專利名稱：一種篩選抗細菌粘附抑制劑的方法和抗粘附口服液的制備的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種篩選抗細菌粘附抑制劑的新方法和一種抗細菌粘附口服液的制備。
背景技術：
抗生素為治療和預防細菌感染做出了重大貢獻，但是由于抗生素的廣泛使用(包括濫用)，細菌耐藥性問題已經成為嚴重威脅人類健康的重大問題。現有抗菌藥物的特征是破壞細菌的生命功能，如干擾細菌細胞壁的合成、破壞細菌DNA的復制或蛋白質的合成等， 正是這些作用機制的選擇壓力，促進了耐藥菌株的出現。為解決細菌的耐藥性問題，一種新的抗菌藥物研發思路逐漸形成，即研究以抑制細菌毒力因子或阻斷細菌與宿主細胞的聯系為作用機制的新型抗菌藥物。
細菌都能表達粘附素(adhesin)，環境中的大部分細菌都能粘附到一定界面而形成固定群落。粘附素有兩類，即菌毛(pili，fimbriae)和非菌毛粘附物質(afimbrial adhesin)。病原菌粘附到宿主細胞表面是細菌感染的關鍵步驟，比如呼吸道、泌尿道、消化道的細菌感染都涉及粘附問題。此外，在細菌形成生物膜(biof iIm)的初期，細菌粘附起重要作用。細菌生物膜能保護細菌逃避機體的免疫應答、屏蔽抗菌藥物、削弱機體內部流體剪切力對細菌的作用，并引起二次感染。因此，細菌粘附抑制劑的研究近年來受到廣泛關注。、
目前篩選細菌粘附抑制劑的方法主要采用結晶紫染色比色法，具體方法如下將細菌接種在含液體培養基的96孔板中，試驗樣本加入液體培養基中，不加樣本的做陰性對照，培養一定時間后，漂洗培養板，去除懸浮細菌，自然干燥，往板孔內加入結晶紫溶液，再洗去結晶紫溶液，然后加入一定量甲醇溶液，在540nm測定吸光值，吸光值越大表明粘附在孔表面的細菌越多，抗細菌粘附抑制劑能防止細菌粘附，因此，被篩選樣本如果有抑制細菌粘附的作用，則吸光值小。這種方法的優點是能一次完成多個樣本的篩選，缺點是可能出現假陰性結果，因為一些樣本自身可被孔表面吸附，并能被結晶紫著色，顯示的吸光值并不是因細菌粘附形成的。發現更客觀的方法對篩選抗細菌粘附抑制劑具有重大意義。
盡管對細菌的粘附現象及其危害已經取的較大進展，但是迄今為止，沒有一種抗細菌粘附抑制劑進入臨床，目前，對細菌引起的消化道、呼吸道、泌尿道感染的治療依然依賴大劑量給予抗生素的策略，加劇了耐藥菌的出現和二次感染的發生。所以發現具有抗細菌粘附的制劑具有重要的社會價值和經濟利益。發明內容
本發明要解決的技術問題是制備抗細菌粘附的口服液。
本發明的另外一個目的是克服傳統方法在篩選抗細菌粘附抑制劑時可能導致假陰性的缺點，本發明提供了一種能直觀判斷被篩選樣本是否具有抗細菌粘附的方法。
本發明的技術方案一種抗細菌粘附口服液，配方包含冷水花40克、金銀花60克和茯苓100克，并制成口服液。
—種抗細菌粘附口服液的制備方法，冷水花、金銀花混合，水煎煮3次，合并煮液， 濃縮后干燥，得到混合水提取A ;茯苓用水煎煮，煮液冷卻后過濾，濾液用乙酸乙酯萃取，萃取物回收乙酸乙酯后干燥，得到淺黃色干粉B ;取10克的混合水提取A和2克干粉B，加入 IOOml自來水中，加熱溶解后滅菌，冷卻后加入Iml的紅茶菌菌液，置30°C培養箱靜置培養 7-9天，待pH值降到4時，停止發酵，過濾得到發酵液，發酵液冷凍處理48小時，解凍后高速離心除菌，上清液無菌罐裝，置4°C冰箱保存。
一種篩選抗細菌粘附抑制劑的方法，將滅菌的普通肉湯加入無菌培養皿中，放入一張五邊形的無菌載玻片，載玻片的一端浸入肉湯中，另一端架在培養皿邊緣上，先加入滅菌上述上清液，再加入細菌懸液，陰性對照不加樣本溶液；將培養皿置37°C培養箱培養24 小時，然后，取出載玻片，在無菌水中漂洗，將接觸肉湯一面火焰固定，結晶紫染色，置顯微鏡下觀察，導出圖像。
本發明達到的有益效果本發明制備的抗細菌粘附口服液能抑制大腸桿菌的粘附，最小有效濃度為1% (VA)0 小鼠實驗表明，本發明的抗細菌粘附口服液能終止腸炎沙門氏菌、大腸桿菌的人工感染，能有效治療兔尿道大腸桿菌的人工感染。志愿者試驗表明，本發明的抗細菌粘附口服液具有抗腸道感染、尿道感染的作用，還具有治療感冒的藥效。
水提取A和干粉B在水中加熱溶解后，口感不佳，用紅茶菌發酵后，口味以酸為主， 口感得到提高。
本發明能直觀顯示細菌粘附的圖像，直觀判斷被篩選樣本是否抗細菌粘附。
本發明的抗細菌粘附口服液志愿者口服治療效果 案例一，彭某，男，49歲，貴州大學教師，長期胃腸道不適，腹灣，口服本發明的抗細菌粘附口服液10毫升，僅服用3次，腹瀉停止，消化功能正常，體況變好。
案例二，田某，男，34歲，貴州大學教師，感冒不適，咽喉腫痛，口服本發明的抗細菌粘附口服液20毫升，僅服用I次即痊愈。
案例三，楊某，男，17歲，中學生，因吃烤肉，上吐下瀉，口服本發明的抗細菌粘附口服液10毫升，僅服用I次即痊愈。
案例四，楊某，男，49歲，貴州大學教師，尿道感染，排尿有燒妁感，尿頻，口服本發明的抗細菌粘附口服液20毫升，僅服用I次即痊愈。
案例五，楊某，53歲，公務員，長期飲酒，胃腸不適多年，口服本發明的抗細菌粘附口服液10毫升，服用73次，消化功能正常，體況變好。
具體實施方式
實施例I:本發明的抗細菌粘附口服液的制備一、材料與方法(I)材料冷水花根莖采自貴陽市雷打巖峽谷、金銀花采自貴陽市情人谷、茯苓購自貴州省黎平縣九潮鄉。冷水花根莖切碎后陰干，金銀花陰干，茯苓去皮后切成丁或片，陰干備用。紅茶菌購自湖南岳陽市紅茶菌培育研究中心。
(2)方法冷水花干燥頸根400克、金銀花600克，加水6升分三次煎煮，得到濾液 4升，濃縮得到浸膏，浸膏置水浴蒸干，得到水提物A80克。茯苓1000克用水4升分三次煎煮，得到濾液2升，靜置過夜，虹吸得到上清液I. 8升，用乙酸乙酯萃取，萃取液回收后干燥得到淺黃色干粉B20克。取10克的水提取A和2克干粉B，加入IOOml自來水中，加熱溶解后滅菌，冷卻后加入Iml的紅茶菌菌液，置30°C培養箱靜置培養7天左右，待pH值降到4 時，停止發酵，過濾得到發酵液80ml。發酵液置三角燒瓶_20°C冰箱放置48小時后，室溫解凍，解凍液離心(4000轉/分)10分鐘，收集上清液(60ml )，置三角燒瓶用硅膠塞加蓋，0-4°C 冰箱保存，即為本發明的抗細菌粘附口服液。定期(7、15、30、60日)檢測pH值、細菌總數、 霉菌總數、大腸桿菌數。
二、結果本發明的抗細菌粘附口服液為棕紅色液體，口味酸、微苦。pH值、細菌總數、霉菌總數、 大腸桿菌數檢測見表I。
權利要求
1.一種抗細菌粘附口服液，其特征在于配方包含冷水花40克、金銀花60克和茯苓100克，并制成口服液。
2.如權利要求I所述的一種抗細菌粘附口服液的制備方法，其特征在于冷水花、金銀花混合，水煎煮3次，合并煮液，濃縮后干燥，得到混合水提取A ;茯苓用水煎煮，煮液冷卻后過濾，濾液用乙酸乙酯萃取，萃取物回收乙酸乙酯后干燥，得到淺黃色干粉B ;取10克的混合水提取A和2克干粉B，加入IOOml自來水中，加熱溶解后滅菌，冷卻后加入Iml的紅茶菌菌液，置30°C培養箱靜置培養7-9天，待pH值降到4時，停止發酵，過濾得到發酵液，發酵液冷凍處理48小時，解凍后高速離心除菌，上清液無菌罐裝，置4°C冰箱保存。
3.一種篩選抗細菌粘附抑制劑的方法，其特征在于將滅菌的普通肉湯加入無菌培養皿中，放入一張五邊形的無菌載玻片，載玻片的一端浸入肉湯中，另一端架在培養皿邊緣上，先加入滅菌上述上清液，再加入細菌懸液，陰性對照不加樣本溶液；將培養皿置37°C培養箱培養24小時，然后，取出載玻片，在無菌水中漂洗，將接觸肉湯一面火焰固定，結晶紫染色，置顯微鏡下觀察，導出圖像。
全文摘要
本發明公開了一種篩選抗細菌粘附抑制劑的新方法和一種本發明的抗細菌粘附口服液的制備，本發明所述的新方法為使用特殊形狀的載玻片浸入液體培養基中供細菌粘附，培養基中加入被篩選樣本，通過顯微圖像分析判斷抗細菌粘附藥效；本發明涉及的抗細菌粘附口服液的原料為冷水花、金銀花和茯苓，經過提取、配液、發酵、冷凍、離心工藝制備，具有抗細菌粘附、抗腸道、尿道感染和抗感冒的藥效。
文檔編號A61P31/04GK102973633SQ201210581948
公開日2013年3月20日 申請日期2012年12月28日 優先權日2012年12月28日
發明者楊再昌, 杜潤孜, 陸倫維, 楊小生 申請人:貴州大學