專利名稱：一種肝癌細胞的抑制劑及其在抑制腫瘤生長方面的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種腫瘤細胞的抑制劑，特別一種肝癌細胞抑制劑及其在抑制腫瘤生長方面的應用。
背景技術：
肝癌(HCC)是世界范圍內排列第五位的最常見的惡性腫瘤，而由于其對化療的耐受以及手術后極高的復發和轉移特性使其成為致死率第三的惡性腫瘤。近年來越來越多的研究證明，HCC的發生可能起源于一群具有干性的細胞亞群，這群細胞被稱為腫瘤起始細胞(tumor-initiating cells, TICs)或是腫瘤干細胞(cancer stem cells)。這群細胞表達特定的表面標記，具有自我更新、分化、形成腫瘤以及化療耐受的特性。雖然，目前索拉菲尼(sorafenib)已經用于靶向治療HCC，但是其對腫瘤的抑制作用以及肝癌病人的存活率并不是很好。因此，如果采用能夠抑制TICs的治療策略可能是靶向治療HCC的有效手段。 過氧化物酶體增殖物激活受體Y (peroxisome proliferator-activatedreceptor y，PPAR y )即PPARy激動劑是核受體超家族中的一類配體依賴性的核轉錄因子。PPARy激動劑主要包括內源性的配體15d_PGJ2以及人工合成的抗糖尿病藥物噻唑燒二酮類家族成員，如羅格列酮(rosiglitazone)、曲格列酮(troglitazone)、環格列酮(ciglitazone)、卩比格列酮(pioglitazone)以及恩格列酮(englitazone)。配體活化 PPAR Y后，誘導靶基因的表達進而調控一系列的生理學進程，例如代謝、細胞分化、凋亡以及組織
炎癥等。PPARy激動劑在不同的腫瘤細胞中也被報道能夠抑制細胞增殖、誘導凋亡及分化。更有研究表明，在HCC的腫瘤組織中，尤其是在低分化的腫瘤組織中PPAR γ的表達明顯受到抑制，而且PPAR Y激動劑可抑制HCC的形成、侵襲及轉移。AKT是維持正常生命活動的重要信號傳導分子，其持續活化與腫瘤的發生發展密切相關，是一重要的癌基因。同時，AKT的異常活化是肝癌復發和預后不良的一種危險因素。抑制AKT的活性可抑制腫瘤細胞的生長。然而，迄今為止，聯合PPAR Y激動劑與AKT抑制劑能否有效地靶向肝腫瘤起始細胞從而抑制腫瘤生長仍然不是很清楚。

發明內容
本發明的目的就是為了研究上述的PPAR Y激動劑與AKT抑制劑聯合能否有效地靶向肝腫瘤起始細胞從而抑制腫瘤生長等技術問題，最終提供一種肝癌細胞的抑制劑及其在抑制腫瘤生長方面的應用。本發明的技術原理
在人肝癌細胞系中PPAR Y激動劑通過N0X2誘導產生的活性氧(reactive oxygenspecies, ROS)有效地抑制HCC細胞的干性表型；然而，ROS的上調引起AKT的高度活化，活化的AKT又以負反饋的形式調控ROS的水平，進而影響PPAR Y激動劑對HCC細胞的干性表型的調節。因此，PPARy激動劑羅格列酮及AKT抑制劑曲西立濱(triciribine)聯合在體內呈現出對腫瘤生長抑制的協同作用，并能抑制腫瘤組織中細胞的干性表型。由PPARy激動劑與AKT抑制劑組成的一種新的肝癌細胞抑制劑的治療策略有望用于臨床治療肝癌。本發明的技術方案
一種肝癌細胞的抑制劑，包括PPAR Y激動劑和AKT抑制劑；
所述的PPARy激動劑優選為羅格列酮或15d-PGJ2 ；
所述的AKT抑制劑優選為曲西立濱；
通過針對皮下接種GFP+ Huh7細胞的BALB/C雄性裸鼠的試驗表明，所述的肝癌細胞 的抑制劑中，按質量比計算，PPARY激動劑羅格列酮AKT抑制劑曲西立濱為100 1 ；
通過對肝癌細胞Huh7的實驗結果表明，所述的肝癌細胞的抑制劑中，按質量摩爾比計算，PPAR Y激動劑15d-PGJ2 :AKT抑制劑曲西立濱為Ig :20-100 μ mol。上述的一種肝癌細胞的抑制劑在抑制肝癌細胞生長方面的應用。本發明的有益效果
本發明的一種肝癌細胞的抑制劑，由于含有PPAR Y激動劑羅格列酮或15d-PGJ2和AKT抑制劑曲西立濱，針對人肝癌細胞系特別是Huh7的實驗研究表明，PPAR Y激動劑羅格列酮和AKT抑制劑曲西立濱或PPAR Y激動劑15d-PGJ2和AKT抑制劑曲西立濱組成的肝癌細胞的抑制劑均可以協同抑制HCC細胞的干性表型，從而抑制肝癌細胞的生長。進一步，通過針對皮下接種GFP+ Huh7細胞的BALB/C雄性裸鼠試驗，可以得出PPARy激動劑羅格列酮和AKT抑制劑曲西立濱序貫聯合給藥達到了協同抑制腫瘤生長的作用，并且比單獨PPAR γ激動劑在抑制腫瘤生長方面的抑制率增加42%、比單獨AKT抑制劑在抑制腫瘤生長方面的抑制率增加30. 5%。


圖1A、PPAR Y激動劑15d_PGJ2和自由基清除劑NAC分別處理Huh7及SK-Ifepl細胞后，細胞內的ROS含量變化統計圖(*，/X0. 05;#，/X0. Olvs對照組)；
圖1B、PPAR Y激動劑15d-PGJ2分別處理Huh7和SK-H印I細胞后，N0X2表達量的示意
圖1C1、添加自由基清除劑NAC后，PPAR Y激動劑15d_PGJ2處理Huh7細胞后，AKT及磷酸化AKT表達量示意 圖1C2、添加自由基清除劑NAC后，PPAR Y激動劑羅格列酮處理Huh7細胞后，AKT及磷酸化AKT表達量示意 圖ID、AKT抑制劑曲西立濱處理Huh7細胞后，N0X2、AKT及磷酸化AKT表達量的示意
圖IE、PPAR Y激動劑15d-PGJ2與AKT抑制劑曲西立濱聯合處理Huh7細胞后，ROS表達量變化的統計圖(*,/^<0. 05;**，7X0. 01)；
圖2A1、PPAR Y激動劑15d-PGJ2與AKT抑制劑曲西立濱聯合處理Huh7細胞后，細胞凋亡情況的統計圖(七/XO. 05)；
圖2A2、PPAR Y激動劑羅格列酮與AKT抑制劑曲西立濱聯合處理Huh7細胞后，細胞凋亡情況的統計 圖2B、PPAR Y激動劑15d-PGJ2與AKT抑制劑曲西立濱聯合處理Huh7細胞后，細胞成球能力的統計圖，圖中· >=100 μ m表示腫瘤細胞球的直徑大于等于ΙΟΟμπι，^ 50-100μπι表示腫瘤細胞球的直徑大于50 μ m而小于100 μ m ;
圖2C、PPAR Y激動劑15d-PGJ2與AKT抑制劑曲西立濱聯合處理Huh7細胞后，⑶133+細胞數的統計圖(*，P < 0.05; **，P < 0.01)；
圖2D、PPARy激動劑羅格列酮與AKT抑制劑曲西立濱聯合處理Huh7細胞后，⑶133+細胞數的統計圖(*，P < O. 05)； 圖3A、實施例3中的羅格列酮處理組、曲西立濱處理組以及序貫聯合給藥方案示意圖； 圖3B、隨時間變化，不同給藥方式對小鼠皮下荷瘤體積大小的影響；
圖3C、不同給藥方式對小鼠皮下荷瘤所形成的腫瘤的重量的影響；
圖3D、不同給藥方式對小鼠皮下荷瘤所形成的腫瘤組織中CD133+細胞所占比例的統計圖(*,7X0· 05;**,^. 01)。
具體實施例方式下面通過具體實施例并結合附圖對本發明進一步闡述，但并不限制本發明。本發明所用的材料 細胞系及實驗動物
人肝癌細胞系Huh7細胞購自日本Riken Cell Bank, SK-Hepl細胞購自American TypeCulture Collection (ATCC)。6 8周齡雄性BALB/C裸鼠，購自上海必凱實驗動物有限責任公司，飼養于華東師范大學動物房。小鼠置于恒溫(25-27° C)、恒濕(45-50%)、無特殊病原菌(SPF級)環境下飼養，滅菌處理的水和飼料供動物自由攝入。主要試劑
I公司
DMEM/F121:1 培養液_GIBCO_
面糖DMEM培養液GIBCO
~25% 胰酶 +0. 02% 乙二胺四乙酸(EDTA) GIBCO
15d-PGJ2Sigma 和 CaymanChemical
7-AADSigma
FITC-AnnexinVBD
B27GIBCQ
BCA蛋白定量試齊盒_Thermo_
bFGFR&D
DHEInvitrogen
ECL發光試齊盒_Thermo_
EGFR&D
MTTSigma
NACCalbiochem
Penstrep 雙抗GIBCO
RNAisoPlusTaKaRa
siRNASigma
SYBRPremixExTaq TaKaRa
DNaseIRoche
權利要求
1.一種肝癌細胞的抑制劑，包括PPAR Y激動劑，其特征在于所述的肝癌細胞抑制劑還包括AKT抑制劑。
2.如權利要求I所述的一種肝癌細胞的抑制劑，其特征在于所述的PPARY激動劑為羅格列酮或15d-PGJ2。
3.如權利要求2所述的一種肝癌細胞的抑制劑，其特征在于所述的AKT抑制劑為曲西兄浜。
4.如權利要求3所述的一種肝癌細胞的抑制劑，其特征在于按質量比計算，即PPARy激動劑羅格列酮=AKT抑制劑曲西立濱為100 :1。
5.如權利要求3所述的一種肝癌細胞的抑制劑，其特征在于按質量摩爾比計算，SPPPARy激動劑15d-PGJ2 :AKT抑制劑曲西立濱為Ig :20-100 μ mol。
6.如權利要求1、2、3、4或5所述的一種肝癌細胞的抑制劑在抑制肝癌細胞生長中的應用。
全文摘要
本發明公開一種肝癌細胞的抑制劑。所述的一種肝癌細胞的抑制劑包括PPARγ激動劑與AKT抑制劑曲西立濱，所述的PPARγ激動劑為羅格列酮或15d-PGJ2，其中PPARγ激動劑羅格列酮AKT抑制劑曲西立濱按質量比計算為100∶1；PPARγ激動劑15d-PGJ2AKT抑制劑曲西立濱按質量摩爾比計算為1g∶20-100μmol。本發明的一種肝癌細胞抑制劑，能有效地抑制HCC腫瘤起始細胞亞群以及有效地抑制腫瘤生長，為臨床治療HCC提供了可能的有效治療策略。
文檔編號A61K31/7064GK102940884SQ20121046498
公開日2013年2月27日 申請日期2012年11月19日 優先權日2012年11月19日
發明者劉永忠, 劉蘭蘭, 楊兆娟 申請人:上海市腫瘤研究所