專利名稱：具有adcc和cdc功能及改善的糖基化特征的抗-cd19抗體的制作方法
具有ADCC和CDC功能及改善的糖基化特征的抗-CD19抗體
技術領域：
本發明涉及抗-CD19抗體，其具有賦予一種或幾中有用的效應子功能的相對于野生型Fe區具有一些特定氨基酸修飾的變體Fe區。本發明尤其涉及包含該變體Fe區的嵌合，人源化的或全人抗-CD19抗體。其有利地涉及具有感興趣的和有價值的糖基化特征，尤其低巖藻糖水平和/或高寡甘露糖水平和/或更高水平的唾液酸化的糖型的抗體。本發明也涉及這些抗體在疾病或病癥，諸如癌，尤其B細胞惡性腫瘤，及自-免疫疾病的治療，防止或管理中的用途。
背景技術：
在自身免疫和/或炎性病癥中，免疫系統在無要抵御的外源物質時引發炎性應答，及身體的正常保護 性免疫系統通過錯誤地攻擊本身來導致對其自身組織的損傷。有以不同方式影響身體的許多不同自身免疫病癥。例如，在患多發性硬化的個體中影響腦，在患克羅恩病的個體中影響腸，及在患類風濕性關節炎的個體中影響各種關節的滑膜，骨和軟骨。B細胞惡性腫瘤構成癌的重要組，其包括B細胞非-霍奇金氏淋巴瘤(NHL)，B細胞慢性淋巴細胞白血病(B-CLL)和毛細胞白血病和B細胞急性淋巴細胞白血病(B-ALL)。目前,癌治療可涉及手術,化學治療,激素治療和/或放射治療，以根除患者中的腫瘤形成細胞。最近，癌治療也可涉及生物學治療或免疫治療。有對于替代性的癌治療，特別對于已證明了對標準癌治療，諸如手術，放射治療，化學治療和激素治療難治性的癌治療的顯著需求。有希望的替代性的是免疫治療，其中癌細胞特別由癌抗原-特異性抗體靶向。主要努力已指向利用免疫應答的特異性，例如,雜交瘤技術致使腫瘤選擇性單克隆抗體的開發，且在過去幾年，食品和藥物管理局批準了用于癌治療的第IMAb:用于非-霍奇金氏淋巴瘤的RiUlxan (抗-⑶20)和用于轉移性乳腺癌的赫賽汀[抗-(c-erb-2/HER-2)]。Rituxan (俗名是利妥昔單抗)是針對在外周血和淋巴樣組織中的大多數B細胞表面發現的人CD20，35kDa，4跨膜-跨蛋白的嵌合小鼠-人單克隆抗體。抗體治療(Rituxan ,，美國專利5，736，137)被美國食品和藥物管理局(FDA)
批準用于治療復發的或難治性低度或濾泡，CD20-陽性B細胞非-霍奇金氏淋巴瘤。此外，采用放射性標記的抗-⑶20抗體的淋巴瘤治療已描述于美國專利5，595，721，5，843，398，6，015，542 和 6，090，365。
toon] 在腫瘤學中，Rituxan /MabTliera 也在us被作為單劑用于治療復發的
或難治性，低度或濾泡，⑶20-陽性，B細胞NHL，用于治療NHL，用于之前未治療的濾泡，CD20-陽性，B細胞NHL組合環磷酰胺，長春新堿，潑尼松龍(CVP)化學治療，作為單劑用于治療非-進展(包括穩定的疾病)，低度，⑶20陽性，B細胞NHL，在第1-線CVP化學治療之后，及用于之前未治療的擴散大B細胞，⑶20-陽性，NHL組合標準化學治療(CHOP)或其他基于蒽環類抗生素的化學治療方案。在腫瘤學中，Rituxan >/MabThera .在EU被用于患之前未治療的或復發
的/難治性慢性淋巴細胞白血病(CLL)的患者的治療組合化學治療，用于之前未治療的患階段II1-1V濾泡淋巴瘤的患者的治療組合化學治療，作為對于應答誘導利用用或不用Rituxan /MabThera 的化學治療的治療的患復發的/難治性濾泡淋巴瘤的患者的維持治療，用于患⑶20-陽性擴散大B細胞非-霍奇金氏淋巴瘤(NHL)的患者的治療組合CHOP (環磷酰胺，多柔比星，長春新堿，潑尼松龍)化學治療，及作為用于是化療抗性或在它們的在化學治療之后的二次或隨后復發的患階段II1-1V濾泡淋巴瘤的患者的治療的單一治療。此外，在風濕病學中，指示Rituxan /IV1abThera 組合甲氨喋呤用于已具
有對其他疾病-修飾抗-風濕性藥物(DMARD)的不充足的應答或不耐性的患嚴重的有活性的類風濕性關節炎的成年患者的治療，包括一種或更多腫瘤壞死因子(TNF)抑制物治療。MabThera已在美國，日本和加拿大被知為Rituxan。阿侖珠單抗是靶向⑶52的另一抗體，其已被批準用于復發的慢性淋巴細胞白血病(CLL)，但相關于顯著毒性，因為最正常免疫細胞包括T-細胞和自然殺傷(NK)細胞上靶抗原的普遍存在的表達。但是，呈現了一些對利妥昔單抗治療的抗性或復發。復發可通過各種機理呈現，其中一些導致損失⑶20表達和對進一步利妥昔單抗治療的抗性。抗性可呈現，其可導致⑶20表達的損失或調節，及特征在于重復 的利妥昔單抗治療的功效的缺乏，或在一些情況中，由初次利妥昔單抗治療的功效的缺乏。抗性也發生在組成性缺少CD20表達的淋巴瘤病例中，包括一些B-細胞淋巴瘤諸如成血漿細胞性淋巴瘤。而且，⑶20+患者可不應答，或獲取對Rituxan 治療的抗性。而且，在高B細胞負荷的病情下，身體的效應子機理，例如，NK-細胞-介導的殺傷的耗竭，可導致此MAb的免疫治療功效的實質性減小。而且，具有慢性淋巴細胞白血病和高水平的循環B細胞的患者的利妥昔單抗治療可導致CD20自細胞移出，由此允許它們持續及抵抗清除。基于利妥昔單抗和阿侖珠單抗的成功和限制，尤其是用利妥昔單抗治療的抗性和復發現象，需要靶向B細胞上的替代性的抗原的替代性的抗體的鑒定。⑶19是免疫球蛋白(Ig)超家族的95kDa糖蛋白成員。⑶19在來自它們的早期前-B細胞階段的濾泡樹突細胞和全部B細胞上表達，直到漿細胞分化的時間。CD19表面表達在B-細胞發育期間緊密調控，更高水平見于更成熟細胞和⑶5+ (B-1) B細胞。⑶19通過B細胞分化的成血漿細胞階段而晚于⑶20表達。因而，⑶19表達在⑶20差地表達的許多前-B和未成熟的B-成淋巴細胞白血病和B細胞惡性腫瘤中相對高。CD19+成血漿細胞也可在自身免疫疾病的永存中起到作用。⑶19作為與⑶21，⑶81和⑶225的多分子復合物在B細胞的表面上表達。與此復合物一起，CD19涉及與B細胞受體的共信號傳導，及在B-淋巴樣細胞的分化，活化和增殖的控制中起到作用(Sato等人，1997)。
⑶19存在于不同類型的人B細胞惡性腫瘤(包括促-及前-B細胞急性成淋巴細胞白血病(ALL)，兒童和年輕成年的常見的ALL (cALL)，NHL, B-CLL和多毛-細胞白血病(HCL))的胚細胞。其未自惡性腫瘤細胞脫落，及在一些抗體結合之后內化(Press等人，1989)。抗原密度，在健康外周B細胞上，為10000 30000個分子/細胞，及在來自各種淋巴樣癌的惡性腫瘤細胞上，為7000 30000個分子/細胞(Olejniczak等人，1983)。相比⑶20，⑶19在B-細胞發育中更廣泛地和更早表達，其由銷售的抗癌MAbRituxan 靶向，且如此可用于更寬范圍的癌包括非-霍奇金氏淋巴瘤和急性成淋巴細胞白血病以及CLL。⑶19已20年為免疫治療開發的焦點，但用針對⑶19的單克隆抗體的初始臨床試驗未導致耐久效應，盡管在一些患者中作為單劑或組合其他治療劑展示應答(Hekman等人，1991; Vlasved 等人,1995)。已在小鼠模型，及在臨床試驗中評價幾種⑶19-特異性抗體用于體外治療B-系惡性腫瘤。這些包括了靶向⑶19和⑶3或⑶16的未修飾的抗-⑶19抗體，抗體-藥物綴合物和雙特異性抗體，以著手細胞毒性淋巴細胞效應子功能。本文所用的術語“單克隆抗體”指稱自一群基本上均質抗體獲得的抗體，即，包含群的個體抗體是同一的，除非可以少數量存在的可能的天然存在的突變或替代性的翻譯后修飾，無論自雜交瘤或重組DNA技術產生。抗體是蛋白，其呈現對特異性抗原的結合特異性。天然抗體通常是約150，OOODa的異源四聚體糖蛋白，由2個同一輕(L)鏈和2個同一重(H)鏈組成。各輕鏈由一個共價二硫鍵連接到重鏈，而二硫鍵數在不同 免疫球蛋白同種型的重鏈之間變化。各重和輕鏈也具有規則鏈內二硫鍵橋。各重鏈在一端具有可變結構域(Vh)之后是許多恒定區。各輕鏈在一端具有可變結構域(')和在其另一端具有恒定區；輕鏈的恒定區與重鏈的第I恒定區對齊，及輕鏈可變結構域與重鏈的可變結構域對齊。術語‘變體’指稱可變結構域的特定部分在抗體間在序列上廣泛地不同，且負責對其特定抗原的各特定抗體的結合特異性。但是，變異性通過抗體的可變結構域未均勻地分布。其在輕鏈和重鏈可變結構域二者中被稱為互補決定區(CDR)的3段中濃縮。可變結構域的更高度保守的部分被稱為框架區(FR)。天然重和輕鏈的可變結構域各包含4個FR區，大地采用β-折疊片構型，由3個CDR連接，其形成環連接，及在一些情況中，形成折疊片結構的部分。在各鏈中的CDR由FR區緊密保持在一起，且自其他鏈的⑶R，貢獻于抗體的抗原結合位點的形成(Kabat等人，1991)。恒定區未直接涉及抗體結合抗原，但呈現各種效應子功能。依賴于它們的重鏈的恒定區的氨基酸序列，抗體或免疫球蛋白可分為不同類。有5種主要類的免疫球蛋白:IgA，IgG, IgD, IgE和IgM，及這些中的幾種可還分為亞類(同種型)，例如。IgGl, IgG2，IgG3和IgG4 ；IgAl和IgA2。對應于不同類的免疫球蛋白的重鏈恒定區分別被稱為α，δ，ε，Y和μ。在各種人免疫球蛋白類中，僅IgGl，IgG2，IgG3和IgM已知活化補體。已顯示貢獻于抗體-介導的細胞毒性的免疫效應子功能包括抗體-依賴性細胞-介導的細胞毒性(ADCC)，抗體-依賴性細胞-介導的吞噬(ADCP)，及補體-依賴性細胞毒性(CDC)。
細胞毒性也可經抗增殖效應介導。尚不清楚腫瘤細胞增殖的抗體調節機理。但是，對抗體與免疫效應細胞上的Fcg受體(FcgR)的相互作用的理解的發展允許了具有顯著地改善的效應子功能的抗體的加工。MAb的作用機理是復雜的，且呈現對不同MAb而改變。有MAb導致靶細胞死亡的多種機理。這些包括凋亡，⑶C，ADCC和信號轉導的抑制。研究最多的是ADCC，其由自然殺傷(NK)細胞介導。此涉及抗體的Fab部分與癌細胞上的特定表位的結合和抗體的Fe部分與NK細胞上的Fe受體的隨后結合。此引發穿孔素,及導致DNA降解的粒酶的釋放，誘導凋亡及導致細胞死亡。在對MAb的Fe部分的不同受體之中，FcgRIIIa在ADCC中起到主要作用。之前研究顯示，FcgRIIIa基因的多態性在氨基酸158編碼苯丙氨酸(F)或纈氨酸(V)。繳氨酸同種型的表達與增加的親和性關聯及結合MAb (Rowland等人，1993; Sapra等人，2002;Molhoj等人，2007)。一些臨床研究用對患非-霍奇金氏淋巴瘤的顯示V/V多態性的患者中利妥昔單抗的更大臨床應答支持了此發現(Cartron等人，2002，Bruenke etal.2005, Hekmann 等人，1991，Bargou 等人，2008)。W01999051642描述了在第270或329位，或在第270，322，329和331位的2個或更多包含氨基酸取代的變體人IgG Fe區。這些修飾旨在增加⑶C和ADCC效應子功能。W02002080987描述了治療受試者中的B細胞惡性腫瘤的方法，包括施用抗-⑶19免疫毒素，更特別是人源化的或人，單克隆抗體。B細胞惡性腫瘤可為包含不表達CD20的B細胞的惡性腫瘤。W02007024249涉及人IgG Fe區的修飾，以便賦予由Fe Y R介導的增加效應細胞功能，尤其ADCC。Fe區在各氨基酸位鉻包含特定修飾。

W02008022152也與靶向⑶19的抗體相關，其中抗體包含對Fe受體的修飾及改變抗體介導一種或更多效應子功能，包括ADCC，ADCP和⑶C的能力。例證了 ADCC測定。其他相關于抗-CD19抗體的專利申請包括W02009052431，W02009054863,W02008031056, W02007076950, W02007082715, W02004106381, W01996036360,W01991013974, US7, 462，352，US20070166306 和 W02005092925。US20090098124也涉及用含有IgG2，3或4的Fe區，具有一個或更多氨基酸修飾的變體重鏈加工抗體。建議了 Fe區之內的許多突變和突變組。它們之一是在第243位用亮氨酸，在第292位用脯氨酸，在第300位用亮氨酸，在第305位用異亮氨酸，及在第396位用亮氨酸取代(MgFc88)。另外的突變可導入Fe區，以提供用于改變的Clq結合和/或⑶C功能。待修飾的氨基酸位鉻通常選自第270，322，326，327，329，331，333和334位。J.B.Stavenhagen等人(Cancer Res.2007, 67(18):8882-8890)公開了治療性抗體的Fe優化。用突變體18獲得最高水平的ADCC(F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L)。公開了具有此突變的Fe的抗-⑶20和抗-⑶32B單克隆抗體。盡管⑶19是在慢性淋巴細胞白血病(CLL)細胞上表達的B細胞特異性抗原，至今⑶19未用治療性單克隆抗體有效靶向。作者描述了乂11^65574，具有設計為增強？(3￥1 1113的結合的修飾的Fe結構域的新加工的抗-CD19單克隆抗體。它們展示，此抗體介導有力的ADCC,中等直接細胞毒性和ADCP，但無CDC (Awan等人，2010)。而且，糖蛋白介導人類中的許多必要的功能，包括催化，信號傳導，細胞間交往和分子識別和關聯。已開發許多糖蛋白用于治療性目的。蛋白的寡糖組分可影響與治療性糖蛋白的功效關聯的性質，包括物理穩定性，對蛋白酶攻擊的抗性，與免疫系統的相互作用，藥代動力學和特定生物學活性。該性質不僅可依賴于寡糖的存在或缺失，而且依賴于寡糖的特定結構。例如，特定寡糖結構介導糖蛋白通過與特定碳水化合物結合蛋白相互作用而自血流快速清除，而其他可被抗體結合及引發不期望的免疫反應(Jenkins等人，1996)。已許可及開發為醫療劑的多數既有的治療性抗體具有人IgGl同種型，其分子量是約150kDa。人IgGl是帶有結合到抗體恒定區(Fe)的2N-聯雙觸角復合物-型寡糖的糖蛋白，其中大多數寡糖是核心巖藻糖基化的，及其通過Fe與白細胞受體(Fe Y R)或補體的相互作用訓練抗體-依賴性細胞毒性(ADCC)和補體-依賴性細胞毒性(CDC)的效應子功倉泛。最近，治療性抗體已顯示改善總體存活以及各種人惡性腫瘤，諸如乳腺，結腸和血液癌中疾病進展的時間，及癌患者的Fe Y R多態性的遺傳分析展示了 ADCC是負責臨床功效的主要抗-腫瘤機理。但是，既有許可的治療性抗體的ADCC已發現被血清強烈抑制，由于非特異性IgG競爭治療劑與自然殺傷細胞上的Fe YRIIIa的結合，其導致顯著量的藥物需求和與該治療關聯的非常聞成本。通過改善的Fe Y RIIIa結合的非-巖藻糖基化的形式的治療性抗體的增強的ADCC顯示被巖藻糖基化的對應物抑制。實際上，在該具有改善的Fe YRIIIa結合的抗體變體之中，非-巖藻糖基化的治療性抗體，不包括巖藻糖基化的形式，呈現最強和最可飽和的體外和離體ADCC，由于那些帶有天然存在的寡糖異質性和人工氨基酸突變，甚至在血漿IgG的存在下。通過在衣霉素的存在下培養來抑制人IgGl的糖基化導致，例如，此抗體對單核細胞和巨噬細胞上存在的Fe YRI受體的親和性50倍減小(Leatherbarrow等人，1990)。與Fe Y RIII受體結合也受IgG上碳水化合物的損失影響，由于已描述非-糖基化的IgG3不能經NK細胞的Fe Y RIII受體誘導ADCC類型的裂解(Lund等人，1995)。但是，除了含有聚糖的殘基的必需存在之外，其更精確地是它們的可導致起始效應子功能的能力的差異的結構的異質性。已進行研究，以研究寡糖殘基對抗體生物學活性的功能。已顯示，IgG的唾液酸對ADCC無效應(Boyd等人，1995)。幾個報道顯示，Gal殘基增強ADCC (Kumpel等人，1994)。兩斷GlcNac,其是轉移到核心β -甘露糖(Man)殘基的β，4_GlcNac殘基，已牽涉治療性抗體的生物學殘基(Lifely等人，1995，Shield等人，2002)揭示了巖藻糖基化的寡糖對抗體效應子功能的效應；Fuc-缺陷型IgGl顯示了 50倍增加的結合Fe Y RIII及增強的ADCC。今天，用于治療性應用(即癌，炎性疾病…)的廣范圍的重組蛋白包括糖基化的單克隆抗體。為治療和經濟的原因，在獲得更高特異性抗體活性上有大的興趣。一種獲得大的效力增加，而維持在細胞系中的簡單產生過程和潛在地避免顯著，不期望的副作用的方式在于增強MAb的天然的，細胞-介導的效應子功能。因而，加工IgG的寡糖可產生優化的ADCC，其被認為是一些治療性抗體的主要功能，盡管抗體具有多種治療功能(例如抗原結合，凋亡誘導，及⑶C)。一般而言，嵌合及人源化的抗體通過使用遺傳重組技術制備及通過使用CHO細胞作為宿主細胞產生。為了修飾抗體的糖鏈結構，已嘗試各種方法，有針對與糖鏈修飾相關的酶的抑制物的應用，突變體的選擇，或編碼與糖鏈修飾相關的酶的基因的導入。GLYCART BIOTECHNOLOGY AG (Zurich, CH)在中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系中表達了催化兩斷GlcNac殘基添加到N-聯寡糖的N-乙酰-葡萄糖胺基轉移酶III(GnTIII),并顯示產生的 IgGl 抗體的更大 ADCC (W099/54342;W003/011878;W02005/044859)。通過自抗體的Fe部分移出或代替巖藻糖，KYOffA HAKKO KOGYO (Tokyo,日本)增強了 Fe結合及改善了 ADCC，由此改善了 MAb的功效(US6，946，292)。近來，More recently, Laboratoire Fdu Fractionnement et des
Biotechnologies (LFB)(法國)顯示，MAb寡糖中的比Fuc/Gal應是等同或少于0.6,以獲得具有高ADCC的抗體(FR2861080)。P.M.Cardarelli 等人(Cancer Immunol.1mmunother.2010, 59:257-265)在編碼a I, 6-巖藻糖基轉移酶的FUT8基因缺陷的M-704PF CHO細胞中產生抗-⑶19抗體。此文章中抗體的非-巖藻糖基化需要酶-缺陷型細胞系的加工。此文章考慮了氨基酸突變。John Lund等人(Journal of Immunology, 1996，vol.157，n0.11，pp4963_4969)描述了非糖基化的人嵌合IgG3保留了結合人Clq及引發通過豚鼠C介導的裂解的顯著能力。效應子功能諸如⑶C和ADCC是可為對于MAb的臨床功效重要的效應子功能。全部這些效應子功能由抗體Fe區介導，及使作者嘗試氨基酸修飾，或多或少成功。糖基化，尤其是，Fe區的巖藻糖基化對抗體功效具有顯著影響。此使作者修飾CHO細胞中的抗體產生條件，以便在此再次嘗試變化糖基化特征，以改善一些效應子功能，再次或多或少成功。增強嵌合MAb抗-CD19MAb4G7的ADCC的方法公開于US2007/0166306。通過使用人哺乳動物293T-細 胞系，在β (1，4)-N-乙酰葡萄糖胺基轉移酶III (GnTIII)酶的存在下，在對于抗體產生有效的條件下產生MAb4G7，由含有(I)至少60%N-乙酰葡萄糖胺雙選擇寡糖和(2)僅10%的非巖藻糖基化的N-乙酰葡萄糖胺雙選擇寡糖的Asn297-連接的寡糖表征的Fe片段。H.M.Horton 等人(Cancer Res.2008, 68(19):8049-8057)描述具有 S239D和 I332E突變的Fe-加工的抗-CD19抗體。將此在本文被稱為Fcl4的Fe結構域與本發明的被稱為chR005-Fc20 (F243L/R292P/Y300L/V305L/P396L)的 Fe 結構域比較。本發明的 Fe 結構域在全血效應細胞的存在下顯示ADCC，然而用Fcl4，在相同的條件下，在含有循環天然的免疫球蛋白的全血的存在下未檢測到顯著ADCC活性。哺乳動物細胞是用于產生治療性糖蛋白的優選的宿主，由于它們以為人應用最相容的形式糖基化蛋白的能力(Jenkis等人，1996)。細菌非常罕見糖基化蛋白，且如同其他類型的常見的宿主，諸如酵母，絲狀真菌，昆蟲和植物細胞產生與自血流快速清除關聯的糖基化模式。在哺乳動物細胞之中，中國倉鼠卵巢(CHO)細胞已在最近二十年期間最通常使用。除了給出適合的糖基化模式之外，這些細胞允許遺傳穩定的，高產率克隆細胞系的一致的產生。它們可在簡單生物反應器中使用無血清的培養基培養到高密度，及允許安全的和可再現的生物過程的開發。其他通常使用的動物細胞包括幼倉鼠腎(BHK)細胞，NSO-及SP2/0-小鼠骨髓瘤細胞。也已測試自轉基因動物產生(Jenkins等人，1996)。由于糖鏈結構在抗體的效應子功能中起到顯著地重要作用，且在由宿主細胞表達的糖蛋白的糖鏈結構中觀察到差異，可用于產生具有更高效應子功能的抗體的宿主細胞的開發已經是目的。為了修飾產生的糖蛋白的糖鏈結構，已嘗試各種方法，諸如(I)針對與糖鏈修飾相關的酶的抑制物的應用，(2)細胞突變體的選擇，(3)編碼與糖鏈修飾相關的酶的基因的導入，等。特定例在以下描述。針對與糖鏈修飾相關的酶的抑制物的例包括:衣霉素，其選擇性地抑制GIcNAc-P-P-DoI的形成,這是N-糖苷-連接的糖鏈的前體的核心寡糖的形成的第I步驟；粟精胺和W-甲基-1-脫氧野尻霉素，其是糖苷酶I的抑制物；溴牛菜醇，其是糖苷酶II的抑制物；1_脫氧野尻霉素和1，4-二氧基-1，4-亞氨基-D-甘露糖醇,其是甘露糖苷酶I的抑制物；苦馬豆素，其是甘露糖苷酶II的抑制物；苦馬豆素，其是甘露糖苷酶II的抑制物等。特異于糖基轉移酶的抑制物的例包括:針對N-乙酰葡萄糖胺轉移酶V (GnTV)的底物的脫氧衍生物等。也知道，1-脫氧野尻霉素抑制復合物類型糖鏈的合成，和增加高甘露糖類型和混合型糖鏈的比(Glycobiology series2_Destiny of Sugar Chain in Cell,由Katsutaka Nagai, Senichiro Hakomori 和 Akira Kobata, 1993 編輯X主要選擇及獲得關于與糖鏈修飾相關的酶的活性的細胞突變體作為耐凝集素的細胞系。例如，已使用凝集素獲得具有各種糖鏈結構的CHO細胞突變體作為耐凝集素的細胞系，所述凝集素諸如WGA (源于小麥(T.vulgaris)的小麥胚凝集素)，ConA (源于直立刀豆(C.ensiformis)的伴刀豆球蛋白A), RIC (源于蓖麻(R.communis)的毒素)，L-PHA (源于菜豆(P.vulgaris)的白細胞凝集素),LCA (源于兵豆(L.culinaris)的扁豆凝集素),PSA(源于豌豆(P.sativum)的豌豆凝集素)等(Genet et al.1986)。作為通過將與糖鏈修飾相關的酶的基因導入宿主細胞獲得的產物的糖鏈結構的修飾的一例，已報道，許多唾液酸加入糖鏈的非-還原端的蛋白可通過將大鼠β-半乳糖苷酶-a-5，6-唾液酸轉移酶導入CHO細胞來產生。不同類型的糖蛋白-修飾糖基轉移酶也可在宿主系統中表達，諸如GnT III，或，替代性地，b(l，4)-N-乙酰葡萄糖胺基轉移酶V (GnTV), β (1，4)-半乳糖基轉移酶(GalT)和甘露糖苷酶II (Man II)。W020070166306涉及禽胚胎來源的干細胞系，命名的EBx㊣，用于產生蛋白和更特別糖蛋白，諸如相比用通常的CHO細胞欠巖藻糖基化的抗體的用途。Ramesh Jassal等人用FA243突變或通過使用大鼠a2，6_唾液酸轉移酶轉染的CHO-Kl細胞系產生抗NIP IgG3抗體的唾液酸化。FA243IgG3具有由補體的靶細胞裂解恢復的a2, 6和a2, 3唾液酸化。John Lund等人(Journal of Immunology, 1996，vol.157，n0.11，pp4963_4969)描述，非糖基化的人嵌合IgG3保留了結合人Clq及引發通過豚鼠C介導的裂解的顯著能力。本發明人評價了由未用糖基化抑制物修飾的及未處理的中國倉鼠卵巢細胞CHO/DG44細胞(由ECACC購買的)產生的針對⑶19抗原的人IgGl亞類的各種Fe嵌合變體抗體的糖基化特征。通過分析及比較產生的chR005-lFc0和優化的chR005-lFc20變體抗體的糖鏈的結構，本發明提供，無任何加工的野生型CHO宿主細胞表達感興趣的和有價值的糖基化特征，尤其低巖藻糖水平和/或高寡甘露糖水平和/或更高水平的唾液酸化的糖型。發明概述本發明提供結合人B細胞標記物的嵌合，人源化的及人抗-⑶19抗體，抗-⑶19抗體融合蛋白，及其片段。優化治療性抗體功能性(例如.ADCC, CDC)的當前方法聚焦在天然Fe區的氨基酸修飾或糖基化狀態的修飾。相反，本發明基于關乎氨基酸修飾和糖基化修飾的同時組合的方法。本發明涉及蛋白的糖基化加工領域。更特定，本發明針對通過使用野生型哺乳動物CHO細胞系的蛋白的糖基化加工，以通過用具有改善的治療性性質，諸如有效ADCC然而親本分子(鼠或野生型嵌合抗體)不可檢測地呈現此功能的氨基酸突變來提供變體蛋白。本發明的分子仍保留了由親本鼠抗體賦予的凋亡性效應子功能。更具體而言，本創新涉及用來自IgGl同種型的Fe區修飾免疫球蛋白中的抗體官能性，以具有引發CDC效應子功能的能力。更特別是，本發明的分子呈現ADCC的互補活化和有效誘導二者。本發明的分子對于B細胞病癥，諸如但不限于，B細胞惡性腫瘤的治療，對于自身免疫疾病的治療和預防，及對于人移植受者中的移植物-抗宿主疾病(GVHD)，體液拒絕和移植后淋巴組織增生性病癥的治療和預防，對于用出治療性抗體諸如但不限作為抗-CD20抗體治療的或對于用出治療性抗體諸如但不限作為抗-CD20抗體的聯合治療難治性的患者特別有用。本工作旨在產生克服這些缺點的具有修飾的Fe區的抗-⑶19抗體。發明人展示，這些抗-CD19抗體的Fe區內的氨基酸修飾可具有不僅對于效應子功能，包括ADCC和/或CDC的結果，而且直接對于抗體的糖基化特征。它們尤其是展示，Fe區內的一些修飾可導致抗-CD19抗體具有感興趣的和有價值的糖基化特征，尤其當抗體在哺乳動物細胞，包括野生型哺乳動物細胞，尤其是嚙齒動物細胞，尤其CHO細胞，諸如野生型dhfr+CHO細胞(由ATCC收集購買的)產生 或表達時，低巖藻糖水平和/或高寡甘露糖水平和/或更高水平的唾液酸化的糖型。本發明的第I目的旨在提供賦予感興趣的和有價值的糖基化特征，尤其對抗-CD19抗體，包括在哺乳動物細胞，尤其嚙齒動物細胞，諸如CHO細胞，優選野生型細胞，諸如野生型CHO細胞中產生的或表達的抗體的低巖藻糖水平和/或高寡甘露糖水平和/或更高水平的唾液酸化的糖型的修飾的Fe區。通過定義，野生型表示細胞未修飾或加工，以便修飾天然細胞的糖基化機理。本發明的第2目的旨在提供給含有此Fe區的抗-⑶19抗體賦予ADCC功能的修飾的Fe區。本發明的第3目的旨在提供給含有此Fe區的抗-⑶19抗體賦予⑶C功能的修飾的Fe區。本發明的第4目的旨在提供給含有此Fe區的抗-⑶19抗體賦予ADCC和⑶C功能的修飾的Fe區。本發明的第5目的旨在提供給含有此Fe區的抗-⑶19抗體賦予ADCC和/或⑶C功能，且此外，當在哺乳動物細胞，尤其是嚙齒動物細胞，諸如CHO細胞，包括野生型中產生的或表達時賦予感興趣的和有價值的糖基化特征，尤其低巖藻糖水平和/或高寡甘露糖水平和/或更高水平的唾液酸化的糖型的修飾的Fe區。發明詳述
本發明的第I對象是抗-⑶19抗體，其被修飾為包含變體人IgGlFc區，其中此變體區在人 IgGlFc 區的各氨基酸第 243，292，300，305，326，396 或 243，292，300，305，326，333，396位包含氨基酸取代。Fe區內的氨基酸殘基根據Kabat 的編號系統編號。本發明的重組抗-⑶19抗體在野生型細胞，尤其嚙齒動物細胞，諸如尤其是野生型CHO中產生之后具有感興趣的糖基化特征。尤其是，自轉染的細胞，例如野生型CH0，本發明允許表達大比例的重組抗體或其片段，攜帶包含具有半乳糖基化及非-巖藻糖基化的末端GlcNac的長鏈的雙觸角-型的常見的N-聯寡糖結構。一種或更多糖型存在于重組抗-⑶19抗體群。糖型是僅關于附接的聚糖的數或類型不同的蛋白的同種型。
在非常令人驚訝的和有價值的實施方式中，抗體具有低巖藻糖水平。此是指在這些細胞，例如野生型CHO中產生的重組抗-⑶19抗體群之中，在此實施方式中，非-巖藻糖基化的抗體的比例占抗體的大致至少40%，優選大致至少60%，更優選大致至少80%或更高，例如至少85%。更具體而言，非-巖藻糖基化關乎Fe。作為CHO 細胞，提及的可為 CHO dhfr-/-，CH0/DG44 和 CHOEasy C。本發明的特定對象是抗-⑶19抗體，其被修飾為包含變體人IgGlFc區，其中此變體區在人 IgGlFc 區的各氨基酸第 243，292，300，305，326，396 或 243，292，300，305，326，333，396位包含氨基酸取代，且其中抗體已在野生型嚙齒動物細胞，優選野生型CHO細胞中產生。根據優選的特征，此抗體具有低水平的巖藻糖。本發明的另一對象是抗-⑶19抗體，其被修飾為包含變體人IgGlFc區，其中此變體區在人 IgGlFc 區的各氨基酸第 243，292，300，305，326，396 或 243，292，300，305，326，333，396位包含氨基酸取代，具有低巖藻糖水平。根據本發明，低水平的巖藻糖是指(I)在一抗體，尤其在其Fe中減少的量的巖藻糖或(2)尤其在它們的Fe中具有減少的量的巖藻糖和/或無巖藻糖的組中的大量的抗體。在本說明書中，說到本發明的Fe或2個Fe的抗體。即便不每次提及，有對于每實施方式優選的情況，其中抗體具有2個Fe和各Fe之一具有類似結構(相同的突變)和類似糖基化特征。在一實施方式中，本發明的抗體具有Fe，優選2個不帶有(GlcNAc) 2 (Fuc)!+ (Man) 3 (GlcNAc) 2 聚糖的 Fe。在一實施方式中，本發明的抗體具有Fe，優選2個不帶有(Gal)1(GlcNAc)2(Fuc)1+(Man)3(GlcNAc)2 聚糖的 Fe。在一實施方式中，本發明的抗體具有Fe，優選2個不帶有(GlcNAc) 2 (Fuc)!+ (Man) 3 (GlcNAc) 2 聚糖和不帶有(Gal)! (GlcNAc) 2 (Fuc)丄+ (Man) 3 (GlcNAc) 2聚糖的Fe。在一實施方式中，本發明的抗體包含Fe，優選2個帶有(Man)5(GlcNAc)2聚糖的Fe。在一實施方式中，本發明的抗體包含Fe，優選2個帶有(Man)5(GlcNAc)2聚糖的Fe和無(GlcNAc) 2 (Fuc)!+ (Man) 3 (GlcNAc) 2 聚糖和 / 或,優選及，無(Gal)! (GlcNAc) 2 (Fuc)丄+ (Man)3(GlcNAc)2 聚糖的 Fe。在一實施方式中，抗體包含Fe，優選2個帶有以下聚糖之I種或2種的Fe:
.(Gal)! (GlcNAc) 2 (Fuc)! (NeuAc)!+ (Man) 3 (GlcNAc) 2.(Gal)2(GlcNAc)2(Fuc)1(NeuAc)A(Man)3(GlcNAc)2在一實施方式中，本發明的抗體包含Fe，優選2個帶有(Man)5 (GlcNAc)2聚糖的Fe和無(GlcNAc) 2 (Fuc)!+ (Man) 3 (GlcNAc) 2 聚糖和 / 或,優選及，無(Gal) i (GlcNAc) 2 (Fuc)丄+ (Man)3(GlcNAc)2聚糖,及I個或2個以下聚糖的Fe:# (Gal)1(GlcNAc)2(Fuc)1(NeuAc)A(Man)3(GlcNAc)2# (Gal) 2 (GlcNAc) 2 (Fuc) j (NeuAc) j+ (Man) 3 (GlcNAc) 2本發明的另一對象是抗-CD19抗體，抗-CD19抗體，其被修飾為包含變體人IgGlFc區，其中此變體區在人IgGlFc區的各氨基酸第243，292，300，305，326，396或243，292，300, 305，326，333，396位包含氨基酸取代，且其中抗體具有Fe，優選2個不帶有(GlcNAc) 2 (Fuc)!+ (Man) 3 (GlcNAc) 2 聚糖的 Fe 和 / 或，優選及，不帶有(Gal)工(GlcNAc) 2 (Fuc) J(Man)3 (GlcNAc)2聚糖的Fe。在一實施方式中，本發明的抗體包含Fe,優選2個帶有(Man)5(GlcNAc)2聚糖的Fe。在一實施方式中,抗體包含Fe,優選2個帶有以下聚糖之I種或2種的Fe:# (Gal) j (GlcNAc) 2 (Fuc) j (NeuAc) j+ (Man) 3 (GlcNAc) 2# (Gal) 2 (GlcNAc) 2 (Fuc) j (NeuAc) j+ (Man) 3 (GlcNAc) 2在仍非常令人驚訝的和有價值的實施方式中，抗體具有高寡甘露糖水平。此是指在這些細胞,例如野生型CHO中產生的重組抗-⑶19抗體群之中，特征為更高水平的寡甘露糖的抗體的比例占抗體的大致至少20%，優選大致至少30%，更優選大致至少40%，仍更優選大致至少50%或更高。 在仍非常令人驚訝的和有價值的實施方式中，在這些細胞，例如野生型CHO中產生的重組抗體群之中，特征為更高水平的唾液酸化的糖型的抗體的比例占抗體的大致至少1.5%，優選大致至少2.5%，更優選大致至少5%或更高。在優選的實施方式中，本發明的抗體組合這些特征，尤其低巖藻糖水平和高寡甘露糖水平和/或更高水平的唾液酸化的糖型的3種。尤其是，本發明的轉染的細胞，例如野生型CHO細胞允許表達大比例的抗體或其片段，攜帶包含具有半乳糖基化及非-巖藻糖基化的末端GlcNac的長鏈及給抗體賦予強ADCC活性的雙觸角-型的常見的N-聯寡糖結構。在一實施方式中，抗-CD19抗體具有本發明的特定糖基化特征，尤其低巖藻糖水平和/或高寡甘露糖水平和/或更高水平的唾液酸化的糖型，所述抗體是在哺乳動物細胞，優選野生型哺乳動物細胞，優選嚙齒動物來源，尤其CHO細胞中產生或表達的，或要產生的或表達的。本發明也具有作為根據本發明的對象抗體組(或抗體組合物)，其中其包含抗-⑶19抗體，其被修飾為包含變體人IgGlFc區，其中此變體區在人IgGlFc區的各氨基酸第 243，292，300，305，326，396 或 243，292，300，305，326，333，396 位包含氨基酸取代。根據特征，抗體組已在野生型嚙齒動物細胞，優選野生型CHO細胞中產生。根據另一特征，抗體組具有低水平的巖藻糖。根據再一特征，抗體組已在野生型嚙齒動物細胞，優選野生型CHO細胞中產生。在第I實施方式中，此組包含少于或等于15%的該抗-⑶19抗體，其包含Fe，優選2個帶有(GlcNAc)2(Fuc)A(Man)3(GlcNAc)2聚糖的Fe和/或,優選及,該抗體的少于或等于 20%，其包含 Fe，優選 2 個帶有(Gal): (GlcNAc) 2 (Fuc) ^ (Man) 3 (GlcNAc) 2 聚糖的 Fe。糖型
百分率以數％表達。在另一實施方式中，抗體組包含抗體的至少15，20，30，40或50%，其包含Fe，優選2個帶有(Man)5(GlcNAc)2聚糖的Fe。在一實施方式中，值是至少15%。在另一實施方式中，組包含少于或等于15%的該抗-⑶19抗體，其包含Fe，優選2個帶有(GlcNAc)2(Fuc)^(Man)3(GlcNAc)2聚糖的Fe和/或，優選及，該抗體的少于或等于20%，其包含 Fe，優選 2 個帶有(Gal) i (GlcNAc) 2 (Fuc) ^ (Man) 3 (GlcNAc) 2 聚糖的 Fe，及抗體的至少15，20，30，40或50%，其包含Fe，優選2個帶有(Man) 5 (GlcNAc) 2聚糖的Fe。在優選的實施方式中抗體組包含全部這些特征。在一實施方式中，寡甘露糖的值是至少15%。在另一實施方式中，抗體組包含:籲抗體的少于1.5或1%，其包含Fe，優選2個帶有(Gal)! (GlcNAc) 2 (Fuc)! (NeuAc)^ (Man) 3 (GlcNAc)2 的 Fe (典型為 0.1 1.5%)，和 / 或優選，籲抗體的少于2或1.5%，其包含Fe，優選2個帶有(Gal) 2 (GlcNAc) 2 (Fuc) i (NeuAc)i+(Man)3(GlcNAc)2 的 Fe (典型為 0.1 2)。在再一實施方式中，組包含少于或等于15%的該抗-⑶19抗體，其包含Fe，優選2個帶有(GlcNAc)2(Fuc)^(Man)3(GlcNAc)2聚糖的Fe和/或，優選及，該抗體的少于或等于20%，其包含 Fe，優選 2 個帶有(Gal) i (GlcNAc) 2 (Fuc) ^ (Man) 3 (GlcNAc) 2 聚糖的 Fe，及抗體的至少15，20，30，40或50%,其包含Fe，優選2個帶有(Man) 5 (GlcNAc) 2聚糖的Fe，及還是籲抗體的少 于1.5或1%，其包含Fe，優選2個帶有(Gal) i (GlcNAc) 2 (Fuc) i (NeuAcV(Man)3(GlcNAc)2 的 Fe,和 / 或,優選 抗體的少于 2 或 1.5%，其包含 Fe，優選 2 個帶有(Gal) 2 (GlcNAc) 2 (Fuc): (NeuAc)^(Man)3(GlcNAc)2的？0。在優選的實施方式中，抗體組包含全部這些特征。在一實施方式中，寡甘露糖的值是至少15%。本發明的另一對象是根據本發明的抗體組(或抗體組合物)，其中其包含抗-⑶19抗體，其被修飾為包含變體人IgGlFc區，其中此變體區在人IgGlFc區的各氨基酸第 243，292，300，305，326，396 或 243，292，300，305，326，333，396 位包含氨基酸取代，且其中組包含少于或等于15%的該抗-⑶19抗體，其包含Fe，優選2個帶有(GlcNAc)2(Fuc)A(Man)3(GlcNAc)2聚糖的Fe和/或,優選及,該抗體的少于或等于20%,其包含 Fe，優選 2 個帶有(Gal) I (GlcNAc) 2 (Fuc) ^ (Man) 3 (GlcNAc) 2 聚糖的 Fe。在另一實施方式中，抗體組包含至少20，30，40或50%的抗體，其包含Fe，優選2個帶有(Man)5(GlcNAc)2聚糖的Fe。在一實施方式中，值是至少15%。在另一實施方式中，組包含少于或等于15%的該抗-⑶19抗體，其包含Fe，優選2個帶有(GlcNAc)2(Fuc)^(Man)3(GlcNAc)2聚糖的Fe和/或，優選及，該抗體的少于或等于20%，其包含 Fe，優選 2 個帶有(Gal) i (GlcNAc) 2 (Fuc) ^ (Man) 3 (GlcNAc) 2 聚糖的 Fe，及抗體的至少15，20，30，40或50%，其包含Fe，優選2個帶有(Man) 5 (GlcNAc) 2聚糖的Fe。在優選的實施方式中，抗體組包含全部這些特征。在一實施方式中，寡甘露糖的值是至少15%。在另一實施方式中，抗體組包含:籲抗體的少于1.5或1%，其包含Fe，優選2個帶有(Gal) i (GlcNAc) 2 (Fuc) i (NeuAcV(Man)3(GlcNAc)2 的 Fe,和 / 或,優選籲抗體的少于2或1.5%，其包含Fe，優選2個帶有(Gal) 2 (GlcNAc) 2 (Fuc) i (NeuAc)j+ (Man) 3 (GlcNAc) 2 的 Fe。在再一實施方式中，組包含少于或等于15%的該抗-⑶19抗體，其包含Fe，優選2個帶有(GlcNAc)2(Fuc)^(Man)3(GlcNAc)2聚糖的Fe和/或，優選及，該抗體的少于或等于20%，其包含 Fe，優選 2 個帶有(Gal) i (GlcNAc) 2 (Fuc) ^ (Man) 3 (GlcNAc) 2 聚糖的 Fe，及抗體的至少15，20，30，40或50%,其包含Fe，優選2個帶有(Man) 5 (GlcNAc) 2聚糖的Fe，及還是籲抗體的少于1.5或1%，其包含Fe，優選2個帶有(Gal) i (GlcNAc) 2 (Fuc) i (NeuAcV(Man)3(GlcNAc)2 的 Fe,和 / 或,優選

抗體的少于 2 或 1.5%，其包含 Fe，優選 2 個帶有(Gal) 2 (GlcNAc) 2 (Fuc): (NeuAc)^(Man)3(GlcNAc)2的？0。在優選的實施方式中，抗體組包含全部這些特征。在一實施方式中，寡甘露糖的值是至少15%。在一實施方式中，細胞是嚙齒動物細胞，尤其是CHO細胞。在一實施方式中，細胞是野生型嚙齒動物細胞，尤其野生型CHO細胞。在一實施方式中，抗-⑶19抗體能產生⑶C或⑶C+ADCC活性。在一實施方式中，此抗-⑶19抗體能產生⑶C或⑶C+ADCC活性及呈現本發明的特定糖基化特征，尤其本發明的低巖藻糖水平和/或高寡甘露糖水平和/或更高水平的唾液酸化的糖型。本發明的抗體可在Fe區中包含補充性突變。在一實施方式中，Fe區還在氨基酸第333位包含氨基酸取代。人IgG Fe區可為IgG亞-類的區。其可為IgGl，IgG2，IgG3或IgG4的Fe區。在優選的實施方式中，Fe區是IgGlFc區。根據本發明取代的Fe區的氨基酸可被任何氨基酸取代，條件是取代的氨基酸的全體組能產生此⑶C或⑶C+ADCC活性和/或賦予本發明的特定糖基化特征，尤其本發明的低巖藻糖水平和/或高寡甘露糖水平和/或更高水平的唾液酸化的糖型。可能的取代的例給出如下。在一實施方式中，Phe243被Leu取代。在一實施方式中，Arg292被Pro取代。在一實施方式中，Tyr300被Leu取代。在一實施方式中，Val305被Leu取代。在一實施方式中，Lys326被Ala取代。在一實施方式中，Glu333被Ala取代。在一實施方式中，Pro396被Leu取代。在一實施方式中，抗-CD 19抗體包含Fe區，其中Phe243被Leu取代，Arg292被Pro取代，Tyr300被Leu取代，Val305被Leu取代，Lys326被Ala取代和Pro396被Leu取代。在一實施方式中，此Fe區具有示于SEQ ID NO:1的氨基酸序列(Fc34)。編碼此Fe區的核酸示于SEQ ID NO:2。在另一實施方式中，抗-CD19抗體包含Fe區其中，Phe243被Leu取代，Arg292被Pro 取代，Tyr300 被 Leu 取代，Val305 被 Leu 取代，Lys326 被 Ala 取代，Glu333 被 Ala 取代，及Pro396被Leu取代。在另一實施方式中，此Fe區具有示于SEQ ID NO: 3的氨基酸序列(Fc24)。編碼此Fe區的核酸示于SEQ ID N0:4。可在本發明的多肽的結構中制造修飾和變化，而仍獲得具有如特征的分子。例如，無可同意的活性損失地，序列中的特定氨基酸可用其他氨基酸代替。因為其是多肽的相互作用能力和性質，定義多肽的生物學功能活性，可在多肽序列(或，當然，其成為基礎的編碼序列的DNA)中制造特定氨基酸序列取代和然而獲得具有類似性質的多肽。在制造該變化中，可考慮氨基酸的親水性指數。本領域通常明白給多肽賦予相互作用生物學功能的親水性氨基酸指數的重要性(Kyte et al.1982)。已知，特定氨基酸可用具有類似親水性指數或分值的其他氨基酸代替，而仍導致具有類似生物學活性的多肽。各氨基酸已基于其疏水性和荷電特征分配親水性指數。認為，氨基酸的相對親水性表征確定得到的多肽的二級結構，其進而限定多肽與其他分子，例如，酶，底物，受體，抗體，抗原，等的相互作用。如為本領域所知，氨基酸可由具有類似親水性指數的另一氨基酸取代，和仍獲得以生物學方式功能性地相當的多肽。在該變化中，優選其親水性指數在±2之內的氨基酸的取代，特別優選在±1之內的那些，及甚至更特別優選在±0.5之內的那些。也可基于親水性制造類似氨基酸的取代，特別當由此創建的生物學功能性地相當的肽或多肽旨在免疫學實施方式中使用。美國專利4，554，101，通過引用在本文合并，說到多肽的最大局部平均親水性，如由其相鄰氨基酸的親水性管理的，與其免疫原性和抗原性，即與多肽的生物學性質關聯。如在美國專利4，554，101中細節化，以下親水性值已分配給氨基酸殘基:精氨酸(+3.0);賴氨酸(+3.0);天冬氨酸(+3.0 + 1);谷氨酸(+3.0 + 1);絲氨酸(+0.3);天冬酰胺(+0.2);谷氨酰胺(+0.2);甘氨酸(O);脯氨酸(-0.5 + 1);蘇氨酸(-0.4);丙氨酸(-0.5)；組氨酸(-0.5);半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3);纈氨酸(-1.5);亮氨酸(-1.8);異亮氨酸(-1.8);酪氨酸(-2.3);苯丙氨酸(-2.5);色氨酸(-3.4)。需知，氨基酸可用具有類似親水性值的另一氨基酸代替，而仍獲得生物學相當體，且尤其是，免疫學相當體，多肽。在該變化中，優選其親水性值在±2之內的氨基酸的取代，特別優選在±1之內的那些，及甚至更特別優選在±0.5之內的那些。如上所述，氨基酸取代通常因此基于氨基酸側鏈取代基的相對相似性，例如，它們的疏水性，未水性，電荷，尺寸，等。
權利要求
1.抗-⑶19抗體，其被修飾為包含變體人IgGFe區，優選IgGlFc區，其中此變體區在人IgG Fe區的各第243，292，300，305，326和396氨基酸位和任選地第333氨基酸位包含氨基酸取代，其中Fe區中氨基酸殘基的編號是Kabat 的編號。
2.權利要求1的抗體，其中所述抗體已在野生型嚙齒動物細胞，優選野生型CHO細胞中產生。
3.前述權利要求之任一項的抗體，其具有Fe，優選2個不帶有(GlcNAc) 2 (Fuc)!+ (Man) 3 (GlcNAc) 2 聚糖的 Fe。
1.前述權利要求之任一項的抗體，其具有Fe，優選2個不帶有(Gal)1(GlcNAc)2(Fuc)I+ (Man)3(GlcNAc)2 聚糖的 Fe。
2.前述權利要求之任一項的抗體，其包含Fe，優選2個帶有(Man)5(GlcNAc)2聚糖的Fe。
3.前述權利要求之任一項的抗體，其包含Fe，優選2個帶有以下聚糖之I種或2種的Fe:#(Gal)j (GlcNAc)2(Fuc)j(NeuAc)j+(Man)3(GlcNAc)2,#(Gal)2(GlcNAc)2(Fuc)j(NeuAc)j+(Man)3(GlcNAc)2。
4.前述權利要求之任一項的抗體，其是ADCC+和⑶C+。
5.前述權利要求之任一項的抗體，其中抗體識別CD19抗原上的非-內化表位，優選包含其VH和VL氨基酸序列以下表所示的抗體mR005-l或mR005_2的CDR的抗體，或更優選，包含那些序列的抗體:
6.前述權利要求之任一項的抗體，其包含Fe區，其中Phe243被Leu取代，Arg292被Pro取代，Tyr300被Leu取代，Val305被Leu取代，Lys326被Ala取代和Pro396被Leu取代，且可能是Glu333被Ala取代。
7.前述權利要求之任一項的抗體，其中所述抗體是嵌合抗體，人源化的抗體，全人抗體，雙特異性酸抗體，抗體藥物綴合物或抗體片段。
8.前述權利要求之任一項的抗體，其引發程序性細胞死亡。
9.前述權利要求之任一項的抗體，用于治療癌的方法。
10.前述權利要求之任一項的抗體，用于治療難治性或復發抗-CD20抗體治療的患者的癌的方法。
11.前述權利要求之任一項的抗體組，其中其包含: 該抗體的少于或等于15%，其包含Fe，優選2個帶有(GlcNAc) 2 (Fuc) ^ (Man) 3 (GlcNAc) 2聚糖的Fe，和/或 該抗體的少于或等于20%，其包含Fe，優選2個帶有(Gal) i (GlcNAc) 2 (Fuc) ^ (Man) 3 (GlcNAc)2聚糖的Fe。
12.權利要求15的抗體組，其中其包含抗體的至少15，20，30，40或50%，其包含Fe，優選2個帶有(Man)5(GlcNAc)2聚糖的Fe。
13.權利要求15或16的抗體組，其中其包含:抗體的少于1.5或1%，其包含Fe，優選2個帶有(Gal) i (GlcNAc) 2 (Fuc) i (NeuAc) ^ (Μan) 3(GlcNAc)2 的 Fe,和 / 或抗體的少于2或1.5%，其包含Fe，優選2個帶有(Gal) 2 (GlcNAc) 2 (Fuc) i (NeuAc) ^ (Μan)3(GlcNAc)2 的 Fe。
14.藥物組合物，其包含前述權利要求之任一項的抗體，及生理學可接受的媒質或賦形齊U，且可能包含針對不同于CD19的腫瘤抗原的抗體，優選針對CD20的抗體。
15.權利要求16的組合物，用于治療癌或自身免疫疾病的方法。
16.權利要求10的組合物，其用作抗-腫瘤藥物或用作用于治療難治性或復發抗-CD20抗體治療的患者的癌的抗-腫瘤治療。
17.權利要求14，15或16的組合物，其包含另一抗-癌劑。
18.核酸序列，其編碼變體Fe區，其中Phe243被Leu取代，Arg292被Pro取代，Tyr300被Leu取代，Val305被Leu取代，Lys326被Ala取代和Pro396被Leu取代，且可能是Glu333被Ala取代。
19.表達載體， 其包含編碼含有VH核酸序列如SEQ ID NO: 30或SEQ ID NO: 34所示的抗體mR005_l或mR005-2的VH⑶R的多肽的核酸序列，或更優選， 核酸序列包含SEQ ID NO: 30或SEQ ID NO: 34，及在SEQ ID NO: 1，3所示的各第243，292，300，305，326和396氨基酸位，及任選地第333氨基酸位包含氨基酸取代的人Fe區。
20.表達載體， 其包含編碼含有VL核酸序列如SEQ ID NO: 32或SEQ ID NO: 36所示的抗體mR005_l或mR005-2的VL⑶R的多肽的核酸序列，或更優選， 核酸序列包含SEQ ID N0:32或SEQ ID N0:36，及人κ區。
21.宿主細胞，其含有權利要求13和/或14的載體，宿主細胞優選是野生型CHO細胞。
全文摘要
本發明涉及抗-CD19抗體，其具有賦予一種或幾種有用的效應子功能的相對于野生型Fc區具有一些特定氨基酸修飾的變體Fc區。本發明尤其涉及包含該變體Fc區的嵌合，人源化的或全人抗-CD19抗體。其有利地涉及具有感興趣的和有價值的糖基化特征，尤其低巖藻糖水平和/或高寡甘露糖水平和低水平的唾液酸化的糖型的抗體。本發明也涉及這些抗體在疾病或病癥，諸如癌，尤其B細胞惡性腫瘤，及自-免疫疾病的治療，防止或管理中的用途。
文檔編號A61K47/48GK103221068SQ201180044951
公開日2013年7月24日 申請日期2011年7月18日 優先權日2010年7月19日
發明者C·韋爾莫-德羅什, B·S·維耶爾莫 申請人:國際藥物發展生物技術公司