專利名稱：抗愛滋免疫調節復合劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及抗愛滋治療性免疫復合劑，該制劑具有依賴于非特異性抗原的免疫能力。
眾所周知，細菌學中的壁表面，膜表面或莢膜表面的抗原(以結合或游離方式溶于培養基)是糖蛋白、多肽或多糖類。
最近大量報道的疫苗皆屬于結合于核糖核酸(源于核糖體)，諸如蛋白多糖或多糖類膜物質，以及致病菌的提取物。
這些疫苗利用特異性抗原，適應于確定的特異性，微生物感染。
然而，抗原能力主要取決于微生物細胞的核糖核酸(尤其核糖體)。競爭性免疫細胞直接利用核糖核酸作為活性載體。
為了建立我們新型的免疫復合劑，以便替代細菌血清型抗原，我們將核糖核酸(源于優選核糖體)與存在于Ⅲ型膠原蛋白中的一個糖蛋白類的氨基酸序列(以共價鍵結合)偶聯(人體中，膠原蛋白近似表示機體的蛋白層；Ⅲ型被選用于它的氨基酸序列，同時由于它基本上存在于管壁和真皮中)。
另外，核糖核酸已被應用于非細胞疫苗的制備中(參見，Infect.andImmunity，1，574-82，1970)。這個核糖核酸被相連接的因子所穩定。
在我們的復合劑中，我們利用用來建立核糖體核糖核酸相同的菌種作為細胞膜部分的穩定劑。
上述膜部分包含了全部的多糖肽物質。另外，此類物質作為其它通用免疫輔助劑已眾所周知。
然而，這并不違背需要具有與那些通過提取其核糖體而獲得相同微生物的相同膜部分(葡聚糖或多糖蛋白)。
關于所發明疫苗復合劑的組成A.所應用的源于核糖體，核糖核酸可以通過提取如下菌種而獲得。
如下列舉有限的幾個菌種-Klebsiellapneumoniae(肺炎克雷伯氏菌)-Streptococcus(pneumoniaeetpyogenes)(肺炎鏈球菌和化膿鏈球菌)-Staphilococcusaureus(金黃色葡萄球菌)-Serratiamarcescens(黏質沙雷氏菌)-Escherichiacoli(埃希氏大腸桿菌)-Salmonellatyphimurium(鼠傷寒沙門氏菌)-Corynebacterium(granulosam，parvum，acnts))；(棒桿菌)-Mycobacterium(tuberculosis，smegmatis，chelonei)(結核分枝桿菌，解皂菌狀桿菌，龜分枝桿菌)-Hemophilusinfluenzae(流感嗜血菌)-PneumocoquetypeⅡ(Ⅱ型肺炎球菌)-Rothiadentocariosus-Bacteriumcoli(腸細菌)-Shigelladysentariae(痢疾志賀氏菌)
-Enterococcus(腸道球菌)-Nocardia(asteroides[星型諾卡氏菌]，brasiliensis，rhodocrans，opaca[不透明諾卡氏菌]，rubra[紅色諾卡氏菌])(諾卡氏(放線)菌)-BacilledeCalmetteetGuerin(結核菌苗)這些核糖核酸的平均分子量介于5.104和108道爾頓之間。
有關此類核糖核酸的制備已有多種工業方法，作為一個例子我們引用發表在“InfectandImmunity，1，574-82，1970”中有關核糖核酸的提取過程將所用細菌磨碎后進行分段沉降，其間核糖體蛋白被溶解，而沉淀的核糖核酸用鏈霉蛋白酶處理，最后再用離子交換色譜純化。
如果核糖核酸用酶學方法獲得，最后的純化可以用分子篩色譜進行純化。重點參見如圖文獻-C.EHRESMAN(1972)-Biochimie，54，901-H.KAGAWA(1972)-J.Biochem.，(1972)，827-M.SANTER(1973)-J.Bact，116，1304-NOMURA(1974)-Ribosomes，Ed.ColdSpringHarborLaboratoryB.所用的細菌細胞膜部分可以通過提取如下菌種而獲得，下表給出有限的幾個菌種。
1-莢膜多糖-Klebsiellapneumoniae(肺炎克雷伯氏菌)-Streptococcuspneumoniae(肺炎鏈球菌)-Hemophilusinfluenzae(流感嗜血菌)-Escherichiacoli(埃希氏大腸桿菌)肺炎克雷伯氏菌-C.ERBING，L.KENNE，B.LINBERG，J.LONNGREN(1976)-StructuralstudiesofthecapsularpolysaccharideofKlebsiellapneumoniaetypeI(Carbohydr.Res.，50(1976)115-20).
-W.NIMMICH(1968)-ZurIsolierungundqualitativenBausteianalysederK.AngigenvonKlebsiellen(Med.Mikrobio.undImmunol.，154，117，131).
-C.RICHARD(1973)-Etudeantigeniqueetbiochimiquede500souchesdeKlebsiella(Ann.Biol.Clin.，1973)肺炎鏈球菌-F.KAUFFMANNetE.LUND(1954)(Int.Bull.Bact.Nomencl.4，125-28)-FELTONetOTTINGER(J.ofBacteriology，194243，94，105)-M.COLIN，M.D.MACLEODetcoll.-Preventionofpneumococcalpneumoniaebyimmunizationwithspecificcapsularpolysaccharides(J.Exp.Med.，1945，82，445-64)-A.R.DOCHEZetO.T.AVERY-TheelaborationofspecificsolublesubstancebyPneumocococcusduringgrowth(1971)(J.Exp.Med.26，477-93).
-WESTPHALetLUDERITZ(1952)(Z.Naturf.7B，148)-C.P.J.GLAUDEMANSetH.P.TREFFERS-AnimprovedpreparationofthecapsularpolysaccharidefromDiplococcuspneumoniae(Carbohydr.Res.1967，4，181-84)流感嗜血菌(多核糖磷酸型莢膜多糖)-P.ANDERSONetcoll.(1972)-Immunizationofhumanswithpolyribosephosphate，thecapsularantigenofHemophilusinfluenzaetypeB(J.ofClin.Invest.，vol.51，1972，39-44)-P.ANDERSONetcoll.(1977)-IsolationofthecapsularpolysaccharidefromsupernatantofHemophilusinfluenzaetypeB(Infect.andImmun.，1977，15(2)，472-77).
埃希氏大腸桿菌(莢膜多糖)-LUDERITZetcoll.(1977)-Somaticandcapsularantigensofgram-negativebacteria(Compr.Biochem.26A，105-228)2-膜脂多糖(LPS)-Corynebacterium(avidum，bovis，diphteriae，enzymicum，equi，fascians，flaccum，facients，flavidum，fusiforme，granulosum，helvolum，hypertrophicans，insidiosum，liquefaciens，parvum，paurometabolum，pyogenes，rumescens，xerosis)(棒桿菌)-etlesgram-moins(革蘭氏陰性菌)-Klebsiella(pneumoniaeetrhinoscleromatis)(肺炎克雷伯氏菌和鼻硬結克雷伯氏菌)-Salmonellatyphimurium(鼠傷寒沙門氏菌)-Serratia(marcescens，corralina，indica，plymuthica，kiluea)(沙雷氏菌)-Neisseriameningitidis(腦膜炎奈瑟氏球菌)-Escherichiacoli(埃希氏大腸桿菌)-C.ERBINetcoll.(1977)-StrictualstudiesontheKlebsiellaLPS(Carbohydr.Res.，56，377-81).
-C.B.CASTORetcoll.(1971)-CharacteristicsofahighlypurifiedpyrogenicLPSofKlebsiellapneumoniae(J.ofPharm.Sci.，60，(10)，1578-80).
-K.FUKUSHI(1964)-ExtractionandpurificationofendotoxinfromEnterobacteriaceae:acomparisonofselectedmethodsandsources(J.ofBacteriol.87，(2)，391-400).
-G.A.LIMJUCO-StudiesonthechemicalcompositionofLPSfromNeisseriameningitidisgroupB(J.ofGen.Microbiol.1978，104，187-91).
-G.A.ADAMS(1967)-ExtractionofLPSfromgram-negativebacteriawithDMSO(Canad.J.Biochem.，45，422-26).
-K.G.JOHNSON(1976)-ImprovedtechniquesforthepreparationofbacterialLPS(Canad.J.Microbiol.(22)，29-34).
-Y.B.KIMetcoll.(1967)-BiologicallyactiveendotoxinsfromSalmonellamutans(J.ofBacteriol.，94，(5)，1320-26).
3-膜蛋白-Escherichiacoli(埃希氏大腸桿菌)-Serratiamarcesens(黏質沙雷氏菌)-Streptococcuspyogenes(化膿鏈球菌)-Salmonellatyphimurium(鼠傷寒沙門氏菌)埃希氏大腸菌-S.F.STIRMetcoll.(1967)-Episome，carriedsurfaceantigenK88ofEscherichiacoli(J.ofBacteriol.，93，(2)，731-39).
-S.J.BETZetcoll.(1977)-ChemicalandbiologicalpropertiesofaproteinrichfractionofbacterialLPS(J.ofImmunol.，119，(4);1475-81).
黏質沙雷氏菌-W.WOBER(1971)-Studiesontheproteinmoietyofendotoxinfromgram-negativebacteria，characterisationoftheprotein-moietingisolatedbyaceticacidhydrolysisofendotoxinofSerratiamarcescens.
化膿鏈球菌-M.K.WITTNER(1977)-Homologousandheterologousprotectionofmicewithgroup-AStreptococcalMproteinvaccine(Infect.andImmun.，1977，15，(1)，104-8).
鼠傷寒沙門氏菌-N.KUUSIetcoll.(1979)-Immunizationwithmajoroutermembraneproteininexpetimentalsalmonellosisofmice(Infect.andImmun.，1979，25，(3)，857-62).
-C.BARBERetcoll.(1972)-TheprotectiveroleofproteinsfromSalmonellathyphimuriumininfectionofmicewiththeirnaturalpathogen(Rev.Immunol.，36，77-81).
-G.DELORD(1979)-Etuded′unantigènevaccinantcontenudanslesurnageantdeculturedeSalmonellathyphimurium，soucheM-206，thèsedemédecinedeLyonn°428，1979.
-G.W.GOODMAN(1979)-CharacterizationofthechemicalandphysicalpropertiesofanovelB-lymphocyteactivatorendotoxinprotein(Infect.andImmun.，1979，24(3)，685-96).
4-磷壁質和脂磷壁質鏈球菌、葡萄球菌和乳桿菌(革蘭氏陽性菌)，表面由磷壁質構成，此類物質是由磷酸二酯橋連接的甘油聚合體)。
如下文章闡述獲取過程-M.M.BURGER(1966)-Teicho c acids:antigenic determinants，chain separation，and their location in the cell wall(Microbiology 56，910-17).
-K.W.KNOX(1973)-Immunological properties of teicho c acids (Bacteriol.Reviews，37，21，215-57).
-G.A.MILLER(1976)-Effects of streptococcal lipoteicho c acid on host response in mice(Infect.and Immun.，1976，13，(5)，1408-17).
-A.J.WICKEN et coll.(1975)-Lipoteicho c acids:a new class of bacterial antigens(Science，187，1161-67).
不同的可行劑量核糖核酸* FISKE et SUBBAROW-Dosage de phosphore.Chromatographie HPLC sur colonne échangeuse d′ions pour le contr le qualitatif(J.Biol.Chem.(1926)，66，375).
蛋白質*LOWRY(J.Biol.Chem.(1951)，193，265-75).
己糖*T.A.SCOTT-Dosagecolorimétr.àl′anthrone(Anal.Chem.(1953)，25，1956-61).
己糖胺*L.A.ELSON(Biochem.J(1953)，27，1824-28).
脂多糖*J.JANDAetE.WORK(FebsLetters，1971，16(4)，343-45).
C-其它免疫輔助因子，除膜部分之外有-Ⅲ型膠原蛋白-氯化鈉所用Ⅲ型膠原蛋白特征如下a-如下順序相連的氨基酸序列(濃度以克/千克表示)-天冬氨酸AA51.5-羥基脯氨酸HP107.0-蘇氨酸TH16.1-色氨酸SE27.8-谷氨酸AG95.9-脯氨酸PR124.0-甘氨酸GL149.0-丙氨酸AL87.9-纈氨酸VA23.3-蛋氨酸ME7.5-異亮氨酸IL14.4-亮氨酸LE27.8
-酪氨酸TY6.7-苯丙氨酸PA14.4-賴氨酸LY28.6-組氨酸HI5.5-精氨酸AR73.0b.性狀分析如下-顏色淺黃白色-表觀密度250克/升-濕度6%-10%溶液pH6.9-40℃時Engler粘度(17.75%溶液)2.5-脂肪含量0.9%-灰分含量2.2%-鐵+銅+鈣含量462毫克/千克-重金屬弧光發射光譜下未檢測出-元素分析C46.80%H7.10%N14.96%有關所發明免疫復合劑的組成由核糖核酸或核糖體核糖核酸片段，膜部分(例如肺炎克雷伯氏菌的蛋白多糖)和Ⅲ型膠原蛋白相結合，再加上氯化鈉和一個抗炎劑，可以通過施用微劑量而不產生任何毒性，而獲得一個高水平保護和痊愈作用。
優先選用的劑型是上述成分的注射劑，然而在附有一個藥物使用說明情況下，采用其他劑型和/或其他支持劑或可兼容的添加劑也是可行的。
免疫復合劑作用機制具文獻報道，上述免疫治療復合劑具有淋巴激活素的特性，可以固定在巨噬細胞上而抑制病毒在細胞內的生長。
1974-75A.S.和G.P.YOUMANS證實應用不同的抑制劑可以對核糖核酸的免疫反應起抑制作用。
我們發現所發明的免疫復合劑恰恰對V.I.H.逆轉錄病毒的復制產生相同的抑制作用。
YOUMANS一直從事于一個只能寄生在細胞內的細菌菌株的研究。
自從1972年VENNEMAN和同事闡述真正的抗原可能是結合在核糖核酸上而作為它的一個輔助因子。他們用核糖體核糖核酸免疫小家鼠，此核糖核酸由苯酚在65℃下提取取鼠傷寒沙門氏菌－菌株的核糖體而獲得。免疫三十天后的動物比用活菌株疫苗保護效果更好(減緩的)。
尤其證實了保護作用與注射的核糖核酸量有關。
迄今已知，從肺炎鏈球菌提取的核糖體核糖核酸可以誘導天然體液的免疫的保護作用，而從肺炎克雷伯氏菌提取的核糖體核糖核酸可以誘導天然細胞免疫的保護作用。
DUSSOURDd’HINTERLAND，FONTANCES及同事(法國里昂軍事醫學研究中心微生室)進行的初步實驗已經表明，注入小鼠和豚鼠活體內的復合劑對肺泡的巨噬細胞可產生作用。
當用致溶血空斑的酸性磷酸酯與小鼠的脾細胞直接接觸時重新發現了這一“短暫”效應。
在DUSSOURDd’HINTERLAND對核糖體疫苗進行的免疫學研究中，當此類疫苗在FREUND輔助劑(不完全)或克雷伯氏菌膜蛋白多糖存在下施用于動物體時，它們可以誘導O.F.品系雌性小鼠體內特異性抗體的產生。
對于我們的免疫復合劑過程而言，當體液和細胞免疫被激活以后，緊接著對V.I.H.產生一個非特異性的但又極為重要的作用。由于恰恰是機體本身被激起而抵抗感染細胞(P24抗原血在假完全態下減弱至零)所以我們可以累積這一作用而產生一個“病毒壞死因子(V.N.F)。
S.ROSENBERG的治療過程，盡管與我們的近似，但不完全一致。他將一個可以產生腫瘤壞死因子(T.N.F.)的基因固定在人的脫氧核糖核酸上。此基因在埃希氏大腸桿菌克隆和繁殖后，借助一個病毒載體將其引入我們在腫瘤中遇到的T淋巴細胞(殺手)。
由于采用的輔助劑(膜蛋白多糖，Ⅲ型膠原蛋白、氯化鈉的結合體)對核糖核酸(非特異性細菌核糖體)產生的調理素作用，我們的治療機理允許產生一個天然克隆。
此克隆不僅誘導免疫作用來抵抗抗-HIV抗體的個體基因型，而且產生一個抗體來抵抗病毒對CD4分子的連接部位。為了減弱或抑制抗CD4自動免疫反應(CD4淋巴起作用)，當用此免疫復合劑治療時必須使用類皮質激素陪塞米松二磷酸鹽20-60mg溶液，靜脈、肌肉注射。
此作用不僅伴隨產生一個內源干擾素，而且使天然殺傷(N.K.)細胞活化。
因此，我們的免疫調節復合劑的目標就是當一個病毒感染源帶入機體內時，誘導一個免疫反應來陰抑或至少降低(直至可自動防御閾值)感染原的增值。
與其他治療劑相比，我們的治療劑的新穎就在于在感染之前減緩或消除已存在的抑制細胞劑而發生作用。
我們的治療通過細胞和/或體液的防御機制而產生抗愛滋反應。
結論我們的治療復合劑通過定向優化而產生核糖核酸分子，這些分子與病素蛋白接合，而阻斷愛滋逆轉錄病毒的感染。
免疫復合劑的給藥途徑此免疫復合劑可以口服，但首選方法是腸胃道外給藥；或者靜脈內直接注射；或者緩慢滴注；或者皮下注射；上述給藥途徑實驗證明是有效的。
日服量和服用次數主要取決于患者的狀況。由于復合劑的低毒性，高劑量不具有任何危險。
靜脈注射方法，平均每月連續用藥一周，此周的每一天同時滴注500毫升無菌溶液。
-0.9%氯化鈉-40微或膜糖部分(肺炎克雷伯氏菌的蛋白多糖)-22微克核糖核酸(核糖體)*肺炎雙球菌7微克*化膿鏈球菌(A12)7微克*肺炎克雷伯氏菌7微克*流感嗜血菌1微克
-10微克上述Ⅲ型膠原蛋白-8毫克陪塞米松二磷酸鈉(或2毫升注射液)對于應該采用急救方法的患者，緩慢靜脈注射之后，緊接著進行皮下注射治療。
-40微克膜糖部分(肺炎克雷伯氏蛋白多糖)-22微克核糖核酸(核糖體)*肺炎雙球菌7微克*化膿鏈球菌(A12)7微克*肺炎克雷伯氏菌7微克*流感嗜血菌1微克-10微克上述Ⅲ型膠原蛋白-0.5毫升0.9%氯化鈉-4毫克(陪塞米松二磷酸(或1毫升注射液)此治療可連續進行幾個月，直至血清陽性完全呈陰性反應(即P24抗原=0)下述有限的幾個病歷，用來闡述我們治療性免疫復合劑的具體效果。
實施例1J.A……先生，65歲，血友病，感染于八年前的一次輸血。愛滋病和肝炎(組ⅣC2)。1991年9月出現嚴重代償性失調。住院，虛弱無力，體重減輕，腸代謝失調，鼻竇炎，等，……AZT治療無效。
1992年9月-接受我們免疫復合劑治療靜脈注射幾個療程后，于1992年12月再進行皮下注射治療。
目前，我們證實-整體狀況良好-體重增加
-P24抗原血清呈陰性反應實施例2A.A……夫人，59歲，上述患者配偶，1992年5月出現嚴重代償性失調，虛弱無力和體重減輕(組ⅣA)。
1992年9月-接受我們的免疫復合劑治療靜脈注射幾個療程后，于1992年12月再進行皮下注射治療。
目前，我們證明-整體狀況良好-增加至原來體重-P24抗原血清呈陰性反應實施例3E.C……先生，30歲，感染于六年前性關系，1988年診斷為愛滋病(組ⅣC1)。1992年，患者虛弱無力，肺氣腫(接受大劑量AZT+Bactrim治療)。
1992年9月-接受我們的免疫復合劑治療只進行皮下注射幾個療程，同時停止所有其他治療。
目前，我們確認-整體狀況極佳(已可以從事職業性活動)-P24抗原血清呈陰性反應根據患者的要求以及他們所正在接受治療的確實無效，應用我們的免疫復合劑已對其中各類患者進行了治療。
權利要求
1.抗愛滋免疫調節復合劑，是含有如下組分的一個復合物-所選細胞核糖核酸，所述細菌膜部分-糖肽和脂多糖-和Ⅲ型膠原蛋白氨基酸。
2.根據權利要求1的免疫調節復合劑，其特征在于該免疫調節復合劑可以識別兩種分子，這些分子由可以確保結合于一個靶標的氨基酸功能臂與一個核糖核酸基因臂偶聯而成，而且此基因臂必須有與功能臂組成相對應的密碼記錄。
3.根據權利要求1或2的免疫調節復合劑，其特征在于它應具有產生抑御病毒結合部位的(尤其對CD4分子)定向抗體和產生內源干擾素。
4.根據權利要求1至3之一的免疫調節復合劑，其特征在于，針對血清陽性這一問題，該免疫調節復合劑誘導一個個體基因型疫苗來抵御抗-HIV抗體的個體基因型，從而達到使P24抗原血呈陰性的效果。
5.根據權利要求1至4之一的免疫調節復合劑，其特征在于，該免疫調節復合劑可以有如下不同的給藥途徑滴注，靜脈，皮下注射，化學電極裝置或其他，同時，并用氯化鈉。
6.根據權利要求1至5之一的免疫調節復合劑，其特征在于它的劑型應允許同時施用主要抗炎藥物(皮質激素類)，作為免疫抑制劑來抑制或減弱抗-CD4自動免疫反應(此反應作用于CD4淋巴)。
全文摘要
非特異性治療免疫復合劑通過免疫調節起作用，提供調節機體的天然抵御能力。本發明的藥物可以使愛滋的P24抗原呈陰性反應。它主要由核糖核酸，微生物膜的特定部分，尤其，氨基酸順序，氯化鈉和抗炎甾類藥物按確定的比例組成。根據發明所言，此藥物尤其適用于治療后天免疫缺乏癥。
文檔編號A61K31/70GK1106980SQ9419016
公開日1995年8月16日 申請日期1994年2月18日 優先權日1993年3月31日
發明者費爾南德·納貝·托羅索昂 申請人:費爾南德·納貝·托羅索昂