專利名稱：犬類精子超低溫冷凍保存防凍液的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種犬類精子超低溫冷凍保存防凍液，用于犬類精子超低溫冷凍保存以及利用凍精進行人工授精繁殖育種，屬于動物繁殖技術領域。
背景技術：
犬作為最早馴養的家畜動物，在人類生產生活中發揮著特有的作用，優良種犬的社會需求更是與日俱增。我國犬的品種不僅以特有的使用和觀賞價值著稱于世界，而且對世界著名品種的形成產生過重要的影響，如西藏的馬士迪夫(獒)、西施犬、北京犬、西藏拉薩犬(埃普索犬)等，作為珍貴犬的品種資源，已經成為世界人民的共同財富。我國城鄉居民隨著經濟條件的改善，飼養寵物的人越來越多，人們已經意識到飼養寵物犬所帶來的巨大經濟效益，已把人工飼養寵物犬作為一種新興飼養業來發展，寵物犬除了進入人類的物質生活外，逐漸進入人類的精神生活。目前國內各地區已經廣泛開展了犬類的人工養殖，現有寵物犬上億只。然而在犬類長期養殖過程中，由于飼養及人工繁殖的條件限制，特別是雜交育種技術的條件限制直接導致我國人工飼養的犬類品種質量退化，在國際寵物犬市場上逐漸失去競爭力，給養犬者造成了巨大的經濟損失，嚴重阻礙我國犬類飼養業的發展。
在世界寵物犬市場中可以發現，名貴犬種正以其獨特的身價、良好的開發前景逐漸被人們所接受，優質寵物犬將以它高品質受到更多人的青睞。隨著人類飼養技術、繁殖水平的提高，寵物飼養種類越來越多。同我國飼養的犬類相比，國外犬類品種繁多、質量較高，尤其是新型品種價格昂貴。其主要原因是人工繁殖技術的應用，通過人工授精技術雜交改良原有自繁犬類品種，既能克服不同品種間自然交配難題，又能通過雜交優勢培育出新型品系，產生良好的經濟效益。因此，如何進一步保存、利用、開發我國的犬種資源，是一項非常重要的研究課題，深入開展此方面的研究工作，必將對我國的社會、經濟、生活產生難以估量的積極作用。人工授精繁殖技術包括利用稀釋后的鮮精液和解凍后的凍精輸精兩種方式，冷凍精液及其人工輸精，將會大大提高良種公犬的利用率和利用價值，其中涉及到的關鍵性技術就是稀釋液及防凍液的研制。研究表明，凍融精子的質量如何，例如活力、質膜完整率及頂體完整率的高低直接影響人工輸精的受孕率。犬類精子與其它犬科動物的精子類似，其在凍融過程中對低溫損傷的抗性較弱，冷凍復蘇后精子活力下降，質膜完整率及頂體完整率亦明顯降低，人工授精的受孕率及胎仔數均低于自然繁殖(Farstad，W.等，1996，Animal Reproduction Science.42251～260.)。因此，如何長期低溫保存優質犬類精液并充分利用優良種源是目前本領域亟待解決的問題。
目前，犬類的人工授精尤其是精液的超低溫冷凍保存及利用凍精繁殖很受人們的關注，但遠未達到牛、羊等家畜動物水平，有關基礎理論與技術環節尚需進一步研究探討，其中防凍液的配制、冷凍及解凍程序是亟待解決的難題。國內外常用的防凍液配方有配方一三羥甲基胺基甲烷(2.4％)、檸檬酸(1.3％)、果糖(1％)甘油(6.4％)、卵黃(20％)、青霉素、鏈霉素各50萬單位。用此配方制作凍精時，精子的平均復蘇率為46.7％，凍融精子活力為0.28，精子復蘇后的存活時間為3小時以上。(王力波等，黑龍江畜牧獸醫，1991，535-36.)。
配方二三羥甲基胺基甲烷(240mM)、檸檬酸(63mM)、糖類(70mM)、甘油(8％v/v)、卵黃(20％v/v)、青霉素(10萬IU)、蒸餾水定容100mL。用此配方制作凍精時，凍融精子平均活力為0.5，質膜完整率及頂體完整率分別為70％、45％(Yildiz et al，Thefiogenology，2000，54579-585)。
配方三三羥甲基胺基甲烷(2.4g)、檸檬酸(1.4g)、葡萄糖(0.8g)、甘油(4mL)、卵黃(20mL)、青霉素(0.06g)、蒸餾水定容100mL。用此配方制作凍精時，凍精復蘇后體外39℃培養4小時平均活力為0.10，活率及頂體完整率分別為24.0％、49.4％；( et al，Theriogenology，1999，50163-174)。利用凍精人工輸精繁殖的受孕率為84％。(Rota et al，Theriogenology，1999，511045-1058)。
氨基-鈉-十二烷基硫酸酯Orvus ES Paste(OEP)是一種表面活性劑，其組成中含有十二烷基硫酸鈉(SDS)復合物，是豬和犬類動物精液冷凍時常用的稀釋防凍成分(Pursel et al，J.Anim.Sci.47198-202；Rota et al，Theriogenology，1999，511045-1058； et al，Theriogenology，1999，50163-174)，主要作用是防止低溫對精子的損傷，對精子膜結構有保護、修補作用，能夠提高凍融精子活力、存活率及質膜完整率(Tsutsui et al，J.Vet.Med.Sci，2000，62(5)533-538)。N-乙酰基-D-葡萄糖胺(N-acetyl-D-glucosamine)是幾丁質的主要成分，存在于昆蟲和甲殼動物的外骨骼中，屬于多糖同聚物，在細胞外表層、細胞間隙及結締組織形成時提供主要的結構成分，使動植物組織有彈性和韌性。研究報道N-乙酰基-D-葡萄糖胺通過人體腹膜細胞和成纖維細胞能有效激活體內葡萄胺聚糖的合成(Breborowicz等，1998，Adv.Perit.Dial.14，31-35.)。另據報道，N-乙酰基-D-葡萄糖胺已成功應用于豬精液冷凍稀釋液中(Yi等，2002，AnimalReproduction Science.74，187-194.)，但關于OEP和N-乙酰基-D-葡萄糖胺同用在犬類精液防凍劑方面的研究目前還沒有報道。

發明內容
本發明的目的在于針對現有技術的不足，提供一種犬類精子超低溫冷凍保存防凍液，使之能有效延長犬類凍融精子的存活時間，有利于維持犬類精子的質膜完整性及頂體完整性，提高犬類凍精繁殖的受孕率。
為實現這樣的目的，本發明的犬類精子冷凍防凍液采用一種表面活性劑氨基-鈉-十二烷基硫酸酯(OEP)及細胞培養液成分N-乙酰基-D-葡萄糖胺，同時添加果糖、三羥甲基胺基甲烷(Tris)、檸檬酸、卵黃、甘油或二甲基亞砜及殺菌劑，用蒸餾水配制而成。
本發明研制的犬類精子冷凍防凍液具體包含如下成分氨基-鈉-十二烷基硫酸酯(OEP) 0.05～2.50毫升N-乙酰基-D-葡萄糖胺 0.01～0.10克果糖0.45～3.10克檸檬酸 0.50～2.30克三羥甲基胺基甲烷1.10～3.90克卵黃15.0～30.0毫升甘油或二甲基亞砜2.0～8.0毫升殺菌劑 1000UI/毫升蒸餾水定容 100毫升。
防凍液pH值為6.25～6.95，滲透壓為300-350mOsmo/L。
本發明所述殺菌劑可選擇青霉素或慶大霉素，也可以為其他具有殺菌作用的抗生素。
優選的防凍液(1)含有如下成分氨基-鈉-十二烷基硫酸酯(OEP)0.50毫升N-乙酰基-D-葡萄糖胺0.06克果糖 1.20克檸檬酸 1.65克三羥甲基胺基甲烷 3.15克卵黃 20.0毫升甘油 3.0毫升殺菌劑 1000UI/毫升蒸餾水定容100毫升。
防凍液pH值為6.65，滲透壓為320mOsmo/L。
優選的防凍液(2)含有如下成分氨基-鈉-十二烷基硫酸酯(OEP)0.75毫升N-乙酰基-D-葡萄糖胺0.05克果糖 1.65克檸檬酸 2.25克三羥甲基胺基甲烷 1.85克卵黃 20.0毫升二甲基亞砜 4.0毫升殺菌劑1000UI/毫升蒸餾水定容100毫升。
防凍液pH值為6.60，滲透壓為325mOsmo/L。
本發明的精子冷凍防凍液可按本領域的常規方法配制，按所述含量分別加入上述成分，再加蒸餾水，配成100毫升溶液即可。配制成的稀釋液pH值為6.25～6.95，滲透壓為300～350mOsmo/L，可為犬類精子體外存活提供最佳基質條件。
本發明的精子冷凍防凍液中的果糖成分為精子在體外代謝的能量來源，三羥甲基胺基甲烷、檸檬酸可維持防凍液環境與精子內環境的滲透壓平衡。此外，在本發明的防凍液中還加入青霉素或慶大霉素(1000UI/毫升)殺菌劑，提高該防凍液的常溫及低溫保存效果。
本發明使用由氨基-鈉-十二烷基硫酸酯(OEP)、N-乙酰基-D-葡萄糖胺等多種成分組成的防凍液，對犬類精子進行細管凍精試驗，并用凍融精子進行人工授精，研究該防凍液對犬類冷凍精子存活時間及凍融精子質量的影響，結果表明由氨基-鈉-十二烷基硫酸酯(OEP)、N-乙酰基-D-葡萄糖胺等多種成分組成的防凍液，能有效延長犬類凍融精子的存活時間、保護凍融精子膜結構的完整性，表現出了良好的精子保護作用和防凍效果。
與現有技術相比，本發明的防凍液具有如下優點1、能夠有效延長犬類凍融精子的存活時間，提高犬類凍融精子的質膜完整率及頂體完整率，提高人工授精的受孕率；2、該防凍液中所含的N-乙酰基-D-葡萄糖胺成分，能夠有效促進氨基-鈉-十二烷基硫酸酯的乳化功能，增強氨基-鈉-十二烷基硫酸酯及卵黃的保護作用；3、配制簡單，取材容易，成本價格低廉，易于推廣。
本發明的犬類精液防凍液，適用于犬類細管凍精人工輸精繁殖以及犬類精液超低溫冷凍后的長期保存和長途運輸后輸精，它可明顯提高犬類精子的生存指數，保持其授精活力。
具體實施例方式
以下通過具體的實施例對本發明的技術方案作進一步描述。以下實施例的作用應被理解為是對本發明的詮釋而非對本發明的任何方式的限制。
實施例1(防凍液1)先稱取0.06g N-乙酰基-D-葡萄糖胺，溶于10ml蒸餾水中，使其完全溶解。然后分別量取20mL卵黃、3mL甘油、0.50mL氨基-鈉-十二烷基硫酸酯(OEP)并將三者均勻混合。然后稱取1.20g果糖溶于50ml蒸餾水中，待完全溶解后分別加入3.15g三羥甲基胺基甲烷、1.65g檸檬酸，按上述順序逐一加入，添加時待先加入的試劑完全溶解后再加入后一種，溶解后把三種制劑相混合，然后加入10萬單位青霉素或慶大霉素，最后蒸餾水定容100ml，定容后pH值為6.65，滲透壓為320mOsmo/L，放入5℃冰箱保存。所有制備過程均在無菌條件下進行。該配方對犬類精液超低溫冷凍保存時抗低溫損傷的效果極佳。使用時按1∶3比例與犬類精液相混合，同時要保持防凍液的溫度與待冷凍精液溫度相同。
使用按實施例1方法制備的防凍液，應用與犬類精液超低溫冷凍時，測定冷凍精子復蘇后凍融精子的存活時間、精子活力(采用相差顯微鏡檢測精子活力)、精子質膜完整率及頂體完整率(CTC-Hoechst 33258活體熒光染料聯合染色法檢測精子頂體完整率)。結果表明22℃條件下凍融精子的存活時間為58小時、保存4小時后凍融精子活力為0.22、精子質膜完整率平均為31％，頂體完整率為53％；利用該凍精(冷凍復蘇后0.5小時)人工輸精繁殖母犬受孕率為85.8％。
實施例2(防凍液2)先稱取0.05g N-乙酰基-D-葡萄糖胺，溶于10ml蒸餾水中，使其完全溶解。然后分別量取20mL卵黃、4mL二甲基亞砜(DMSO)、0.75mL氨基-鈉-十二烷基硫酸酯(OEP)并將三者均勻混合。然后稱取1.65g果糖溶于50ml蒸餾水中，待完全溶解后分別加入1.85g三羥甲基胺基甲烷、2.25g檸檬酸，按上述順序逐一加入，添加時待先加入的試劑完全溶解后再加入后一種，溶解后把三種制劑相混合，然后加入10萬單位青霉素或慶大霉素，最后蒸餾水定容100ml，定容后pH值為6.60，滲透壓為325mOsmo/L，放入5℃冰箱保存。所有制備過程均在無菌條件下進行。該配方對犬類精液超低溫冷凍保存時抗低溫損傷的效果極佳。使用時按1∶3比例與犬類精液相混合，同時要保持防凍液的溫度與待冷凍精液溫度相同。
使用按實施例3方法制備的防凍液，應用與犬類精液超低溫冷凍時，測定冷凍精子復蘇后凍融精子的存活時間、精子活力(采用相差顯微鏡檢測精子活力)、精子質膜完整率及頂體完整率(CTC-Hoechst 33258活體熒光染料聯合染色法檢測精子頂體完整率)。結果表明22℃條件下凍融精子的存活時間為55小時、保存4小時后凍融精子活力為0.20、精子質膜完整率平均為32％，頂體完整率為51％；利用該凍精(冷凍復蘇后0.5小時)人工輸精繁殖母犬受孕率為83.4％。
實施例3(防凍液3)先稱取0.05g N-乙酰基-D-葡萄糖胺，溶于10.0ml蒸餾水中，使其完全溶解。然后分別量取20.0mL卵黃、6.0mL甘油、0.70mL氨基-鈉-十二烷基硫酸酯(OEP)并將三者均勻混合。然后稱取2.65g果糖溶于50ml蒸餾水中，待完全溶解后分別加入1.15g三羥甲基胺基甲烷、0.95g檸檬酸，按上述順序逐一加入，添加時待先加入的試劑完全溶解后再加入后一種，溶解后把三種制劑相混合，然后加入10.0萬單位青霉素或慶大霉素，最后蒸餾水定容100ml，定容后pH值為6.85，滲透壓為335mOsmo/L，放入5℃冰箱保存。所有制備過程均在無菌條件下進行。該配方對犬類精液超低溫冷凍保存時抗低溫損傷的效果極佳。使用時按1∶3比例與犬類精液相混合，同時要保持防凍液的溫度與待冷凍精液溫度相同。
使用按實施例2方法制備的防凍液，應用與犬類精液超低溫冷凍時，測定冷凍精子復蘇后凍融精子的存活時間、精子活力(采用相差顯微鏡檢測精子活力)、精子質膜完整率及頂體完整率(CTC-Hoechst 33258活體熒光染料聯合染色法檢測精子頂體完整率)。結果表明22℃條件下凍融精子的存活時間為58小時、凍融精子活力為0.52、精子質膜完整率平均為58％，頂體完整率為63％。
實施例4(防凍液4)先稱取2.18g果糖溶于50ml蒸餾水中，待完全溶解后分別加入1.14g檸檬酸、1.65g三羥甲基胺基甲烷，按上述順序逐一加入，添加時待先加入的試劑完全溶解后再加入后一種，溶解后混合均勻并放入5℃冰箱保存，使用時取出并調整至所要保存精液的溫度或者人工輸精的溫度。稱取0.05g N-乙酰基-D-葡萄糖胺，溶于調整好溫度的防凍液中。然后分別量取20mL卵黃、4mL甘油、1.00mL氨基-鈉-十二烷基硫酸酯(OEP)并將三者均勻混合。把上述兩種制劑相混合，最后加入10萬單位青霉素或慶大霉素，最后蒸餾水定容100ml，定容后pH值為6.75，滲透壓為315mOsmo/L。所有制備過程均在無菌條件下進行。該配方對犬類精液超低溫冷凍保存時抗低溫損傷的效果極佳。使用時按1∶3比例與犬類精液相混合，同時要保持防凍液的溫度與待冷凍精液溫度相同。
使用按實施例4方法制備的防凍液，應用與犬類精液超低溫冷凍時，測定冷凍精子復蘇后凍融精子的存活時間、精子活力(采用相差顯微鏡檢測精子活力)、精子質膜完整率及頂體完整率(CTC-Hoechst 33258活體熒光染料聯合染色法檢測精子頂體完整率)。結果表明39℃條件下凍融精子的存活時間為46小時、保存4小時后凍融精子活力為0.18、精子質膜完整率平均為27％，頂體完整率為46％；利用該凍精(冷凍復蘇后0.5小時)人工輸精繁殖母犬受孕率為86.1％。
權利要求
1.一種犬類精子超低溫冷凍保存防凍液，其特征在于由氨基-鈉-十二烷基硫酸酯0.05～2.50毫升、N-乙酰基-D-葡萄糖胺0.01～0.10克、果糖0.45～3.10克、檸檬酸0.50～2.30克、三羥甲基胺基甲烷1.10～3.90克、卵黃15.0～30.0毫升、甘油或二甲基亞砜2.0～8.0毫升、殺菌劑1000UI/毫升，加蒸餾水至100毫升配制而成，防凍液的pH值為6.25～6.95，滲透壓為300～350mOsmo/L。
2.根據權利要求1的犬類精子超低溫冷凍保存防凍液，其特征在于由氨基-鈉-十二烷基硫酸酯0.50毫升、N-乙酰基-D-葡萄糖胺0.06克、果糖1.20克、檸檬酸1.65克、三羥甲基胺基甲烷3.15克、卵黃20.0毫升、甘油3.0毫升、殺菌劑1000UI/毫升，加蒸餾水至100毫升配制而成，防凍液的pH值為6.65，滲透壓為320mOsmo/L。
3.根據權利要求1的犬類精子超低溫冷凍保存防凍液，其特征在于由氨基-鈉-十二烷基硫酸酯0.75毫升、N-乙酰基-D-葡萄糖胺0.05克、果糖1.68克、檸檬酸2.25克、三羥甲基胺基甲烷1.85克、卵黃20.0毫升、二甲基亞砜4.0毫升、殺菌劑1000UI/毫升，加蒸餾水至100毫升配制而成，防凍液的pH值為6.60，滲透壓為325mOsmo/L。
4.根據權利要求1或2或3的犬類精子超低溫冷凍保存防凍液，其特征在于所述殺菌劑為青霉素或者慶大霉素。
全文摘要
本發明涉及一種犬類精子超低溫冷凍保存防凍液，屬于動物繁殖技術領域。由氨基－鈉－十二烷基硫酸酯(OEP)0.05～2.50毫升、N－乙酰基－D－葡萄糖胺0.01～0.10克、果糖0.45～3.10克、檸檬酸0.50～2.30克、三羥甲基胺基甲烷1.10～3.90克、卵黃15.0～30.0毫升、甘油或二甲基亞砜2.0～8.0毫升、青霉素或者慶大霉素殺菌劑1000UI/毫升，加蒸餾水至100毫升配制而成，防凍液的pH值為6.25～6.95，滲透壓為300～350mOsmo/L。本發明的防凍液能夠有效延長犬類精子超低溫冷凍保存的存活時間，提高犬類凍融精子的活力、質膜完整性及頂體完整性，提高凍精人工輸精的受孕率。
文檔編號A61K35/48GK1775020SQ200510111520
公開日2006年5月24日 申請日期2005年12月15日 優先權日2005年12月15日
發明者李新紅 申請人:上海交通大學