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阿魏酸在制備減輕流產后子宮出血藥物中的應用的制作方法
專利名稱:阿魏酸在制備減輕流產后子宮出血藥物中的應用的制作方法
技術領域:
本發明涉及一種阿魏酸的新用途,具體涉及一種阿魏酸在制備減輕流產后子宮出血藥物中的新用途。
背景技術:
藥流后異常子宮出血嚴重損害患者身心健康,一定程度上影響了藥流的接受性,影響了計劃生育國策的順利實施。現有的藥流后異常子宮出血治療方法主要包括清宮術和米非司酮劑量優化,但清宮術具有宮腔操作導致感染、穿孔、疼痛等多種并發癥的風險,而現有的米非司酮劑量優化方案存在療效不穩定等缺點。因此,尋找有療效確切且副作用小的減輕藥流后子宮出血方法和藥物將具有重要的臨床價值及社會意義。隨著生殖免疫學不斷發展,免疫因素在妊娠及妊娠相關疾病中的作用日益受到關注。從免疫學角度,正常妊娠類似于成功的半同種異體移植;母體對攜帶父方組織相容性抗原的胚胎不僅不排斥,而且通過精細的母-胎對話建立獨特的母-胎免疫耐受微環境,允許胎兒在子宮內生長發育直至分娩。免疫細胞在母-胎免疫耐受的誘導與維持中扮演了重要角色,T淋巴細胞在其中發揮著重要作用。初始T細胞遇抗原刺激后在特異性核轉錄因子作用下,分化Thl/Th2/Thl7/Treg亞群,產生不同的細胞因子,在抗感染、維持機體內環境穩定及誘導母-胎免疫耐受中發揮著不同作用。Thl亞群產生IFN Y等細胞因子介導細胞免疫,在機體抗感染中發揮著重要作用,但其過度表達能夠誘導母胎免疫排斥,導致流產;Th2亞群產生IL-4等細胞因子,能降低巨噬細胞、自然殺傷細胞活性和淋巴毒素作用,使胚胎逃逸母體免疫排斥,有利于妊娠。正常妊娠存在Th2型免疫偏移,而Thl類細胞因子的優勢表達可導致流產的發生。Thl7細胞能分泌大量的IL-17A、IL-17F等細胞因子,在清除胞外病原體、抗真菌中發揮重要作用,同時在組織炎癥和自身免疫性疾病發生的過程中起著重要作用,研究發現復發性流產模型動物及患者Thl7亞群比例較正常妊娠升高。Treg通過產生TGF- ^等細胞因子參與維持外周T細胞內環境穩定及在移植耐受的形成,在母-胎免疫耐受中亦發揮關鍵作用,其功能障礙參與了流產的發生。Thl7細胞與Treg細胞起源于共同的前體細胞,在不同的免疫微環境中向著不同方向分化。正常妊娠時Thl7/Treg向Treg偏移,復發性流產患者則存在Thl7偏移現象。Thl/Th2/Thl7/Treg亞群共同形成復雜精細的免疫調控網絡,維持母-胎免疫耐受微環境的穩定,其亞群失衡則打破維持母-胎免疫耐受狀態而導致流產發生。研究證實,米非司酮藥流婦女血清及蛻膜組織中Thl類細胞因子表達升高、Th2類細胞因子表達降低;動物實驗發現米非司酮誘導妊娠小鼠Thl7特征性細胞因子IL-17表達,抑制Treg特征性細胞因子IL_10、TGF_ ^表達,提示T細胞亞群偏移在米非司酮藥流中扮演了重要角色。阿魏酸的化學名稱為4-羥-3-甲氧基肉桂酸或3-(4-羥基-3-甲氧苯基)_2_丙烯酸,是植物界普遍存在的一種酚酸,在植物中主要與細胞壁多糖和木質素交聯構成細胞壁的一部分,是當歸、川芎、阿魏等中藥的有效成分之一。阿魏酸具有許多功能,如抗氧化、抗血栓、降血脂、防治冠心病、抗菌消炎、抗突變、防癌等,廣泛應用于食品、藥品、化妝品等領域,但目前還未見阿魏酸有減輕流產后子宮出血的作用。
發明內容
為了解決上述技術問題,本發明公開了一種阿魏酸在制備減輕流產后子宮出血藥物中的新用途。阿魏酸通過誘導藥物流產小鼠母胎界面T細胞亞群(Thl/Th2/Thl7/Treg)向Thl、Thl7亞群偏移,促進母胎免疫排斥,進而減少流產小鼠子宮出血量。為了進一步的說明本發明的實質,下面用阿魏酸的藥理實驗來說明阿魏酸在制備減輕流產后子宮出血藥物中的新用途。藥理實驗 藥物
米非司酮由浙江仙琚制藥股份有限公司生產(國藥準字H20000648,批號091102)。本發明有效單體成分阿魏酸(CltlHltlNO4),購自中國藥品生物制品檢定所。小鼠分組與處理
清潔級Balb/C小鼠,由山東大學實驗動物中心提供,鼠齡10周,體重(22±2) g,雌性小鼠未交配過,雄性小鼠證明有生育能力。置于室溫24 °C,相對濕度60% 65%的超凈動物飼養柜內,給予12 h光照,12 h暗室,自由飲水攝食。雌雄小鼠按2:1比例于每日下午5 :00合籠,次日清晨觀察小鼠陰栓,發現陰栓日為妊娠第I天。將孕鼠隨機分為米非司酮對照組、米非司酮+阿魏酸組(大、中、小劑量),各10只。米非司酮對照組自小鼠妊娠第6天起,灌胃米非司酮(I. 5 mg O雙蒸水,連續灌胃3天;米非司酮+阿魏酸組大、中、小劑量組分別灌胃米非司酮(I. 5 mg - kg-1 .d-1)+大、中、小劑量阿魏酸(20mg/kg、10mg/kg、5mg/kg)連續灌胃3天。 標本收集與檢測
(I)自藥物處理第I天起,小鼠陰道內置入20 g定量棉球,每日更換,置于密閉EP管內,4°C保存,改良堿性正鐵血紅素法檢測小鼠子宮出血量。(2)流式細胞術包內外雙染色法檢測母胎界面Thl/Th2/Thl7/Treg亞群比例分離子宮組織,剪至ImmX Imm大小,200目銅網研磨過濾,I XPBS沖洗,Ficoll密度梯度離心法分離子宮組織單個核細胞,調整子宮組織單個核細胞濃度為I X IO6個/mL,加入佛波酯30 ng/mL、離子霉素I y g/mL、莫能霉素I. 7 ng/mL, 37 °C, 5% CO2孵育4 h。收集細胞,I XPBS洗2遍,去上清,加入大鼠血清,室溫避光孵育30 min。將外標抗體(FITC-⑶4、PC5-⑶25)按說明書分別加入到細胞懸液中,4 1避光孵育30 min;lXPBS洗2次,去上清;BD固定穿膜試劑盒固定穿膜(按說明書操作),加入內標抗體(PE-IFN-y,PE-IL-4,PE-IL17A,PE-Foxp3),4 1避光孵育30 min ;穿膜緩沖液洗2次,去上清,I XPBS重懸細胞,轉管,上機檢測。Winmidi 2. 9 分析 Thl 亞群(CD4+ IFN-Y+)、Th2 亞群(CD4+IL_4+)、Thl7 亞群(CD4+IL-17A+)及 Treg (CD4+CD25+Foxp3+)比例,計算 Thl/Th2 比值及 Thl7/Treg 比值。(3) Western blot法檢測子宮組織T細胞亞群分化特異性核轉錄因子蛋白表達分離子宮組織,剪至ImmX Imm大小,200目銅網研磨過濾,I XPBS沖洗,Ficoll密度梯度離心法分離子宮組織單個核細胞,調整子宮組織單個核細胞濃度為IX IO6個/mL,加入蛋白裂解液100微升,冰浴混勻,冰浴靜置30分鐘,4°C 12000rpm / min,離心30min,取上清,10%SDS-PAGE電泳并轉膜,封閉、加入兔抗小鼠T-bet、GATA3、R0R Y t、Foxp3抗體(按說明書操作),4°C孵育過夜;洗滌后加入山羊抗兔辣根過氧化酶標記二抗,37°C孵育I. 5h ;充分洗滌后與增強化學發光試劑反應,增強化學發光法曝光顯色(LAS-4000mini化學發光圖像分析儀),以GAPDH為內參照,計算目的蛋白與同步GAPDH灰度值比值作為相對表達量。統計學分析
采用方差分析,計量資料以;± s表示,采用One Way-ANOVA方差分析,組間比較采用Student-Newman-Keuls法檢驗〈O. 05為差異有統計學意義。結果
(I)阿魏酸有效減少藥流小鼠子宮出血量 表I各組藥流后小鼠子宮出血量對照表
權利要求
1.阿魏酸在制備減輕流產后子宮出血藥物中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種阿魏酸的新用途,具體涉及一種阿魏酸在制備減輕流產后子宮出血藥物中的新用途,阿魏酸能優勢誘導米非司酮藥流小鼠母胎界面Th1、Th17亞群特異性核轉錄因子蛋白表達啊,降低Th2、Treg亞群特異性核轉錄因子蛋白表達,進而誘導T細胞向Th1、Th17亞群偏移,促進母胎免疫排斥,從而減輕藥流小鼠子宮出血量。
文檔編號A61P15/00GK102961370SQ201210497129
公開日2013年3月13日 申請日期2012年11月29日 優先權日2012年11月29日
發明者李霞, 王彬, 姚成芳, 王麗, 周憲賓, 郭鈺琪, 趙向忠, 張巧鳳, 姜國勝 申請人:山東省醫學科學院基礎醫學研究所
產品知識
行業新聞
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