經膠質細胞作為活性成分；它們可以是多于2種CNS神經膠質細胞的混合的細胞。所述的CNS神經膠質細胞優選包括所述三種細胞即I型星形膠質細胞的祖細胞、II型星形膠質細胞的祖細胞和O4祖細胞中的至少一種。最適宜的治療劑主要包含II型星形膠質細胞的祖細胞，但可以包含I型星形膠質細胞、II型星形膠質細胞，少突膠質細胞和小膠質細胞。此外，它們可以包含雪旺氏細胞和嗅覺鞘樣神經膠質。
用于本發明的神經膠質細胞的來源無限制；可以使用自體的或同種異體的或異種的CNS神經膠質細胞。其中優選自體的細胞和同種異體的細胞。對于臨床應用，可以從患者自身損傷的脊髓中收集自體的細胞。可以從流產的胚胎或腦/心臟死亡的尸體中收集同種異體的細胞。可以從豬、猴或某些其它哺乳動物的CNS中收集異種細胞。由于CNS是免疫學豁免部位，異種細胞可以在施用少量免疫抑制藥物時存活。
CNS神經膠質細胞的來源優選胚胎、新生兒或幼小的哺乳動物，但可以是年老的動物。優選但不是必須地從它們的脊髓中進行收集。任何其它CNS部分，例如大腦皮層、腦干或全腦可以是供應來源。來源于胚胎干細胞或神經干細胞的神經膠質細胞也可以是供應來源。神經干細胞分成成人型、胚胎型和神經上皮型。它們不僅可以從胚胎或新生兒中收集，也可以從成人中收集。神經膠質細胞可以通過常規的生物技術，使用刺激劑EGF、bFGF、CNTF、視黃酸或T3由這些來源制備[(Genes Dev.，10，3129-3140(1996)，Neuron，18，81-93(1997)，J.Neurosci.，18，3620-3629(1998))。
任何細胞培養技術可以用于制備神經膠質細胞。例如，用蛋白酶(如胰蛋白酶)處理在無菌中切除的脊髓或大腦皮層以制備單細胞或小細胞群。然后將它們接種于陪替氏培養皿并在含有血清的培養基中于CO2恒溫箱中培養一定的時間。在培養期間，神經元早早死亡而混合的神經膠質細胞存活。關于細胞培養，可以使用含有10-20％胎牛血清、F-10培養基或RPMI1640或某些其它培養基的Dulbecco’s MEM(DMEM)。培養基每3-4天更換，并保持在大約30-40℃下。
過了幾天，星形膠質細胞由于其旺盛的增殖潛能而變成占絕大多數的細胞，如果需要的話可以通過使用不含血清的培養基而增加少突膠質細胞。Percoll密度梯度法或粘合劑差異法有效地分離少突膠質細胞和星形膠質細胞。
可以通過制備在培養基或適宜的緩沖溶液如PBS中的培養的神經膠質細胞的懸浮液而制備適于應用的本發明的治療劑。細胞懸浮液的培養基可以包含醫學上允許的添加劑，除非它們抑制細胞活性。應用的細胞密度的范圍為103-106細胞/μL，優選104-105細胞/μL。
所述治療脊髓損傷的方法是將有效量的懸浮液注射到損傷部位。所述方法適用于人和其它哺乳動物，用于部分或全部橫切。對損傷的位置沒有限制髓質、頸、胸、腰或骶骨節段中的任何部分。所述的方法適用于呼吸麻痹、四肢癱瘓、截癱，而不管其嚴重程度。
所述的方法最好用于由跌落事故或運動事故導致的脊髓損傷，但不一定應用于這些外傷性事故。例如它也可以用于腦血管導致的錐體束損傷。所述治療可以優選進行急性治療，即在24小時之內，優選8小時之內進行治療。但是，所述的治療也可以在慢性階段進行，例如損傷后一周、5年或者甚至大于10年進行。后者的依據是發現相當數量的投射神經元在切斷軸突之后存活數個月(大鼠為數個月，對應于人則多于10年)。因此似乎軸突的再生是可能的，條件是損傷部位的局部條件得到改善。
可以使用任何方法將培養的神經膠質細胞的懸浮液施用于損傷部位，只要它是注射安全和可靠的。例如，通過椎板切除術暴露脊髓，然后可以在外科顯微鏡下使用微量調節注射器髓內注射懸浮液。當獲得高清度MRI圖像時，可以不用椎板切除術注射細胞懸浮液，如利用腰穿刺技術進行注射。
待注射的CNS神經膠質細胞的數量取決于損傷的程度。通常對于成年患者它的總量范圍為103-107細胞，優選105-107細胞。
在注射細胞之前，可以施用免疫抑制藥物如環孢菌素、他克莫司(FK505)、環磷酰胺(cyclophosamid)、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤或咪唑立賓。它在移植異種細胞時是必需的。
實施例在以下的工作實施例中更為完整地解釋本發明，所述實施例不限制本發明的范圍。
工作實施例1制備從新生大鼠的脊髓中收集的培養的混合的神經膠質細胞并分析它們的組成無菌下從1-2日齡的EGFP-轉基因SD大鼠中切除脊髓[EGFP增強的綠色熒光蛋白，SD＝Sprague-Dawley系；指FEBS Letter，407，313-319，1997]。通過胰蛋白酶和DNase處理將它解離成單細胞和小細胞群。以在補充10％的胎牛血清、青霉素100單位/mL、兩性霉素B2.5μg/mL、鏈霉素100μg/mL的DMEM培養基中的5×105細胞/75cm2的密度將它們接種于陪替氏培養皿，并在常規條件下培養。細胞密度對應于取自3-4個脊髓/皿的物質。在第2、6和10天，加入相同組成的DMEM培養基。2周后細胞達到融合。用胰蛋白酶-EDTA(由GIBCO/BRL、0.25％胰蛋白酶、1mM EDTA制備)將它們離解，將其再接種(1皿→1皿)并培養。每3-4天進行一次培養基更換。在開始培養后的第3-4周，用胰蛋白酶-EDTA離解細胞，并用DMEM培養基(1皿提供50μL)將其制成4-5×104細胞/μL的懸浮液。在工作實施例2中施用所述細胞懸浮液。
培養的混合的神經膠質細胞的組成由抗原特異性標記分子分析并列在表1中。應用Neuroglia，Helmut Kettenmann等人，OxfordUniversity Press(1995)所述的分類。
從大鼠脊髓中收集的培養的混合的神經膠質細胞的組成細胞類型 抗原的表達充足率Vim1Ran2 A2B5 O4 GFAP (％)神經膠質細胞的直系祖細胞 + + + -- 5I型星形膠質細胞的祖細胞+ + - -- 25I型星形膠質細胞- + - -+ 502A祖細胞 + - + -- 0II型星形膠質細胞的祖細胞 + - + -+ 45II型星形膠質細胞 - - + -+ 0O4祖細胞 - - + +- 15橈骨神經膠質細胞的祖細胞 + - - -- 3(RC2+)小膠質細胞(ED1+) - - - -- 21Vim-波形蛋白工作實施例2將神經膠質細胞注射到損傷脊髓的損傷部位在胸下節段快速地完全橫切成年SD大鼠(♀，2個月大)的脊髓。用哈密頓微量調節注射器，以4-5×104細胞(1μL)每個部位的數量將在工作實施例1中制備的細胞懸浮液注射到橫斷面嘴側和尾側的兩個部位。用Basso，Beattie和Bresnahan[J.Neurotrauma 121-21(1995)]開發的BBB度量評價運動表現。簡言之，得分0和21分別表示癱瘓大鼠的運動和正常運動。得分1至8集中在不能站立或支持重量的大鼠的肢體運動。得分9至13描述能夠站立然后以不同程度的后前肢協調行走的大鼠。得分14至20描述作為腳放置、趾間隙、尾位置和軀干穩定性漸漸得到改善的良好的行走大鼠。
在開始時，用神經膠質細胞注射處理的脊髓損傷的大鼠完全截癱和無尿，具有濕潤和骯臟的肛門與生殖器區域。在外科手術后3-4天，它們開始移動后肢。一周后，后肢變得能夠支持體重。2周后觀察到有后-前肢協調的行走。3周后它們能夠以類似于正常動物的方式行走。BBB得分從0升高到大于15。通過示蹤法檢查的再生的軸突在數量、范圍和通路方面類似于正常的投射。它們終于正常目標并形成突觸。
工作實施例3制備從成年大鼠的損傷的脊髓中收集的培養的混合的神經膠質細胞的懸浮液在胸下節段橫切60天大的EGFP-轉基因成年SD大鼠的脊髓[參考FEBS Letter，407，313-319，1997]。將動物飼養一個月。在外科手術后一個月，在無菌下切除2-3個包括損傷部位的節段，并用蛋白酶處理以以類似于工作實施例1所述的方式制備單細胞或小細胞群。將這些細胞或細胞群以5×106細胞(取自一只或二只大鼠的物質)/皿的密度接種于陪替氏培養皿(75cm2)，并在常規條件下在補充10％胎牛血清、青霉素100單位/mL、兩性霉素B2.5μg/mL、鏈霉素100μg/mL的DMEM培養基中培養。在第2、6和10天加入相同組成的DMEM培養基。然后每3-4天進行培養基更換。來源于成年的物質的細胞增殖大大慢于來源于新生兒的物質，且細胞在3-4周后達到融合。如所述地用胰蛋白酶-EDTA將它們離解，將其再接種(1皿→1皿)，并再培養2周。在培養開始后5-6周，收集細胞，并以類似于工作實施例1所述的方式制備密度為4-5×104細胞/μL的懸浮液。來源于成年大鼠損傷脊髓的培養的混合的神經膠質細胞的懸浮液用于注射到工作實施例4的損傷部位。
工作實施例4將來源于成年大鼠的損傷的脊髓的培養的混合的神經膠質細胞注射到脊髓損傷部位。
在胸下節段快速地完全橫切成年SD大鼠(♀，2個月大)的脊髓。以類似于實施例2所述的方法將實施例3制備的細胞懸浮液注射到損傷部位。然后動物從完全截癱恢復到如實施例2中的行走。
對比實施施1將培養的I型星形膠質細胞注射到損傷部位以類似于先前的Wang JJ等人(Effects of astrocytesimplantation into the hemisected adult rat spinal cord.Neuroscience 65，973-981，1995)的研究的方式制備來源于新生大鼠大腦皮層的I型星形膠質細胞的細胞懸浮液。在胸下節段快速地完全橫切成年SD大鼠(♀，2個月大)的脊髓，并用哈密頓微量調節注射器，以4-5×104細胞(1μL)每個部位的數量將細胞懸浮液注射到橫斷面嘴側和尾側的兩個部位。所述的方法類似于工作實施例2所述的方法。在開始時，大鼠如實施例2那樣完全截癱和無尿，具有濕潤和骯臟的肛門與生殖器區域，而功能恢復遠遠差于工作實施例2。一周后發生微小的后肢運動，但體重支持從未發生。BBB度量的評價總是小于8分。
比較實施例2將活化的培養的巨噬細胞注射到損傷部位我們制備巨噬細胞的細胞懸浮液，并通過以類似于先前SchwartzM等人(Implantation of stimulated homologous macrophagesresults in partial recovery of paraplegic rats，1998)的研究的方式共培養坐骨神經節段而進行培養和活化。在胸下節段快速地完全橫切成年SD大鼠(♀，2個月大)的脊髓，并用哈密頓微量調節注射器，以4-5×104細胞(1μL)每個部位的數量將細胞懸浮液注射到橫斷面嘴側和尾側的兩個部位。所述的方法類似于工作實施例2所述的方法。在開始時，大鼠如工作實施例2那樣完全截癱和無尿，具有濕潤和骯臟的肛門與生殖器區域，而功能恢復遠遠差于工作實施例2。一周后發生微小的后肢運動，但體重支持從未發生。BBB度量的評價總是小于8分。結果非常類似于對比實施例2的結果。
工業實用性本發明提供一種通過將培養的混合的CNS神經膠質細胞注射到損傷部位而治療脊髓損傷的方法。本發明實現修復在數量(投射神經元的數量)、長度(軸突的范圍)、通路和末端方面幾乎難以與正常大鼠區分的神經連接。從完全截癱快速恢復至不僅支持體重而且進行后前肢協調行走的程度。盡管存在多種治療脊髓損傷的努力，但這種突破是迄今未實現的，且它提供了目前不存在的有效治療策略。當開發出有效治療時，它將減少患者和他們的家庭護理者的醫療和心理負擔，并節約沉重的醫療負擔和社會福利成本。
權利要求
1.一種用于治療脊髓損傷的治療劑，所述治療劑包含作為活性成分的神經膠質細胞，所述神經膠質細胞包括選自除了I型星形膠質細胞之外的培養的CNS神經膠質細胞的至少一種。
2.根據權利要求1的治療劑，其中所述的CNS神經膠質細胞包括選自I型和II型星形膠質細胞的祖細胞和少突膠質細胞的祖細胞中的至少一種。
3.根據權利要求1的治療劑，其中所述的神經膠質細胞主要包含II型星形膠質細胞的祖細胞。
4.根據權利要求1-3之任一項的治療劑，其中所述的神經膠質細胞是來源于脊髓的混合的神經膠質細胞。
5.根據權利要求1-4之任一項的治療劑，其中所述的神經膠質細胞是自體的或同種異體的。
6.根據權利要求1-4之任一項的治療劑，其中所包含的神經膠質細胞的數量為103-106細胞/μL。
7.一種通過向人或其它哺乳動物的損傷的脊髓局部注射有效劑量的神經膠質細胞而治療脊髓損傷的方法，所述神經膠質細胞包括選自除I型星形膠質細胞之外的培養的CNS神經膠質細胞中的至少一種。
8.根據權利要求7的方法，其中所述神經膠質細胞是來源于脊髓的混合的神經膠質細胞。
9.根據權利要求7或8的治療劑，其中所述的神經膠質細胞是自體的或同種異體的。
10.根據權利要求7-9之任一項的方法，其中所述損傷的脊髓是成人身體的部分，而所述培養的CNS神經膠質細胞的注射總數為103-107。
全文摘要
一種用于治療脊髓損傷的治療劑，所述治療劑包含作為活性成分的神經膠質細胞，所述神經膠質細胞包括作為CNS膠質細胞的I型星形膠質細胞的祖細胞和II型星形膠質細胞的祖細胞和04祖細胞；和一種特征在于通過將有效劑量的上述治療劑局部給藥而治療脊髓損傷的方法。
文檔編號A61K35/12GK1545416SQ0281643
公開日2004年11月10日 申請日期2002年8月23日 優先權日2001年8月23日
發明者川口三郎, 西尾健資, 資 申請人:川口三郎, 西尾健資