專利名稱：胡蘿卜苷在制備促進神經干細胞增殖藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及醫藥領域的藥物/保健品的應用，具體地說是涉及胡蘿卜苷在制備促進神經干細胞增殖藥物/保健品中的應用。
背景技術：
I.胡蘿卜苷的來源及理化性質胡蘿卜苷別名西托糖苷、谷留醇-3-0-葡萄糖苷；英文名稱Daucosterolo分子量576. 85。胡蘿卜苷是重要的植物留醇衍生物，廣泛分布于自然界，存在于植物的根、莖、葉、果實和種子中。可用乙醇加熱回流提取，經硅膠柱層析或大孔樹脂柱層析分離獲得。本品為白色粉末，在避光干燥低溫處保存，可溶于吡啶、DMS0、熱的甲醇、乙醇等，不溶于石油 醚、氯仿、水等溶劑，可用高效液相色譜-蒸發光散射檢測法測定含量[1] ([I]聞雪生，徐新剛，黃敏。HPLC-ELSD測定柏子仁箱中的胡蘿卜苷.全國中藥創新與研究論壇 論文集)。胡蘿卜苷的藥理學研究進展
關于胡蘿卜苷藥理學研究的報道并不多，其在生物、醫學方面的價值有待進一步挖掘。有文獻報道胡蘿卜苷對成骨樣細胞的增殖具有顯著的促進作用[2] ([2]孟彥彬1，孫盛2，高巍。牛膝中對成骨樣細胞UMR106有促進增殖作用的活性成分研究。時珍國醫國藥，2007，18 (12) :2947-2948。)濃度為I. 2 X 1(T 6 mg /m I時，其促進成骨樣細胞增殖的作用最強，3次實驗的最高增殖率平均為45%。另有研究表明胡蘿卜苷可預防和治療氧化低密度脂蛋白對人微血管內皮細胞造成的損傷胡蘿卜苷劑量0. 39 12. 5iig/mL時，有保護作用；劑量6. 25 12. 5 yg/mL時時，具有很強的修復作用[3] ([3]何秋艷，翁新楚。山楂活性成分對氧化低密度脂蛋白損傷人微血管內皮細胞的防治作用。上海大學學報(自然科學版)，2007，13 (6):751-756。)。此外，胡蘿卜苷亦是食用仙人掌中降糖活性的成分之一 [4] ([4]谷江霞，竇德強。食用仙人掌降糖活性成分研究。中國現代中藥，2007，19 (111) :15-16)。.與胡蘿卜苷相關的發明專利
3. I —種胡蘿卜苷植物殺螨劑及其用途(申請(專利)號CN201110140348. 7):發明提供了一種以胡蘿卜苷為主要原料，再加入溶劑、增溶劑和乳化劑等輔料制成的殺螨水乳劑，是一種對人畜安全、環境友好型的和諧農藥，對生態環境長遠發展、人類的健康和病害的綜合治理都具有深遠的意義。3. 2 —種從柏子仁中提取柏子仁油及胡蘿卜苷的方法(申請(專利)號CN201010004245. 3):發明涉及一種從柏子仁中提取柏子仁油及胡蘿卜苷的方法，采用以下步驟取柏子仁，粉碎，用石油醚提取2次，得柏子仁油；提取柏子油后的柏子仁，揮盡石油醚，用乙醇提取2次，合并濾液；合并后的濾液回收乙醇至
浸膏狀，加入占浸膏1-4重量倍的柱層析硅膠，攪拌均勻，置干燥箱中，干燥，放冷，得柱 層硅膠拌和物；
取占浸膏4-8重量倍的柱層析硅膠，用石油醚濕法裝柱，將柱層硅膠拌和物加入層析柱中，用體積比為I : I的石油醚-醋酸乙酯洗脫，洗脫至流出液近無色，改用醋酸乙酯洗脫，合并醋酸乙酯洗脫液，回收醋酸乙酯，得胡蘿卜苷粗分離物。該發明胡蘿卜苷制備工藝方法簡便，所用提取、洗脫溶劑毒性低，得到的胡蘿卜苷純度高，雜質少，易于精制，適于規模化制備或生產。3. 3蒲葵的抗腫瘤提取物及其制備方法及應用(申請(專利)號CN200510036625. 4):發明涉及一種蒲葵的體外抗腫瘤提取物，其化學成分為薯蕷皂苷元；^ 一谷留醇；豆留酮；P —胡蘿卜苷；正二十六醇等，其提取方法是將新鮮采集的蒲葵植物的根、籽、葉粉碎，用乙醇浸提過濾分離出固相和液相，液相蒸餾回收乙醇，得到黑色的浸提膏A，過濾分離出的固相，水提，濃縮，合并醇提浸提膏和水提濃縮液，分別用乙酸乙酯和石油醚提取再用硅膠柱重結晶得出單體化合物，經藥理學驗證，蒲葵提取物對7類腫瘤細胞株的生長有抑制作用。3. 4棉葉寥乙醇提取物及其制備方法和用途(申請(專利)號CN200610011169. 2):發明公開了一種寥科植物棉毛酸膜葉寥(棉葉寥)的乙醇提取物及其制備方法。該制備方法包括如下步驟取棉葉寥2. 5 — 5. 0kg，粉碎后用60 - 80%乙醇回 流提取2 — 3次，合并濾液，減壓濃縮得2200 - 4400ml濾液，離心，上清液用乙酸乙酯萃取
2- 3次，合并萃取液，減壓濃縮成干粉，行硅膠柱層析，用TLC展開劑洗脫制得粗品棉葉寥乙醇提取物。本發明棉葉寥乙醇提取物含有黃酮類成分包括槲皮素、金絲桃苷、棉葉寥黃酮A ;酚酸類成分包括香豆酸、沒食子酸、原兒茶酸；甾醇類成分包括P —谷甾醇、胡蘿卜苷。本發明的棉葉寥乙醇提取物在抗癌、治療菌痢、腸炎、治療濕疹、治療蛇咬傷等疾病時療效顯著。3. 5煙株根際堿性土壤有機調節劑(申請(專利)號CN200710180577. 5):—種煙株根際堿性土壤有機調節劑，其特征是由紫葉酢漿草、優質腐熟芝麻餅、草炭等多種有機成分組成，成分配比為低溫烘干的紫葉酢漿草10% 55%，優質腐熟芝麻餅20% 55%，草炭10% 40%。粉碎后充分混勻混合制成。本發明的優點在于通過調節煙株根際堿性土壤質量，達到降低堿性植煙土壤PH值的作用，在一定程度上較易實現；該產品安全、生態；其中酢漿草顯示較強酸性，能有效降低堿性植煙土壤的PH值，其化學成分含P —谷淄醇、胡蘿卜苷、草酸、酒石酸、蘋果酸、檸檬酸等，許多小分子有機酸對于改善植煙土壤的有效鉀及煙葉香氣，對煙葉品質的提升較為有利；腐熟芝麻餅對增加煙葉香氣較為有利；草炭對改善土壤有機質及土壤物理性狀有明顯作用。3.6 一種分離芫花條化學成分的方法(申請(專利)號CN200910015861.6):發明提供一種分離芫花條化學成分的方法，其用硅膠柱色譜法對瑞香科植物芫花枝條的乙醇提取物經石油醚、乙酸乙酯和水飽和的正丁醇深度萃取，進行化學成分的分離。室溫萃取，節約能源并可避免萃取過程中有效成分的破壞；分離得比較徹底，共獲得15種化合物；采用理化及波譜分析方法，分別鑒定為(I)十八碳酸單甘油酯、(2)鄰苯二甲酸二丁酯、(3)棕櫚酸、(4) ￠-谷甾醇、(5)咖啡酸十八烷酯、(6)咖啡酸正二十烷酯、(7)山奈酚、(8)西瑞香素、(9)芹菜素、(10)紫丁香樹脂醇、(11)木犀草素、(12) ￠-胡蘿卜苷、(13)刺五加苷
B、(14)松脂醇二葡萄糖苷、(15) 二氫刺五加苷B。其中，化合物⑴、⑵、(3)、(6)、(10)、
(13)、(14)和(15)為首次分離得到。3.7預防或治療帕金森病的藥物組合物及其制備方法(申請(專利)號CN200910135572.X):發明公開了一種預防或治療帕金森病的藥物組合物及其制備方法。該藥物組合物由刺五加苷B，刺五加苷D，丁香樹脂酚雙葡萄糖苷和胡蘿卜苷組成。本發明確定了上述4種組分的最佳劑量水平范圍，在此基礎上采用了正交試驗篩選出了上述4種活性成分之間的最佳配伍比例。實驗結果表明，將刺五加苷B，刺五加苷D，丁香樹脂酚雙葡萄糖苷和胡蘿卜苷按照I : 2 : 8 : 8的重量配伍而成的藥物組合物能顯著提高PC12細胞存活率，對多巴胺能神經細胞損傷具有顯著的保護作用。本發明所提供的刺五加有效成分化學成分簡單明確，在生產中易進行于質量控制。本發明藥物組合物可以用來制備療效好，安全可靠的預防和治療帕金森病的藥物。3. 8從亞麻根中制備腦苷脂類化合物的方法(申請(專利)號CN200510068282.X):發明公開了一種新的制備腦苷脂類化合物的方法，具體說，即從亞麻通過提取、分離和重結晶，制備腦苷脂類化合物P —胡蘿卜苷、化合物I和化合物2。神經干細胞的研究概況
神經干細胞是一類具有分裂潛能和自更新能力的母細胞，它可以通過不對等的分裂方式產生神經組織的各類細胞。Mckay于1997年在《Science》雜志上將神經干細胞的概念總 結為具有分化為神經元、星形膠質細胞及少突膠質細胞的能力，能自我更新并足以提供大量腦組織細胞的細胞。各種成年哺乳動物腦內都存有神經干細胞，其具有長期自我更新能力。包括人類在內的各種成年哺乳動物腦組織終生都有新神經元生成，新神經元主要誕生于海馬齒狀回和室管膜下區，然后遷移至目的。這些新生神經元在遷移過程中逐漸成熟，行使生理功能。神經干細胞具有以下特點①自我更新具有對稱分裂及不對稱分裂兩種分裂方式，從而保持干細胞庫穩定。②多向分化潛能可以向神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞分化。③低免疫源性是未分化的原始細胞，不表達成熟的細胞抗原，不被免疫系統識別。④組織融合性好可以與宿主的神經組織良好融合，并在宿主體內長期存活。⑤分裂的慢周期性絕大多數干細胞處于GO期，細胞增殖緩慢。神經干細胞在神經發育和修復受損神經組織中發揮重要作用，是修復和代替受損腦組織的有效方法，能重建部分環路和功能。另一方面，隨著機體衰老，神經干細胞的數量和質量都呈下降趨勢，其增殖能力和活性隨著年齡的增長而降低，大腦細胞的穩態更新受到破壞，新生的細胞無法及時替代衰老的細胞，神經功能下降而步向衰老。神經干細胞的活性和增殖能力與神經再生的需求兩者之間的矛盾決定了大腦的衰老進程。由于絕大多數神經干細胞處于GO期，細胞增殖緩慢，從而限制其修復功能的發揮。如果藥物分子能促進神經干細胞增殖，則能增強其修復功能，乃至延緩大腦衰老。能促進神經干細胞增殖的物質有堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、表皮生長因子(EGF)等細胞因子；有睪酮、脫氫表雄酮、胰島素樣生長因子、紅細胞生成素、甲狀腺激素等激素類物質；亦有人參皂苷Rgl、黃芪甲苷、淫羊藿苷、知母皂苷等小分子藥物。上述能促進神經干細胞增殖的物質，其應用具有局限性大分子物質難以透過血腦屏障，攝入過多外源性激素易導致內源性激素釋放紊亂，而小分子藥物來源有限，價格昂貴，長期服用可能有一定的不良反應。因而，價廉易得、低毒高效的“神經干細胞促生長劑”蘊藏著巨大的醫療和保健價值。本發明人發現胡蘿卜苷能促進神經干細胞增殖，作用顯著，安全性好。鑒于胡蘿卜苷來源廣泛、提取方便，價廉易得的特點，使其開發成為“神經干細胞促生長劑”將帶來顯著的社會效益和經濟效益。

發明內容
本發明的目的在于提供胡蘿卜苷在醫療和保健品中的新用途，即胡蘿卜苷在制備促進神經干細胞增殖藥物中的應用，及其在制備促進神經干細胞增殖保健品中的應用。本發明通過離體和整體實驗，證實胡蘿卜苷具有促進神經干細胞增殖的作用。具體實驗如下
I.離體實驗 I. I實驗動物
懷孕14-16天的SD孕大鼠10只，由浙江省實驗動物中心提供，合格證號SCXK (浙)2008-0033.
I. 2主要試劑及試劑配制Neuralbasal培養基(GIBC0公司產品，Lot 1094141)、B 27培養基添加劑(GIBC0公司產品，Lot 1159693);大鼠 b-FGF 及 EGF (Pepro TECH 公司產品，EGF :Lot 0906390-1H2911 ；b-FGF Lot 1305CY12)小鼠抗大鼠nestin單克隆抗體、TRITC (羅丹明)標記的羊抗小鼠IgG抗體、Brdu及其抗體(武漢博士德生物技術有限公司產品);CCK-8試劑盒(碧云天生物技術研究所)；胡蘿卜苷，由南京中醫藥大學江蘇省方劑研究重點實驗室提供，純度彡98% ；
解剖液:D-hank’s, (pH7. 2-7. 4) NaC18. Og, Na2HPO4 12H200. 132g, KH2P 0 40 . 06g,KC10. 4g，NaHCO 30. 35g,用去離子水配成1000ml溶液；
0.125% 胰酶0. 125g 胰酶溶解于 100ml D-hank’s 中；
種植培養基由90%DMEM培養基和10%胎牛血清(杭州四季青生物工程公司產品)配
制；
無血清培養基由97%neuralbasal培養基、2% B 27培養基添加劑以及終濃度為20 u g/L的b-FGF和EGF配制而成解剖液、胰酶、培養液皆過濾除菌，4°C保存備用。主要儀器及器材
SW-CJ-2FD型超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術有限公司)C02細胞培養箱(SANYO，日本)；熒光倒置顯微鏡(OLYMPUS，日本)；低速自動平衡離心機(LDZ5-2型，北京醫用離心機廠)；酶標儀(BIO-RAD，USA) 6孔和96孔細胞培養板(Corning, USA) ； 200目尼龍篩網(罩在IOOml的小燒杯上，用膠布粘牢)，彎頭無齒鑷，直徑為12mm的彎頭滴管；50ml鹽水瓶；直徑為IOcm的表面皿，皆經15磅30min高溫高壓滅菌。實驗方法
1.4. I神經干細胞的分散、種植和培養
具體操作過程如下1.孕鼠用10%水合氯醛麻醉，全身用碘伏消毒，無菌條件下剖腹，取出胎鼠；2.用彎頭鑷撕開胎鼠頭皮和顱骨，暴露兩側大腦半球，用彎頭無齒鑷小心分開顳葉皮層，暴露并取出海馬回，置解剖液中；3.將海馬組織塊用解剖液清洗，轉入裝有約海馬組織體重20倍體積的胰酶的鹽水瓶中，用光滑的彎頭滴管反復吹打至組織塊完全消失，液體呈渾濁狀；4.將液體用等體積的種植培養基終止消化，過200目尼龍篩網；5. 1500g /r離心12min，傾去上清液，用種植培養基使細胞重懸，以IX IO6個/ ml的密度將細胞種植在6孔培養板中，每孔加2mL ；7.置37°C，5%飽和濕度CO2培養箱內培養。第2天將培養液全部換成無血清培養液，以后用無血清培養液每隔2 d換液I次。每天在倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況。待出現肉眼可見的大量成簇生長的細胞球時，用ImL槍頭吸取細胞球，移至新的6孔培養板中培養，如此過程重復三遍，以純化神經干細胞，此時可傳代。用3飛代的細胞進行實驗。神經干細胞的鑒定(陽性細胞標記物為nestin)
方法和步驟依次為①用于鑒定的神經干細胞用PBS輕洗2次，繼而滴加4%多聚甲醛固定30min，再用蒸餾水洗兩遍②滴加0. 25%Triton，浸泡15 min，PBS洗3次③滴加5%BSA封閉液，室溫浸泡20 min,甩去多余液體，不洗④滴加小鼠抗大鼠nestin單克隆抗體(I :400) 4°C過夜，PBS洗3次⑤滴加TRITC (羅丹明)標記的羊抗小鼠IgG抗體(I :50)，室溫浸泡20 min，PBS洗3次⑥在熒光顯微鏡下觀察并拍照。陽性細胞呈現橙紅色熒光。陽性細胞的純度> 90%。細胞增殖實驗
I.4. 3. I CCK-8 實驗
原理CCK-8法是用于測定細胞增殖或毒性試驗中活細胞數目的一種高靈敏度，無放射性的比色檢測法。實驗的靈敏度比其它四唑鹽如MTT，XTT, MTS或WST -I高。由于CCK-8溶液相當穩定，并且對細胞沒有毒性，可直接加入到細胞樣品中長時間孵育。原理是WST-8 (2- (2-甲氧基-4-硝苯基)-3- (4-硝苯基)-5- (2，4- 二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽)在電子稱合試劑I-Methoxy PMS存在的情況下能夠被還原成橙黃色水溶性的formazan,后者與活細胞數量成正比。方法神經干細胞以I X IO4個/ ml的密度種植在96孔培養板中，每孔加0. 2mL。細胞分成9組，分別為對照組、胡蘿卜苷IOOii M組、胡蘿卜苷80 ii M組、胡蘿卜苷40 ii M組、胡蘿卜苷20 ii M組、胡蘿卜苷IOii M組、胡蘿卜苷5 ii M組、胡蘿卜苷2.5 ii M組，胡蘿卜苷
I.25 PM組、每組設6個復孔。對照組正常培養，不作處理；其余各組給予胡蘿卜苷，其終濃度分別為 100 u mol/L、80 u mol/L、40 u mol/L、20 u mol/L、10 u mol/L、5 u mol/L、2. 5 u mol/L、1.25iimol/L。另設空白對照孔在無細胞的孔中加等量無血清培養基以及CCK-8。然后置37°C，5% CO2培養箱內培養60h，之后向各孔中加入20 的CCK-8溶液，37°C下孵育2h，用酶標儀在450nm波長處檢測每孔的光密度(0D值)。測試孔的實際OD值=各測試孔的OD值-空白對照孔OD值。細胞增殖率％ =(處理組平均OD值-對照組平均OD值)/對照組平均OD值X 100%。I二S統計方法應用SPSS16. 0進行統計分析，首先進行方差齊性檢驗，方差齊用單因素方差分析(One-Way AN0VA)中提供的Bonferroni檢驗；不齊則用在Equal VarianceNot Assumed選項中提供的Tamhane，s T2進行分析。所得數據均用表示。實驗結果見表I.
表I各組神經干細胞OD值及細胞增殖率 X±s(, n=6)
組別OD值細胞增殖率％
對照組0.47 ±.079——
權利要求
1.胡蘿卜苷在制備促進神經干細胞增殖藥物中的應用。
2.胡蘿卜苷在制備促進神經干細胞增殖保健品中的應用。
全文摘要
本發明涉及胡蘿卜苷在制藥及保健品中的新用途，具體地說是胡蘿卜苷在制備促進神經干細胞增殖藥物及保健品中的應用。胡蘿卜苷是植物甾醇衍生物，為谷甾醇-3-O-葡萄糖苷，廣泛存在于植物中，其提取、分離和含量檢測過程都很簡便。有研究稱本品可促進成骨樣細胞增殖，保護人微血管內皮細胞，還具降糖活性。本發明以原代培養的神經干細胞和老年小鼠為材料，觀察胡蘿卜苷對神經干細胞的作用。通過離體和整體實驗，證實胡蘿卜苷具有促進神經干細胞增殖的作用離體實驗中，胡蘿卜苷劑量10μmol/L~100μmol/L均能促進神經干細胞增殖；整體實驗中，10mg/kg的劑量能促進老年小鼠神經干細胞的增殖。
文檔編號A61P25/28GK102755343SQ20121027977
公開日2012年10月31日 申請日期2012年8月8日 優先權日2012年8月8日
發明者楊念云, 段金厫, 江勵華, 王明艷, 郭盛, 陸大祥 申請人:南京中醫藥大學, 暨南大學