專利名稱：一種抗腫瘤活性物質及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種抗腫瘤活性物質及其制備方法和應用，屬微生物醫藥技術領域。
背景技術：
腫瘤(癌癥)在全球范圍內是僅次于心血管疾病的第二大“殺手”。據美國癌癥研究院(NCI)2003年的統計資料，美國男子約有一半、女子約有三分之一將在他(她)們的生命過程中患上癌癥；全美每年新診斷腫瘤病例超過100萬人，每年死于這類疾病的人數超過50萬。我國的腫瘤發病率同樣十分驚人，每年新增腫瘤病人200萬人，死亡130多萬人，目前全國癌癥病人總數估計在500萬以上。隨著全球老齡化社會的到來和腫瘤發病率的不斷提高，抗腫瘤藥物市場也在不斷地增長。據中國東方健康市場研究中心2001年的《中國抗腫瘤藥物市場研究報告》，1999年中國抗腫瘤藥物市場增長了17％，達6.03億美元，估計到2006年此類藥品的銷售額可達17億美元。
隨著腫瘤發病率的日趨升高，人們對抗腫瘤藥物的研究也在不斷加強和深入。目前所用的抗腫瘤藥物中，多數對人體副作用較大，特異性不強，迫切需要開發活性高、特異性強的新型抗腫瘤藥物造福于人類。
三七是中國的傳統名貴藥材，利用微生物轉化的方法，對三七進行二次開發，產生新的具有抗腫瘤活性的發酵物，是進一步利用中草藥，實現中藥現代化的有利手段。
國內外文獻檢索表明，未見有關利用微生物轉化三七產生抗腫瘤活性物質的公開文獻報道。

發明內容
本發明的目的在于提供一種利用紅色紅曲霉發酵三七及其在抗腫瘤活性方面的應用。
本發明是這樣實現的本發明的生產菌株是紅色紅曲霉(Monascus ruber)3081，該菌株已于2005年2月28日保存于中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心，保藏號CGMCCNo.1319。
紅色紅曲霉屬子囊菌亞門(Ascomycotina)，不整囊菌綱(Plectomyhcetes)，散囊菌目(Eurotiales)，紅曲科(Monascaceae)，紅曲霉屬(Monascus)。3081菌株在麥芽汁瓊脂培養基上生長良好，菌絲初為白色，老熟后變為赭紅色。菌落的結構呈絨氈狀。能形成紅色色素，故使培養物的背面著色。
本發明是這樣實現的將三七用Monascus ruber 3081菌株通過固體培養，提取有抗腫瘤活性的代謝產物，制備成抗腫瘤的制劑。
實驗表明三七紅色紅曲霉發酵物對人白血病細胞株K562和人肺癌細胞株A549顯示了明顯的抑制活性；對致癌基因Raf1和c-Myc的潛在靶點酪氨酸磷酸酯酶cdc25a和cdc25b具有顯著的抑制作用。
本發明將以三七為底物的Monascus ruber 3081發酵物作為制備抗腫瘤制劑的應用。
本發明與現有技術相比，利用了微生物自身獨特的代謝體系以三七為底物生產具有抗腫瘤活性的代謝物質，并通過人工培養技術實現生產控制。
具體實施例方式一、本發明化合物的發酵生產方法實施例11、將紅色紅曲霉(Monascus ruber)3081接種到試管固體培養基斜面上，培養基配方為麥芽汁培養基，20℃下培養8天，獲得試管種；2、將試管種接種到250ml三角瓶中(每瓶裝50ml)固體培養基中，培養基配方為三七須根粉末20％，水80％，自然pH，培養溫度30℃，最適25-28℃，靜置培養20天，直到菌絲長滿。
3、將固體培養物冷凍干燥。用90％的乙醇室溫浸提2天，減壓濃縮，蒸干溶劑后即得活性物質。
實施例2基本同實施例1。不同之處為試管固體培養的溫度28℃、時間為下培養6天；固體培養基配方為三七須根粉末25％，水75％，培養溫度25℃，靜置培養18天；用95％的乙醇室溫浸提。
實施例3基本同實施例1。不同之處為試管固體培養的溫度30℃、時間為下培養4天；固體培養基配方為三七須根粉末30％，水70％，培養溫度20℃，靜置培養15天；用92％的乙醇室溫浸提。
二、本發明化合物抗腫瘤活性的藥效試驗1、對人腫瘤細胞的生長抑制作用將對數生長期細胞調整為適當濃度后加入96孔培養板，90ul/孔。受試濃度為100ug/ml，設3個平行孔，10ul/孔。陰性對照為等體積培養液，陽性對照為抗癌藥物順鉑(DDP)。同時設相應濃度的DMSO溶媒對照和有色樣品顯色濃度的平行對照，以消除有色樣品顏色的干擾。貼壁生長的細胞(A549)接種后培養24小時待其貼壁后加藥，懸浮生長細胞(K562)接種后即加藥，加藥后細胞置37℃，5％CO2培養箱培養一定時間(A549培養72小時，K562培養48小時)后加入MTT(5mg/ml)，20ul/孔，繼續培養4小時后加入三聯液(10％SDS-5％異丁醇-0.012mol/L HCl，W-V-V)，100ul/孔，放置過夜后，用酶標儀在570nm，630nm雙波長下測定各孔的OD值。
2、對致癌基因Raf1和c-Myc的潛在靶點酪氨酸磷酸酯酶cdc25a和cdc25b的抑制作用將20ml酪氨酸磷酸酯酶cdc25a或cdc25b加入含有20mlDDT(100mM)的Tris緩沖液中(50mM Tris，pH8，50mM NaCl，1mM EDTA，1mM DTT)，再加入140mlTris緩沖液。平板預先在37℃的培養箱內保持15分鐘，然后加入20mL500mM的發酵物，37℃反應30分鐘后，在405nm波長下測定OD值。
實施1發酵物對人腫瘤細胞的生長抑制將0.5mg三七發酵物溶于少量二甲亞砜，用無菌蒸餾水稀釋為100ug/ml溶液，二甲亞砜的終濃度不超過2％。
按上述試驗方法1進行藥效試驗。
表1三七發酵物對人腫瘤細胞的生長抑制作用K562％ A549％DMSO control 1.98 0DDP control 0.1ug/ml32.000.871.0ug/ml41.4134.1710ug/ml 100.00 100.00Extract fermented by M.rubber 308178.5722.71結果表明，三七紅色紅曲霉發酵物對人白血病細胞株K562的抑制率達到78.57％，對人肺癌細胞株A549的抑制率達到22.71％，顯示了明顯的抑制活性。
實施2發酵物對酪氨酸磷酸酯酶cdc25a和cdc25b的抑制將0.5mg三七發酵物溶于少量二甲亞砜，配制為50ug/ml的水溶液，待測溶液中二甲亞砜的終濃度不超過2％。
按上述試驗方法2進行藥效試驗。
表2 三七發酵物對酪氨酸磷酸酯酶cdc25a和cdc25b的抑制作用編號 cdc25a抑制率％ cdc25b抑制率％DMSO Control 2.012.972.22 2.54XXX Control 93.10 98.30 95.1191.88Extract fermented by M.rubber 308179.70 79.40 64.5462.01結果表明，三七紅色紅曲霉發酵物對致癌基因Raf1和c-Myc的潛在靶點酪氨酸磷酸酯酶cdc25a的抑制率為79.55％，對cdc25b的抑制率為63.28％，具有顯著的抑制作用。
實施3發酵物對人腫瘤細胞的生長抑制活性的增強實施例3方法同實施例1，不同之處為分別將0.5mg三七發酵物，0.5mg三七乙醇提取物，和0.5mg紅色紅曲霉自然發酵物各溶于少量二甲亞砜，用無菌蒸餾水稀釋為100ug/ml溶液，二甲亞砜的終濃度不超過2％。
表3三七發酵物對人腫瘤細胞的生長抑制活性的增強K562A549DMSO control1.980DDP control 0.1ug/ml 32.00 0.871.0ug/ml 41.41 34.1710ug/ml100.00 100.00P.notoginseng control 69.46 1.16M.rubber 3081 control 2.9010.26Extract fermented by M.rubber 3081 78.57 22.71結果表明，三七經紅色紅曲霉發酵之后，可以提高對人腫瘤細胞的生長抑制活性，提高率為13.11％。
權利要求
1.一種抗腫瘤活性物質，由生產菌株經試管培養、固體培養及冷凍干燥工序后制成，其特征在于生產菌株為紅色紅曲霉(Monascus ruber)3081，該菌株已于2005年2月28日保存于中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心，保藏號CGMCC No.1319。
2.權利要求1所述活性物質的制備方法，包括試管培養、固體培養及冷凍干燥工序，其特征在于2.1試管培養為將紅色紅曲霉(Monascus ruber)3081接種到試管固體培養基斜面上，培養基配方為麥芽汁培養基，在20-30℃下培養4-8天，獲得試管種；2.2固體培養基組成為三七須根粉末20％-30％，水70％-80％，自然pH。2.3固體培養中溫度20-30℃，靜置培養15-20天，直到菌絲長滿；2.4冷凍干燥工序為用90～95％的乙醇在室溫浸提2天，減壓濃縮后蒸干溶劑后即得活性物質。
3.權利要求1所述的抗腫瘤活性物質，其特征在于該活性物質對人腫瘤細胞的生長、對酪氨酸磷酸酯酶cdc25a和cdc25b具有抑制作用，可以用以制備抗腫瘤制劑。
全文摘要
本發明涉及一種抗腫瘤活性物質及其制備方法和應用，屬微生物醫藥技術領域。該活性物質采用常規方法制備，其中生產菌株為紅色紅曲霉(Monascus ruber)3081，保藏號CGMCC No.1319。試管種采用常規的麥芽汁培養基，于20－30℃下培養4－8天。固體發酵培養基為三七須根粉末20％－30％，水70％－80％，自然pH。固體培養溫度20－30℃，靜置培養15－20天后，用90～95％的乙醇在室溫浸提2天，減壓濃縮后蒸干溶劑后即得活性物質。本發明得到的活性物質對人白血病細胞株K562的抑制率達到78.57％，對人肺癌細胞株A549的抑制率達到22.71％；對致癌基因Raf1和c－Myc的潛在靶點酪氨酸磷酸酯酶cdc25a的抑制率為79.55％，對cdc25b的抑制率為63.28％，該活性物質具有顯著的抑制作用，可作為制備抗腫瘤制劑的應用。
文檔編號A61P35/00GK1682771SQ200510010690
公開日2005年10月19日 申請日期2005年3月16日 優先權日2005年3月16日
發明者劉亞君, 張克勤 申請人:云南大學