專利名稱：L－蘇糖酸鈣在治療骨折中的用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及L-蘇糖酸鈣的一種新用途，具體說是L-蘇糖酸鈣在預防和治療骨折中的用途。
背景技術：
骨折是指骨的結構連續性的中斷，它是一種常見的外科疾病。骨折分為外傷性骨折和病理性骨折，外傷性骨折是由暴力作用造成的骨折，而病理性骨折是由于骨本身有病理變化如老年性骨質疏松等再加上遭受一定程度的外力造成的骨折。
傳統上將骨折愈合分為四個階段(1)炎性階段；(2)軟骨痂階段；(3)硬骨痂階段；(4)再塑形階段。炎性階段是骨折后的立即反應。骨端與鄰近組織出現血腫，迅速發生急性炎癥反應，表現為血管擴張、血漿與白細胞滲出。軟骨痂階段是自腫痛消失到骨斷端纖維或軟骨組織連接的階段，此時血腫機化，破骨細胞清除殘留死骨，骨膜下骨開始形成。其特征是血管大量增加，骨痂內有毛細血管長入，細胞極其豐富。硬骨痂階段是從骨端有軟骨痂粘著到新骨形成。這階段相當于臨床和X線表現的骨折愈合，一般需3—4個月，骨痂從纖維軟骨性組織變為纖維骨，在骨端間出現膜性骨形成。再塑形階段是骨折端被新生骨連接后，逐漸適應新的功能的過程。
骨折愈合是組織修復程序極為獨特的過程。它與其它組織的修復不同，其它組織修復的結局是瘢痕形成，而骨的修復不是瘢痕形成，是通過骨的再生來實現的。因此成骨細胞的增殖在骨折愈合中起著決定性的作用。
另外，Lane從生物化學角度進行骨折愈合的分類(1)間充質階段，這階段合成I、II、III型膠原；(2)軟骨樣階段，以II型膠原為主；(3)軟骨類骨階段，以I、II型膠原為主；(4)成骨階段，以I型膠原為主。因此可見，膠原合成在骨折愈合中也起著非常重要的作用。
目前普遍認為，普通的鈣制劑對促進骨折的愈合沒有明顯的作用，而且也沒有發現明顯促進骨折愈合的其它藥物。治療骨折主要還是結合采取以下三種傳統手段1、骨折的整復；2、固定；3、功能鍛煉。

發明內容
因此，本發明的目的是提供一種L-蘇糖酸鈣的用途，具體說是在預防和治療骨折中的用途。
針對上述促進骨折愈合的因素，發明人研究了L-蘇糖酸鈣對成骨細胞的增殖、分化和骨形成功能的刺激作用，以及L-蘇糖酸鈣對促進I型骨膠原合成的作用。結果令人驚奇地發現，L-蘇糖酸鈣既能促進成骨細胞的增殖、分化及礦化功能，同時又能促進體外培養成骨細胞I型原膠原mRNA的表達，從而能夠促進骨折的愈合，起到治療骨折的作用，并由此完成了本發明。
同時通過上述作用，L-蘇糖酸鈣能夠增加骨的密度和力學性能，起到預防骨折，尤其病理性骨折，如由老年性骨質疏松引起的骨折的作用。本發明的詳細描述本發明的L-蘇糖酸鈣為白色顆粒，無味，能溶于水，不溶于醇、醚及氯仿，它的分子式為C8H14O10Ca，化學結構式為 它的制備方法描述在中國專利96106507.9及美國專利No.6,077,872中，當然也可以用現有技術中已知的其它方法來制備。
本發明的L-蘇糖酸鈣可以采用口服的給藥方法。
本發明的L-蘇糖酸鈣能以各種藥物制劑如片劑、膠囊和藥學可接受組合物的形式使用。
根據本發明的藥物組合物，可以含有一定量的L-蘇糖酸鈣作為活性成分，也可含有藥學可接受的載體，這些藥學可接受的載體可以是在現有技術中廣泛用于藥物中的各種載體，如賦形劑。本發明的藥物組合物可以按現有技術中已知的方法如混合、制粒、壓片來制備。
本發明的L-蘇糖酸鈣藥物組合物還可以包括各種藥學使用的任選組分，如香味劑、著色劑、甜味劑等。本發明優選L-蘇糖酸鈣藥物組合物包括高達60wt％，優選80wt％，更優選90wt％的L-蘇糖酸鈣，其余為賦形劑和其它任選組分。
L-蘇糖酸鈣的用量可以根據病人的體重和年齡來變化。作為指導，L-蘇糖酸鈣的用量一般是在0.5—12克/天，優選3—7克/天。對于兒童，可以按其體重比例相應減少。
L-蘇糖酸鈣在動物體內的藥代動力學試驗表明L-蘇糖酸鈣在大鼠體內吸收代謝為一室模型，與其它鈣劑如葡萄糖酸鈣、醋酸鈣、碳酸鈣相比，吸收較為緩慢，血鈣達峰時間較晚，Tmax＝0.79h，但吸收較為完全，半衰期T1/2＝4.45h，在體內能長時間維持在較高水平，曲線下面積AUC＝191.75μg/mL.hr。
一、L-蘇糖酸鈣對體外培養成骨細胞的增殖、分化和骨形成功能的刺激作用為提供L-蘇糖酸鈣對成骨細胞增殖、增加骨量的細胞學基礎，本試驗應用體外培養成骨細胞方法，觀察該藥對細胞骨形成功能的刺激作用。取新生SD大鼠頭蓋骨、分離培養成骨細胞1×104的密度接種于含10wt％NCS-MEM培養液，取第二繼代細胞進行藥效試驗。結果表明10-9—10-3mol/L的L-蘇糖酸鈣對成骨細胞有增殖作用，10-3mol/L對細胞活性、礦化結節形成能力均有明顯刺激作用，對ALP活性和礦化結節形成能力有一定提高作用。
材料和方法1、取材新生(24小時內)SD大鼠消毒后，在滅菌條件下取頭蓋骨，先經0.25％胰蛋白酶預消化10—15分鐘，隨后以0.1％II型膠原酶，37℃振蕩消化60分鐘，以1000rpm離心收集細胞。
2、細胞培養將分離的細胞以1×104/cm2的密度接種于培養瓶中，培養液為10％NCS-MEM，置37℃，5％CO2培養箱中培養，至半匯合時傳代，取第二代繼代細胞(OB2)進行藥效試驗。
3、藥物各待試藥物均配制成0.1mol/L濃度，經高壓滅菌備用。
L-蘇糖酸鈣1.55g，50ml去離子水，加熱溶解；葡萄糖酸鈣2.24g，50ml去離子水，常溫溶解；對照組為去離子水。
4、觀察指標(1)細胞增殖OB2以6×103/孔密度接種于24孔COSTOR培養板，24小時后換入含不同濃度藥物(10-9—10-3mol/L)的培養液，于加藥后72小時用MTT方法在Labsystems Multiskan MS(芬蘭)酶標儀上進行測試，以波長570nm處的OD值表示細胞增殖情況，結果與對照組比較。
(2)ALP活性測定OB2以2×104/孔密度接種24孔上述培養板，24小時后換入含藥培養液，以后每48小時換液一次，待匯合后用對硝基苯磷酸鹽法測細胞溶解液中的ALP活性，用考馬斯蘭法測定蛋白含量，以U/mg蛋白表示ALP活性，結果與對照組比較。
(3)礦化功能測定OB2以5×104/孔密度接種6孔上述培養板，24小時后換入含藥培養液，48小時換液一次，14天后固定，茜素紅染色，光鏡下礦化結節計數，結果與對照組比較。
結果表1—3給出的是藥物對增殖的實驗結果。表中的結果顯示，三批實驗中10-9—10-3mol/L L-蘇糖酸鈣組OB2增殖率均顯著高于對照組，并且以10-3mol/L的OD值為最高；多數濃度組OB2的OD值顯著高于葡萄糖酸鈣組和氯化鈣組。L-蘇糖酸鈣組中實驗一、二的OB2OD值顯著高于對照組，實驗三未見明顯改變，與葡萄糖酸鈣和氯化鈣組比較多數無明顯差別。
表1 L-蘇糖酸鈣等藥物對成骨細胞的影響實驗一(濃度單位mol/L)A570(X±SD)

注n＝4，與對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001
與同濃度L-蘇糖酸鈣組比較&P＜0.05，#P＜0.01表2 L-蘇糖酸鈣等藥物對成骨細胞的影響實驗二(濃度單位mol/L)A570(X±SD)

注n＝4，與對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001與同濃度L-蘇糖酸鈣組比較&P＜0.05，#P＜0.01表3 L-蘇糖酸鈣等藥物對成骨細胞增殖的影響實驗三(濃度單位mol/L)A570(X±SD)

注n＝4，與對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01與同濃度L-蘇糖酸鈣組比較&P＜0.05，#P＜0.01，$P＜0.0012、L-蘇糖酸鈣對OB2ALP活性的影響參照OB2增殖的結果，以10-3mol/L濃度進行藥物OB2ALP活性刺激作用實驗，結果見表4。
在相同濃度下，L-蘇糖酸鈣OB2ALP活性高于對照組，實驗一、二的增高有顯著意義(P＜0.05)。與葡萄糖酸鈣和氯化鈣組比較，L-蘇糖酸鈣OB2ALP活性均有增高，但無顯著性。
表4 L-蘇糖酸鈣等藥物對成骨細胞ALP活性的影響

注n＝4與對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01，3、L-蘇糖酸鈣對OB2礦化功能的刺激作用由表5可見，成骨細胞2周形成的礦化結節數以L-蘇糖酸鈣組為高，L-蘇糖酸鈣組的增高有顯著意義(P＜0.05)。
表5 L-蘇糖酸鈣等藥物對成骨細胞礦化功能的影響

n＝5與對照組比較*P＜0.05，與L-蘇糖酸鈣比較&P＜0.05成骨細胞是骨形成細胞，在骨重建中增殖、分化，合成、分泌與骨形成有關的膠原和非膠原蛋白質，生成類骨質和促進類骨質礦化。形成的新骨質修補破骨細胞骨吸收形成的骨陷窩。成骨細胞功能減退致新骨形成量減少，對骨吸收陷窩的修復能力減弱，造成骨小梁變細、薄弱、穿孔，皮質骨呈多孔性改變。在骨形成促進藥物的成骨細胞藥效學評價中，常以增殖率、堿性磷酸酶的活性(ALP)和礦化結節為指標，這些指標分別代表成骨細胞的增殖、分化和礦化能力，可較全面地評價藥物對成骨細胞形成功能的刺激作用。
以上結果顯示1、L-蘇糖酸鈣對體外培養成骨細胞的增殖率、ALP活性和礦化結節形成有明顯的刺激作用。2、L-蘇糖酸鈣對體外培養成骨細胞的增殖率、ALP活性和礦化結節形成的刺激作用均高于葡萄糖酸鈣、氯化鈣。
二、L-蘇糖酸鈣對促進I型骨膠原合成的作用研究本項研究將深入討論L-蘇糖酸鈣對體外培養成骨細胞I型膠原(α-COLI)基因表達的影響。
材料與方法1、細胞培養原代成骨細胞的培養方法同前，第2代OB按1×104cell/cm接種。傳代第2天，按相同濃度(10-3mol/L)在不同培養瓶中分別加入L-蘇糖酸鈣、葡萄糖酸鈣，對照組加相同體積的去離子水。每48小時換培養液并加藥，一周后提取細胞總RNA。
2、RNA的提取將細胞用0.25％胰酶消化，1000rpm×5min離心收集細胞沉淀，用TRIzol試劑(Gibco公司)法提取細胞總RNA。經瓊脂糖甲醛變性電泳見18s與28s條帶，用紫外分光光度計測RNA的濃度與純度(A260/A280值在1.7—2.0之間)。
3、RT-PCR反應本次實驗采用Access RT-PCR System試劑盒(Promega)。按說明進行操作。反應混合液在PCR儀(Bio-Rad公司)中48℃45min條件下進行逆轉錄反應，94℃2分鐘滅活酶，然后進行30個循環的PCR反應，94℃30min變性，54℃1min退火，72℃2min延長，末次循環后72℃延伸7min。取9μL PCR產物進行1.5％瓊脂凝膠電泳，電泳條帶圖象分析系統(ImageMaster VDS)分析，光密度值經內參照-Actin校正，校正值進行統計分析。
表6引物序列

4、藥物各待試藥物均配成0.1mol/L濃度，經高壓滅菌后備用。
L-蘇糖酸鈣由北京巨能亞太生命科學研究中心提供，1.55g＋50ml去離子水，加熱溶解。
葡萄糖酸鈣，上海黃海制藥廠，2.24g＋50ml，2.24g＋50ml去離子水配制。
結果應用定量RT-PCR技術檢測成骨細胞中α-COLI的mRNA表達時發現，在相同給藥濃度(10-3mol/L)條件下，L-蘇糖酸鈣組的mRNA水平較對照組有顯著升高(P＜0.05)。說明L-蘇糖酸鈣可以促進成骨細胞α-COLI mRNA的表達。葡萄糖酸鈣組的α-COLI mRNA水平與對照組間無顯著差異。
表7

注X±SD，n＝3，與對照組比較*P＜0.05，成骨細胞在骨折時的增殖、分化、成熟的過程中，在胞漿內合成大量的I型原膠原，并分泌到基質中，構成了骨質的主要成分—膠原，從而促進骨折的愈合。同時骨質的含量又是決定骨骼強度的重要因素，在臨床中常將I型膠原蛋白降解片段的測定作為反映成骨功能的指標之一。因此說明，L-蘇糖酸鈣在預防和治療骨折中具有非常重要的意義。本研究采用定量RT—PCR方法，檢測α-COLI mRNA水平，較蛋白分子的檢測更能反映OB內基因的表達情況。
在過去的藥效學各試驗中發現L-蘇糖酸鈣明顯增加去勢大鼠的骨密度、骨鈣含量與生物力學參數。細胞藥效試驗表明該藥能促進OB增殖、分化與礦化功能。本項試驗研究觀察發現L-蘇糖酸鈣上調體外培養OB的α-COLImRNA水平。這與以往細胞藥效所反映其增強成骨細胞骨形成功能的作用是相關的，提示L-蘇糖酸鈣可能是通過增強OB內某些基因的表達、從而提高OB的成骨功能。膠原蛋白水平的檢測可進一步證實。
上述試驗表明，L-蘇糖酸鈣既能促進成骨細胞的增殖、分化及礦化功能，同時又促進體外培養成骨細胞I型原膠原mRNA的表達。通過這些作用，L-蘇糖酸鈣能夠起到促進骨折愈合的作用，并能夠增加骨的密度和力學性能，起到預防骨折，尤其病理性骨折(如老年性骨質疏松癥)的作用。
權利要求
1.L-蘇糖酸鈣在預防骨折中的用途。
2.L-蘇糖酸鈣在治療骨折中的用途。
3.用于預防和/或治療骨折的藥物組合物，它含有有效量的L-蘇糖酸鈣。
全文摘要
本發明涉及一種L－蘇糖酸鈣的新用途,具體說是用于預防和治療骨折的用途。經試驗發現L－蘇糖酸鈣既能促進成骨細胞的增殖、分化及礦化功能,同時又能促進體外培養成骨細胞Ⅰ型原膠原mRNA的表達,從而能夠促進骨折愈合,增加骨的密度和力學性能,起到預防和治療骨折的作用。
文檔編號A61K31/191GK1328820SQ01119870
公開日2002年1月2日 申請日期2001年7月3日 優先權日2001年7月3日
發明者于凱, 王志文, 戴向國 申請人:北京巨能亞太生命科學研究中心