專利名稱：一種鴨疫里默氏桿菌及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于獸用生物制品技術領域，具體是涉及一種鴨疫里默氏桿菌及其應用，即一株可引起鴨神經癥狀和纖維素性心包炎、肝周炎和氣囊炎的細菌及其應用。
背景技術：
鴨傳染性漿膜炎，又稱鴨疫里默氏桿菌病、鴨疫巴氏桿菌病、新鴨病等，是由鴨疫里默氏桿菌(Riemerella Anatipestifer,簡稱RA)引起的鴨、鵝、火雞及其他家禽和野禽的一種急性或慢性接觸性傳染病，主要侵害2 7周齡雛鴨，以神經癥狀和纖維素性心包炎、肝周炎和氣囊炎為特征。本病于1932年在美國紐約首次發現，我國鄺榮祿等于1975年首次報道本病在廣州的存在；郭玉璞等(1982)在北京地區商品鴨中首次分離出該病原菌；隨后，我國廣東、上海、福建、北京、四川、湖南、江蘇、海南、山東、重慶、湖北等地區均報道了發生該病的情況。迄今為止，國際上報道鴨疫里默氏桿菌共有21個血清型。由于缺乏相應的參考菌株，在早期研究中，我國關于RA血清型的報道不多。早年高福等(1987)對從北京、廣東和上海等地分離的205個菌株經凝集和瓊擴試驗鑒定證明均屬血清I型。但近年來發現其血清型已發生了巨大變化除了血清2型、6型、10型、11型、13型和14型，汪銘書等(2001)還報道了血清4型及血清8型鴨疫里默氏桿菌在我國的存在；李文楊等(2002)從福建省103個肉鴨場116份病料中共分離到細菌107株，其中鴨疫里默氏菌84株，占78. 5% ；大腸桿菌23株，占21. 5%。在分離鑒定的84株鴨疫里默氏桿菌中，血清2型占60. 7%，I型占25. 0%，其它占14. 3%。韋強等(2003)研究結果表明，優勢血清型在不同的年份出現不同的變化，2000年鴨疫里默氏桿菌以I型為主，占總分離菌數的51. 9% ；2001年以后2型占絕對優勢，占總分離菌數的89. 5% ；2002年RA2型依舊占53. 3%的絕對優勢。可見我國目前流行的鴨疫里默氏菌其血清型已發生了明顯變化，2型已成為主要流行的血清型。當前，鴨疫里默氏桿菌對養殖業的危害除直接引起動物發病、死亡外，感染過鴨疫里默氏桿菌的鴨因飼料轉化率降低、生長發育遲緩而帶來的間接經濟損失也十分嚴重，鴨疫里默氏桿菌雖然對部分抗菌藥物敏感，但難于清除，尤其是該菌侵入氣囊后，藥物難以到達，由于不合理的用藥方案，鴨疫里默氏桿菌耐藥現象普遍存在，耐藥率高且廣泛，同時造成一定的藥物殘留等問題。目前防止該病的重要手段是接種鴨疫里默氏桿菌疫苗，但國內針對該病的商品化疫苗非常少。因此，篩選出致病力強、免疫原性好的鴨疫里默氏桿對于制備疫苗具有重要的作用。

發明內容
本發明的目的是提供了一株鴨疫里默氏桿菌及其應用，以該菌為抗原制備的疫苗可有效防治以神經癥狀、纖維素性心包炎、肝周炎和氣囊炎為特征的鴨傳染性漿膜炎，為鴨傳染性漿膜炎的預防和治療提供了產品和使用方法。本發明的鴨疫里默氏桿菌(Riemeralla anatipestifer) RA BYT06株已于2012年11月15日保藏于北京市朝陽區北辰西路I號院中科院微生物研究所的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No. 6832。上述的鴨疫里默氏桿菌用于制備鴨疫里默氏桿菌滅活疫苗，所制得的疫苗可以預防以神經癥狀、纖維素性心包炎、肝周炎和氣囊炎為特征的鴨傳染性漿膜炎的發生。本發明篩選得到的鴨疫里默氏桿菌具有高致病性，用其制備的滅活疫苗，能夠預防以神經癥狀、纖維素性心包炎、肝周炎和氣囊炎為特征的鴨傳染性漿膜炎的發生，具有良好的市場推廣前景。
具體實施例方式本發明對山東、廣東、福建、廣西等地的疑似鴨疫里默氏桿菌病死鴨進行病原分離、鑒定，獲得38株病原為鴨疫里默氏桿菌，對其進行血清型鑒定表明，其中有7株為血清2型；動物回歸及毒力試驗表明RA BYT06株毒力最強，可致鴨只10/10發病且其中5只死亡；免疫原性試驗結果表明，當免疫劑量為O. 25mL (抗原含量達到1. OX 108CFU/mL)時即可使攻毒保護達到9/10。以上結果表明，篩選得到一株血清2型鴨疫里默氏桿菌，其致病力最 強、免疫原性好、制備的油苗攻毒保護效果好，確定為生產用菌株，于2012年11月15日保藏于北京市朝陽區北辰西路I號院中科院微生物研究所的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No. 6832。下面對本發明進行詳細的描述。一、鴨疫里默氏桿菌的分離及鑒定⑴將從山東、廣東、福建、廣西等地收集的病死鴨進行無菌操作，取病死鴨心、血、肝或腦組織劃線接種于胰蛋白胨大豆瓊脂(使用前加5%犢牛血清)平板、鮮血營養瓊脂培養基、普通營養瓊脂培養基、麥康凱瓊脂培養基平板上，置于含5%C02的37°C恒溫培養箱中培養24h。其中38株的結果如下在胰蛋白胨大豆瓊脂平板上，置含5%C02恒溫培養箱培養，菌落呈圓形奶白色，突起，光滑，邊緣整齊，斜光觀察時菌落發綠光，有的培養基亦被襯成綠色，不同菌株綠光深淺程度不同，在鮮血瓊脂上呈圓形，不溶血，有閃光，呈奶油狀菌落，麥康凱瓊脂和普通營養瓊脂上均不生長，38株分離菌分別命名為RA BYTOU RA BYT02至RABYT38。⑵取純培養的細菌的單個菌落涂于干凈的載玻片上，然后分別用瑞氏染色法染色和革蘭氏染色，鏡檢，觀察其形態特征。革蘭氏染色，為革蘭氏陰性細小桿菌，呈單個或成對分布，偶爾呈鏈狀排列，不運動，無芽胞；瑞氏染色大部分菌體兩極濃染。⑶取純培養物分別進行吲哚(靛基質)試驗，甲基紅(M.R.)試驗，V-P試驗，過氧化氫酶試驗，接觸酶試驗，尿素酶試驗，葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、阿拉伯糖、甘露醇、衛矛醇、鼠李糖、果糖發酵試驗。37°C培養，連續觀察7天。結果表明其中9株菌部分發酵葡萄糖、蔗糖、麥芽糖外，其余菌株均不發酵糖類，不產生硫化氫，過氧化氫酶試驗、接觸酶試驗、尿素酶試驗均為陽性，V-P試驗、甲基紅(M. R.)試驗、吲哚(靛基質)試驗均為陰性，符合鴨疫里默氏桿菌的生化反應特征。⑷取初步分離保存的各株鴨疫里默氏桿菌純培養物，分別用鴨疫里默氏桿菌定型血清作平板凝集試驗，以確定其血清型。結果顯示,38株細菌分離株中7株為血清型2型，4株為血清型I型’3株為血清型3型，3株為血清型4型，I株為血清型5型，2株為血清型6型，3株為血清型7型，3株為血清型9型，3株為血清型10型，I株為血清型11型，其中2型為優勢血清型。(5) 7株血清2型鴨疫里默氏桿菌毒力測定試驗分別將分離菌純培養的單個菌落劃線接種于胰蛋白胨大豆瓊脂(使用前加5%犢牛血清)平板上，37°C培養24h，刮取平板上所有菌落混于滅菌生理鹽水中制成細菌懸液，以
0.5mL/只劑量肌肉注射19日齡健康易感鴨10只，同時設立滅菌生理鹽水注射對照組10只。攻毒后連續觀察10天，每日記錄鴨子的精神、食欲、飲水、運動及死亡情況，并對死亡鴨進行病理剖檢、細菌分離及鑒定。結果表明，RA BYT06株所攻毒鴨在攻毒40h后，鴨開始出現精神萎靡，行動遲緩或俯臥不起，眼、鼻流分泌物，共濟失調等癥狀，其余株部分在90h后出現癥狀，部分未臨床出現癥狀；RA BYT06株攻毒后全部發病，10天內多數發病鴨死亡，死亡達到5/10，剖檢可見典型的心包炎、肝周炎、氣囊炎，RA BYT17.RA BYT2URA BYT24株發病3/10 7/10，死亡0/10 2/10，因此可確定RA BYT06株毒力最強，詳見表I。取心血涂片和肝組織印片進行瑞氏染色后顯微鏡下觀察檢查，RA BYT06株可見兩極濃染的小桿菌，單個或成對存在，并能從心血和肝組織在胰蛋白胨大豆瓊脂培養基上分離出接種菌，其生化及 培養特征與RA BYT06株株鑒定結果一致，因此本研究選用RA BYT06株作為疫苗用強毒菌株。并送中科院微生物研究所的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號為 CGMCC No. 6832。表1:7株血清型2型鴨疫里默氏桿菌的毒力測定試驗結果
前株編號_攻毐·攻毐H齡汗始發病時間發病數泣(11/〗0)及死亡數歟
RA BYT06 0.5mL/只肌注 19 H齡 4龜發病10只，其屮死亡5只RA BYT17 O.SmL/只肌注 19 H齡 120h 發_ 3只，其中死亡O只RA BYT21 0.5mL/只肌注請日齡 90h 發 7只，其中死亡2只RABYT24 0.5mL./只肌注 19 □齡 96h 發病6只，其中死C 2只RABYT28 0.5mL/只肌注 19 口齡 - 發病O只，其中死亡O只RA BYT31 0.5mL/只肌注 19 H齡 - 發病O只，其屮死亡O只RA BYT37 0.5mL/只肌注 19 Π齡 - 發病O只，+K-中死Γ: O只對照饑_t理鹽水_19 D齡_-_U 其中死Γ: O K注〃_〃表不未發病(6)鴨疫里默氏桿菌強毒分離株RA BYT06株的免疫原性測定將確定的強毒分離株RA BYT06接種胰蛋白胨大豆肉湯(使用前加5%犢牛血清)培養基培養后，以平板培養計數法進行活菌計數，收集菌體，將其濃度稀釋到3. OX 106、3. OX IO7,3. OX IO8,3. OX IO9,3. OX 1010CFU/mL五組，分別按照油水比為2:1的比例做成油佐劑滅活疫苗，使配苗后每毫升抗原液菌數分別為1. 0X106、1. OXlO'l. 0X108、
1.OX 109、1. OX IOltlCFU,取5日齡健康易感雛鴨60只，10只/組，分別用含有不同濃度抗原的滅活疫苗進行頸部皮下注射，O. 25mL/只，10只作為非免疫對照，接種后14日，每只鴨各肌肉注射O. 5mL(1.0X106CFU/mL)RA BYT06株菌液，觀測10日，測定疫苗的免疫保護效果。結果如表3所示，當抗原含量達到1. O X 107CFU/mL以上，免疫劑量為O. 25mL時，保護8/10，當抗原含量達到1. O X 108CFU/mL以上，免疫劑量為O. 25mL時，保護達到9/10，對照組10/10發病且其中5只死亡，結果表明當抗原含量達到1. O X 108CFU/mL時，攻毒保護達到9/10，免疫原性好；具體結果見表2。表2 RA BYT06分離株的免疫原性試驗結果
權利要求
1.一種鴨疫里默氏桿菌，其保藏編號為CGMCC No. 6832。
2.權利要求1所述的鴨疫里默氏桿菌在制備疫苗中的應用。
3.一種滅活疫苗，所述的滅活疫苗是以權利要求1所述的鴨疫里默氏桿菌作為抗原制備的。
4.權利要求3所述的滅活疫苗的制備方法，包括如下步驟取注射用白油94份、6份司本-80混合后，加入2%硬脂酸鋁，加熱熔化至透明，混合均勻，制成油相，取鴨疫里默氏桿菌的菌液96份，加入高壓滅菌的4份吐溫-80，充分溶解混勻；從油相罐內將2份油相打到乳化罐內，開動電機預乳化，同時徐徐加入制備好的鴨疫里默氏桿菌液I份，加完后再以3500r/min乳化40分鐘；在乳化終止前加入1%硫柳汞溶液，使其終濃度為0. 01% ;定量分裝，加蓋密封。
全文摘要
本發明涉及一種鴨疫里默氏桿菌，保藏號為CGMCC No.6832。上述的鴨疫里默氏桿菌用于制備鴨疫里默氏桿菌滅活疫苗，所制得的疫苗可以預防以神經癥狀、纖維素性心包炎、肝周炎和氣囊炎為特征的鴨傳染性漿膜炎的發生。滅活疫苗中鴨疫里默氏桿菌6832的數量不低于1×108CFU/mL。本發明篩選得到的鴨疫里默氏桿菌具有高致病性，用其制備的滅活疫苗，能夠預防以神經癥狀、纖維素性心包炎、肝周炎和氣囊炎為特征的鴨傳染性漿膜炎的發生，具有良好的市場推廣前景。
文檔編號A61K39/02GK103007261SQ20121057397
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月26日 優先權日2012年12月26日
發明者蔣皓靜, 凌紅麗, 叢雁方, 蔣貽海, 孫海新 申請人:青島康地恩藥業股份有限公司, 青島寶依特生物制藥有限公司