專利名稱：一株腫瘤靶向細(xì)菌及其菌劑制備方法與代謝產(chǎn)物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株腫瘤靶向細(xì)菌及其菌劑制備方法與代謝產(chǎn)物，尤其是涉及一株腫瘤靶向細(xì)菌昆蟲病原線蟲共生致病桿菌及其菌劑制備方法與代謝產(chǎn)物。
背景技術(shù)：
癌癥已成為當(dāng)今世界人類的主要?dú)⑹帧鹘y(tǒng)治療癌癥的方法如放射療法、化學(xué)療法以及外科手術(shù)切除法，對(duì)一半的癌癥患者沒有效果。隨著醫(yī)療技術(shù)的進(jìn)步，光能療法、人類α -乳清蛋白療法(HAMLET)、高溫療法、射頻療法、飲食療法、胰島素增強(qiáng)療法、基因治療、端粒酶治療、二氯乙酸(DCA)治療和細(xì)菌治療等方法被用于癌癥的治療，但這些新的方法都有各自的弊端，無法大規(guī)模用于臨床治療。靶向抗腫瘤是指在特定的導(dǎo)向機(jī)制作用下，將具有抗腫瘤活性的物質(zhì)輸送到腫瘤部位，但在機(jī)體其他組織或器官中不存在或存在很少，從而起到特異性殺傷腫瘤的效果，其具有用藥量少、專一性強(qiáng)、毒副作用低、作用時(shí)間長(zhǎng)等特點(diǎn)。近年來，細(xì)菌靶向治療腫瘤成為一大研究熱點(diǎn)。腫瘤內(nèi)部存在低氧區(qū) ，是傳統(tǒng)的腫瘤治療如放療、化療等方法效果不佳的主要原因，但部分厭氧或兼性厭氧細(xì)菌能在此微環(huán)境中繁殖生長(zhǎng)，通過競(jìng)爭(zhēng)有限的營(yíng)養(yǎng)、分泌細(xì)胞毒素來消除腫瘤，而不會(huì)擴(kuò)散到機(jī)體其他部位。另外，細(xì)菌具有能動(dòng)性、抗生素敏感性及載運(yùn)和表達(dá)多種抗腫瘤藥物的能力，突顯了其在臨床應(yīng)用中的潛力。細(xì)菌靶向治療腫瘤在經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間且廣泛的研究后，先后挖掘出梭狀芽孢桿菌sp.)、鼠傷寒沙門氏菌(51 CAoJeraei1Swi1S )、雙歧桿菌 iB.大腸桿菌 iE.coli )、霍亂弧菌(Kcholerae )、單核細(xì)胞增多性李斯特細(xì)菌iL.monocytogenes )等細(xì)菌用于祀向腫瘤治療，但這些細(xì)菌作用方式單一且存有各種不足，如具有較強(qiáng)毒力的菌株在殺死腫瘤細(xì)胞的同時(shí)也對(duì)機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的毒性，而毒性較弱的菌株雖然有很高的腫瘤靶向性且對(duì)機(jī)體毒力較弱，但對(duì)腫瘤抑制效果較弱；對(duì)于壞死區(qū)域較小的早期腫瘤及外圍含氧量較高的腫瘤，不適合厭氧菌的生長(zhǎng)，兼性厭氧菌雖能彌補(bǔ)這一缺點(diǎn)，但腫瘤靶向性不強(qiáng)。昆蟲病原線蟲共生菌是 一類與線蟲互惠共生的革蘭氏陰性細(xì)菌，屬腸桿菌科，存在于線蟲腸道內(nèi)，分為致病桿菌屬(ifeflorAaAofesp.)和發(fā)光桿菌屬(/jAoioraAAofesp.),分別與斯氏線蟲(Sieifleraeaa)和異小桿線蟲(ZfeterorAaMZii1S)共生，已有的研究表明該類細(xì)菌具有廣譜高效殺蟲、抑菌及體外抗腫瘤等生物活性，但有關(guān)該類細(xì)菌的體內(nèi)抗腫瘤效果和腫瘤靶向性研究國(guó)內(nèi)外尚無報(bào)道。雖然有關(guān)細(xì)菌靶向治療腫瘤的研究起始較早，但在已經(jīng)研究過的細(xì)菌中，具有較好抗腫瘤效果和較強(qiáng)腫瘤靶向性且對(duì)機(jī)體毒性較小的野生型菌株存在極少。厭氧細(xì)菌雖能特異積聚于腫瘤的無氧區(qū)，但在較大腫瘤的外圍區(qū)域或早期腫瘤內(nèi)，受到氧氣影響而無法生存，對(duì)腫瘤的消除不徹底；兼性厭氧細(xì)菌雖能存在于腫瘤的有氧區(qū)域，但腫瘤靶向性不強(qiáng)，同時(shí)也能分布于機(jī)體的其他組織或器官中。高毒力菌株雖能對(duì)腫瘤具有較強(qiáng)的殺傷作用，但其同時(shí)也對(duì)機(jī)體有較大的毒副作用；低毒力菌株雖對(duì)機(jī)體毒副作用較低，但其抗腫瘤效果不強(qiáng)。
昆蟲病原線蟲共生菌是一類與線蟲互惠共生的革蘭氏陰性細(xì)菌，存在于線蟲腸道內(nèi)，屬腸桿菌科(Enterobacteriaceae),人們對(duì)該類細(xì)菌的研究起步相對(duì)較晚,主要集中于殺蟲和抑菌兩個(gè)方面，而在抗腫瘤方面的研究極少，只是初步嘗試了個(gè)別菌株的體外抗腫瘤細(xì)胞活性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是，克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一株腫瘤靶向細(xì)菌及其菌劑制備方法與代謝產(chǎn)物，該菌株具有極強(qiáng)的腫瘤靶向性，并且其菌劑與代謝產(chǎn)物具有較好的體內(nèi)抗腫瘤效果。本發(fā)明解決所述技術(shù)問題采用的技術(shù)方案是:
一株腫瘤祀向細(xì)菌，是昆蟲病原線蟲共生致病桿菌HN_xs01 {Xenorhabdus stockiaeHN_xs01);該菌種于2012年03月09日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(簡(jiǎn)稱CCTCC，地址:中國(guó).武漢.武漢大學(xué))，保藏編號(hào)為CCTCC NO:M 2012069。本發(fā)明之腫瘤革巴向細(xì)菌一昆蟲病原線蟲共生致病桿菌HN_xs01 iXenorhabdusstockiae HN_xs01)的分離鑒定:采用土壤線蟲分離法，結(jié)合NBTA鑒別培養(yǎng)基(NBTA培養(yǎng)基)，從云南德宏傣族景頗族自治洲盈江縣太平鄉(xiāng)采集的土樣中直接分離得到一株具有昆蟲病原線蟲共生菌性狀的藍(lán)色細(xì)菌，經(jīng)菌落形態(tài)觀察、革蘭氏染色、鏡檢和16S rRNA基因同源性分析等方法鑒定該菌株為屬，stockiae種,命名為昆蟲病原線蟲致病桿菌 HN_xs01(J6WorAaA￡//75.stockiae HN_xs01),其 16S rRNA 基因在 Genbank 中的登錄號(hào)為HQ840745.1。本發(fā)明之腫瘤靶向細(xì)菌一昆蟲病原線蟲共生致病桿菌HN_xs01菌劑制備方法: 利用昆蟲病原線蟲共生致病桿菌HN_xs01易于培養(yǎng)，發(fā)酵周期短的特性，制備該菌`體制劑。主要工藝流程包括菌種活化、一級(jí)發(fā)酵培養(yǎng)、二級(jí)種子罐發(fā)酵培養(yǎng)和生產(chǎn)用發(fā)酵罐培養(yǎng)，發(fā)酵完成后，收集菌液，離心收集菌體，生理鹽水洗滌，快速冷凍，真空干燥并包裝，-20°C保藏，使用時(shí)，根據(jù)個(gè)體差異用生理鹽水溶解通過瘤內(nèi)或靜脈給藥。活菌菌劑制備的具體過程如下:
(1)菌種活化，將保藏于-80°C冰箱中的昆蟲病原線蟲共生致病桿菌HN_xs01劃線接種于NBTA培養(yǎng)基上，30°C條件倒置培養(yǎng)36 48 h ;然后挑取單菌落劃線，以作進(jìn)一步的純化；
(2)一級(jí)發(fā)酵培養(yǎng)和二級(jí)種子罐發(fā)酵培養(yǎng):挑取經(jīng)再次純化后的stockiae HN_xs01接種LB液體培養(yǎng)基中，30°C下18(T200 rpm振蕩培養(yǎng)12h至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期，然后將10 mL培養(yǎng)液接種于1000 mL LB液體培養(yǎng)基中，30°C下180 200 rpm振蕩培養(yǎng)12 24h，得一級(jí)種子罐發(fā)酵菌液；將二級(jí)種子罐在121°C下滅菌30min，裝入發(fā)酵罐培養(yǎng)基后再滅菌，冷卻至25 3(TC，將一級(jí)種子罐發(fā)酵液按體積比4% 5%接種量接入二級(jí)種子罐，通入無菌空氣1.8立方米/小時(shí)，并以180 rpm的速度攪拌進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)12 24h，得二級(jí)種子罐發(fā)酵菌液；
(3)生產(chǎn)用發(fā)酵罐培養(yǎng)，先將發(fā)酵罐滅菌，121°C，壓力1.2-1.3 kg/cm2條件下滅菌30min,裝入發(fā)酵罐培養(yǎng)基后再以121 °C條件滅菌25min，保壓降溫至25°C 30°C，按體積比4 % 5 %的接種量將二級(jí)種子罐發(fā)酵液接入發(fā)酵罐中培養(yǎng)，通入無菌空氣，通氣量3升/分鐘，溫度30°C，攪拌轉(zhuǎn)速為200rpm，培養(yǎng)36h ；
(4)制備制劑:當(dāng)菌體的發(fā)酵液密度> 20^171,菌體量不足1020^171時(shí)放罐，收集菌液，11000 rpm, 2 min離心收集菌體,生理鹽水洗漆6_8遍,先使微生物在極低溫度_70°C下快速冷凍，然后在減壓下利用升華現(xiàn)象除去水分(真空干燥，真空度-0.1Mpa，真空包裝在玻璃瓶中，_20°C保藏，即成。使用時(shí)，根據(jù)個(gè)體差異用生理鹽水溶解，通過瘤內(nèi)或靜脈給藥。所述培養(yǎng)基的配方及制備:
LB液體培養(yǎng)基配方:蛋白胨10 g-Γ1, NaCl 10 g L—1，酵母提取物5 g L—1，水溶，滅菌前pH值7.0 7.4，121 °C，20 min條件濕熱滅菌；
NBTA培養(yǎng)基配方:營(yíng)養(yǎng)瓊脂45 g，紅四氮唑0.04 g，溴麝香草酚藍(lán)0.025 g，容于I L單蒸水中，121 °C, 20 min條件濕熱滅菌；
發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方:蛋白胨2(^_ Λ酵母浸粉Ug lA NaCl 10 g L—1，葡萄糖13.7g L_1, K2HPO4 2.3 g L_1, KH2PO41.5 g.L-1，MgSO4 7H20 0.25 g.L-1，水溶，pH 值 7.0 7.4。昆蟲病原線蟲共生致病桿菌HN_xs01產(chǎn)生的抗腫瘤天然產(chǎn)物分離純化、鑒定及粉劑制備。將昆蟲病原線蟲共生致病桿菌HN_xs01在生產(chǎn)用發(fā)酵罐中以30°C，200 rpm發(fā)酵培養(yǎng)72 h,發(fā)酵培養(yǎng)液11000 rpm離心10 min,收集上清,使用Rohm and Hass公司生產(chǎn)的XAD-1l吸附樹脂進(jìn)行吸附，依次用甲醇、丙酮、乙酸乙酯萃取XAD-1l吸附樹脂，再經(jīng)高效液相色譜純化，質(zhì)譜分析，核磁共振進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析，結(jié)合腫瘤細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)，篩選出具有較高抗腫瘤活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物，并制備成方便儲(chǔ)運(yùn)的粉劑。昆蟲病原線蟲共生致病桿菌HN_xs01所產(chǎn)生的具有較高抗腫瘤活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物為苯乙酰胺類衍生物和大環(huán)內(nèi)酯類化合物,分別命名為長(zhǎng)沙霉素A(Changshamycin A,m/z 843)、長(zhǎng)沙霉素 B (Changshamycin B, m/z 785)、長(zhǎng)沙霉素 C (Changshamycin C，m/z672)和長(zhǎng)沙霉素D (Changshamycin D, m/z 560),分子結(jié)構(gòu)如下所示,具有很好的抗腫瘤活性。
權(quán)利要求
1.一株腫瘤靶向細(xì)菌，其特征在于，是昆蟲病原線蟲共生致病桿菌HN_XS01，Xenorhabdus stockiae HN_xs01 ;該菌種于2012年03月09日在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，菌種保藏編號(hào)為CCTCC NO:M 2012069。
2.一株制備如權(quán)利要求1所述腫瘤靶向細(xì)菌菌劑的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)菌種活化，將保藏于_80°C冰箱中的昆蟲病原線蟲共生致病桿菌HN_xs01劃線接種于NBTA培養(yǎng)基上，30°C條件倒置培養(yǎng)36 48 h ;然后挑取單菌落劃線，以作進(jìn)一步的純化； (2)一級(jí)發(fā)酵培養(yǎng)和二級(jí)種子罐發(fā)酵培養(yǎng):挑取經(jīng)再次純化后的stockiae HN_xs01接種LB液體培養(yǎng)基中，30°C下180 200 rpm振蕩培養(yǎng)12h至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期，然后將10 mL培養(yǎng)液接種于1000 mL LB液體培養(yǎng)基中，30°C下180 200 rpm振蕩培養(yǎng)12 24h，得一級(jí)種子罐發(fā)酵菌液；將二級(jí)種子罐在121°C下滅菌30min，裝入發(fā)酵罐培養(yǎng)基后再滅菌，冷卻至25 3(TC，將一級(jí)種子罐發(fā)酵液按體積比4% 5%接種量接入二級(jí)種子罐，通入無菌空氣1.8立方米/小 時(shí)，并以180 rpm的速度攪拌進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)12 24 h，得二級(jí)種子罐發(fā)酵菌液； (3)生產(chǎn)用發(fā)酵罐培養(yǎng)，先將發(fā)酵罐滅菌，121°C，壓力1.2-1.3 kg/cm2條件下滅菌30min，裝入發(fā)酵罐培養(yǎng)基后再以121°C條件滅菌25 min，保壓降溫至25°C 30°C，按體積比4% 5%的接種量將二級(jí)種子罐發(fā)酵液接入發(fā)酵罐中培養(yǎng)，通入無菌空氣，通氣量3升/分鐘，溫度30°C，攪拌轉(zhuǎn)速為200 rpm，培養(yǎng)36 h ； (4)制備制劑:當(dāng)菌體的發(fā)酵液密度>20^171,菌體量不足1020^171時(shí)放罐，收集菌液，11000 rpm, 2 min離心收集菌體，生理鹽水洗滌6_8遍，先使微生物在極低溫度_70°C下快速冷凍，然后在真空度-0.1Mpa下真空干燥，除去水分，真空包裝在玻璃瓶中，_20°C保藏，即成； 所述培養(yǎng)基的配方及制備: LB液體培養(yǎng)基配方:蛋白胨10 g-Γ1, NaCl 10 g L—1，酵母提取物5 g L—1，水溶，滅菌前pH值7.0 7.4，121 °C，20 min條件濕熱滅菌； NBTA培養(yǎng)基配方:營(yíng)養(yǎng)瓊脂45 g，紅四氮唑0.04 g，溴麝香草酚藍(lán)0.025 g，容于I L單蒸水中，121 °C, 20 min條件濕熱滅菌； 發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方:蛋白胨2(^_ Λ酵母浸粉Ug lA NaCl 10 g L—1，葡萄糖13.7g L_1, K2HPO4 2.3 g L_1, KH2PO41.5 g.L-1，MgSO4 7H20 0.25 g.L-1，水溶，pH 值 7.0 7.4。
3.—種如權(quán)利要求1所述腫瘤靶向細(xì)菌的具有較高抗腫瘤活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物為苯乙酰胺類衍生物和大環(huán)內(nèi)酯類化合物，分別命名為長(zhǎng)沙霉素A、長(zhǎng)沙霉素B、長(zhǎng)沙霉素C和長(zhǎng)沙霉素D，分子結(jié)構(gòu)如下所示:I
全文摘要
一株腫瘤靶向細(xì)菌及其菌劑制備方法與代謝產(chǎn)物，該腫瘤靶向細(xì)菌是昆蟲病原線蟲共生致病桿菌HN_xs01，XenorhabdusstockiaeHN_xs01；該菌種于2012年03月09日在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，菌種保藏編號(hào)為CCTCCNOM2012069。本發(fā)明還包括該腫瘤靶向細(xì)菌的菌劑制備方法與代謝產(chǎn)物。本發(fā)明之腫瘤靶向細(xì)菌通過靜脈注射后能特異積聚于小鼠腫瘤部位，而在小鼠的肝、腎、脾等正常組織和器官不能定殖，具有極強(qiáng)的腫瘤靶向性，通過最終腫瘤的重量比較，得到抑瘤率為60~100%，對(duì)小鼠黑色素瘤表現(xiàn)出很好的體內(nèi)抗腫瘤效果。
文檔編號(hào)A61P35/00GK103074282SQ20131003041
公開日2013年5月1日 申請(qǐng)日期2013年1月25日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月25日
發(fā)明者夏立秋, 張友明, 張超, 丁學(xué)知 申請(qǐng)人:湖南師范大學(xué)