專利名稱：人體免疫活性細(xì)胞dccik抗腫瘤細(xì)胞制劑的制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及人體免疫活性細(xì)胞(DCCIK)制劑的制備方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
免疫治療已被公認(rèn)是腫瘤手術(shù)、化療和放療之外的最為重要的手段，對(duì)清除腫瘤患者體內(nèi)的微轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞，防止腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)以及提高患者生存率和生活質(zhì)量具重要作用。腫瘤的特異性主動(dòng)免疫治療和被動(dòng)過繼免疫治療研究。近20年來，取得了巨大進(jìn)步(1)鑒定和純化了起免疫活化功能的細(xì)胞因子(Miller DL，et al.Science.1982；215689-390)，它可以增強(qiáng)機(jī)體對(duì)癌細(xì)胞的免疫應(yīng)答。(2)開發(fā)出能選擇性高效擴(kuò)增特異性免疫效應(yīng)細(xì)胞的方法，即獲得大量特異性具殺傷腫瘤的T和NK細(xì)胞(GrimmEA，et al.J Exp Med.1982；1551823-1941)，用于免疫治療。(3)獲得并了解了各種腫瘤特異性抗原的分子特性，例如MUC(Ioannides CG，et al.J Immunol.1993；1513693-3703)和PSA(Vesey SG，et al.Urology.1990；35483-486)等。(4)證實(shí)樹突狀細(xì)胞(Dendritic Cell，DC)是一個(gè)關(guān)鍵的抗原提呈細(xì)胞(AntigenPresenting Cells，APC)(Steinman RM.Annu Rev Immunol.1991；9271-296)起調(diào)控免疫作用。(5)認(rèn)識(shí)到腫瘤細(xì)胞具有發(fā)展各種方式以逃避免疫系統(tǒng)的能力(Khong HT，et al.Nat Immunol.2002；3999-1005)。(6)確證免疫系統(tǒng)在剔除具有免疫-刺激抗原的腫瘤細(xì)胞中起重要作用(Shan Karan V，et al.Nature，2001；4101107-1111)。
上述這些免疫學(xué)的進(jìn)步使研究者認(rèn)識(shí)到設(shè)法啟動(dòng)機(jī)體自身的免疫應(yīng)答來消滅惡性腫瘤在體內(nèi)的生長(zhǎng)是確實(shí)可行的。
在腫瘤的過繼免疫治療中，前后出現(xiàn)了5種用于治療腫瘤的免疫活性效應(yīng)細(xì)胞。(1)淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞(Lymphokine activated killer cell，LAK)(Rosenberg SA，et al.N.Engl.J.Med.1985；3131485-1492)。(2)腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(Tumorinfiltrating lymphocyte，TIL)(Itok，et al.J.Exp.Med.1988；1681419-1441)。(3)抗白細(xì)胞分化抗原-3單抗激活的殺傷細(xì)胞(Anti-CD3McAb activated killer cell，CD3-AK)(Uberti JP，et al.Clin.Immunol.Immunother.1994；70234-240)。(4)細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(Cytotoxic T lymphocyte，CTL)(Aruga A，et al.Int.J.Cancer.1991；4919-24)。(5)細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(Cytokine induced killer cell，CIK)(Schmidt-Wolf IGH，et al.J.Exp.Med.1991；174139-149)。
對(duì)上述5種免疫活性制劑用于臨床治療腫瘤后發(fā)現(xiàn)(1)盡管LAK在小鼠腫瘤實(shí)驗(yàn)中獲巨大成功，但在臨床應(yīng)用，因其對(duì)IL-2的嚴(yán)重依賴性，可產(chǎn)生全身性毒性，這限制它在人體上的廣泛應(yīng)用。
(2)CTL和TIL，特別是CTL，從理論講上是最被看好的免疫活性細(xì)胞，但因目前尚無法獲得足夠臨床所需之?dāng)?shù)量，以及其他限制因素而應(yīng)用較少。
(3)CD3-AK和CIK，兩者都是用抗CD3單抗為刺激因子來刺激T淋巴細(xì)胞增殖，幾乎具有相同的增殖活性和對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力，但CIK細(xì)胞還有賴于其他細(xì)胞因子的參與，因此CIK要比CD3-AK有更強(qiáng)的增殖和細(xì)胞毒活性。CIK細(xì)胞胞質(zhì)中含有大量顆粒，內(nèi)含酯酶、穿孔素、細(xì)胞溶解素等，可使靶細(xì)胞發(fā)生溶解和死亡。CIK細(xì)胞還分泌多種細(xì)胞因子和上調(diào)粘附分子的表達(dá)能增加效應(yīng)細(xì)胞的抗腫瘤作用。
樹突狀細(xì)胞(Dendritic cell，DC)是近來所發(fā)現(xiàn)的最為重要的免疫調(diào)控和輔助細(xì)胞，它是最主要的抗原提呈細(xì)胞，具有捕獲，加工處理抗原并向T淋巴細(xì)胞提呈抗原分子的功能，并表達(dá)共刺激分子和粘附分子；且能分泌在機(jī)體抗腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用的Th1型細(xì)胞因子IL-12，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗原特異性T淋巴細(xì)胞，認(rèn)別和殺傷腫瘤細(xì)胞。
人們又發(fā)現(xiàn)當(dāng)在CIK細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)加入腫瘤患者自體的DC后，彼此能相互作用，促進(jìn)雙方細(xì)胞的成熟，并誘導(dǎo)出比同源CIK細(xì)胞更強(qiáng)增殖活性和更高腫瘤細(xì)胞殺傷活性的細(xì)胞群(Marten A，et al.J Immunother.2001；24(6)502-510)。
本發(fā)明人在對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖特性研究的基礎(chǔ)上，把DC與CIK進(jìn)行共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)可產(chǎn)生出一個(gè)比原CIK細(xì)胞更為高的增殖率和更強(qiáng)抑瘤細(xì)胞毒活性的細(xì)胞群。并把該新型細(xì)胞定命為DCCIK(免疫活性細(xì)胞)，本發(fā)明人用該DCCIK在人體肺腺癌裸鼠動(dòng)物模型證實(shí)DCCIK實(shí)驗(yàn)組比CIK和生理鹽水(NC)兩對(duì)照組有顯著差異，其生存期分別為60±78；40.5±5.6和19.8±1.2(P＜0.01)，并證實(shí)DCCIK細(xì)胞免疫治療可以改善帶瘤(肺癌、肝癌、黑色素瘤)裸鼠化療的效果，兩者有協(xié)同抑瘤效果，可使瘤體縮小和消失而單純化療組只有縮小無消失現(xiàn)象。這表明DCCIK對(duì)多種腫瘤有治療意義，提示在臨床上選用DCCIK作為腫瘤病人的免疫治療制劑將比CIK細(xì)胞更具優(yōu)勢(shì)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于研究設(shè)計(jì)制備DCCIK細(xì)胞制劑。
本發(fā)明提供了一種人體免疫活性細(xì)胞DCCIK抗腫瘤細(xì)胞制劑，該細(xì)胞制劑使用患者自體外周血來源的PBMC，經(jīng)培養(yǎng)分離獲得粘附和非粘附兩類細(xì)胞，再經(jīng)相關(guān)細(xì)胞因子誘導(dǎo)分別產(chǎn)生DC和CIK細(xì)胞。用α-Galcer或CI沖擊DC后再與CIK按比例進(jìn)行共培養(yǎng)，即獲得CD3+CD56+為主的一個(gè)免疫活性細(xì)胞群(DCCIK)。
本發(fā)明DCCIK的創(chuàng)新是使用了α-Galcer糖脂質(zhì)和CI鈣離子載體來多次沖擊共培前的DC，使DC對(duì)其進(jìn)行捕獲、加工處理在與CIK共培時(shí)向T淋巴細(xì)胞提呈該抗原分子進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，在DC與CIK的相互接觸反應(yīng)中使多基因活化表達(dá)和釋放更多的細(xì)胞因子及上調(diào)T淋巴細(xì)胞中的CD3+CD56+比例，這將極大地增強(qiáng)了DCCIK對(duì)腫瘤靶細(xì)胞的細(xì)胞毒殺傷活性。
本發(fā)明提供了人體免疫活性細(xì)胞DCCIK抗腫瘤細(xì)胞制劑的制備方法，該方法包括下列步驟(1)外周血單個(gè)核細(xì)胞PBMC的制備無菌條件下用血分器取腫瘤患者抗凝外周血，用生理鹽水對(duì)倍稀釋后，用淋巴細(xì)胞分離液Ficoll，1.077，離心2000rpm×25’，分離得PBMC，再用Hanks液洗滌2次，鏡下計(jì)細(xì)胞數(shù)，最后用無血清培養(yǎng)液AIM-V調(diào)節(jié)細(xì)胞密度使成4×106/ml細(xì)胞懸液。
(2)非粘附與粘附細(xì)胞分離將細(xì)胞懸液移入6孔板Nuclon，37℃，5％CO2，培養(yǎng)2h，然后用移液管輕輕沖吸細(xì)胞，將非粘附細(xì)胞懸液收集在離心管中作誘導(dǎo)CIK細(xì)胞備用，粘附細(xì)胞就留在6孔板上，加入DC培養(yǎng)液3ml/孔待用；(3)非粘附CIK細(xì)胞的誘導(dǎo)和擴(kuò)增把離心管中的非粘附細(xì)胞懸液接種到含有IFN-γ1000U/ml AIM-V培養(yǎng)液的25cm2培養(yǎng)瓶100ml/瓶，置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中24-36h后，把用Hanks液配制的抗CD3單抗5μg/ml包被25cm2培養(yǎng)瓶，同時(shí)加入終濃度IL-1β100U/ml AIM-V，IL-2 300U/mlAIM-V繼續(xù)培養(yǎng)48h，鏡下計(jì)數(shù)，用CIK培液調(diào)細(xì)胞密度為4×105/ml，每隔48h按上述相同條件擴(kuò)增1次，培養(yǎng)至第5-7天即收集CIK細(xì)胞備用；抗CD3單抗包被方法在AIM-V培液中加入抗CD3單抗，使成為抗CD3單抗?jié)舛葹?～10μg/ml的包被液，在25cm2培養(yǎng)瓶中加入5ml包被液，4℃過夜或者37℃溫育2h后，棄去全部包被液即可；(4)粘附DC細(xì)胞的誘導(dǎo)和擴(kuò)增在留有粘附細(xì)胞的6孔板上，每孔添加DC培液3ml內(nèi)含有GM-CSF 800U/ml和IL-4500U/ml，于37℃，5％CO2培養(yǎng)2天后，在各孔添加α-Galcer 100ng/ml或CI(200ng/ml)，每天加1次，共3次，連續(xù)刺激3天以后，于第5-7天收集細(xì)胞備用；(5)DC與CIK 1∶5混合共培養(yǎng)制取DCCIK細(xì)胞取培養(yǎng)至第5天之DC和CIK細(xì)胞，計(jì)數(shù)，離心，分別收集DC和CIK細(xì)胞，用AIM-V無血清培養(yǎng)液調(diào)兩細(xì)胞的密度分別為2×105和1×106，按DC∶CIK＝1∶5等體積混合后移入25cm2培養(yǎng)瓶10ml/瓶，于37℃，5％CO2培養(yǎng)，每隔48-72h按以上細(xì)胞密度分瓶擴(kuò)大培養(yǎng)1次，經(jīng)5次擴(kuò)大培養(yǎng)后即可獲5×109～1×1010的DCCIK細(xì)胞；(6)DCCIK細(xì)胞制劑離心收集1～5×109細(xì)胞，用0.9％氯化鈉注射液洗滌2次，離心，棄上清，將細(xì)胞移至250ml輸液瓶中，加2g人血清白蛋白和250ml 0.9％氯化鈉注射液，制成細(xì)胞懸液制劑，留樣，進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的檢定，凡合格者，低溫保存，待用。
本發(fā)明應(yīng)用共培養(yǎng)得到的DCCIK細(xì)胞與LAK、CIK細(xì)胞一樣均為非均質(zhì)細(xì)胞群，其主要生物學(xué)特性如下(1)細(xì)胞組成DCCIK細(xì)胞中T淋巴細(xì)胞大于90％以上和少量DC。T淋巴細(xì)胞中各亞群所占比例具有個(gè)體差異和因體外培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)短而有一定變化范圍，一般為CD3-CD56+T細(xì)胞(NK細(xì)胞)為20～40％，CD3+CD8+細(xì)胞為20～50％，CD3+CD56+(NKT)細(xì)胞為50～70％。
(2)增殖活性高DCCIK細(xì)胞的增殖活性比CIK細(xì)胞強(qiáng)大，體外擴(kuò)增3～4周后，DCCIK細(xì)胞比同源CIK細(xì)胞和LAK細(xì)胞分別大2～4倍和20～40倍。
(3)釋放細(xì)胞因子量大DCCIK細(xì)胞釋放IFN-γ的量是同源CIK細(xì)胞的2～5倍。
(4)細(xì)胞毒性高與同源CIK細(xì)胞比較，DCCIK細(xì)胞體外對(duì)特異性靶細(xì)胞的殺傷作用高出10～20％，表現(xiàn)對(duì)同源惡性細(xì)胞的特異性殺傷，人癌動(dòng)物模型治療實(shí)驗(yàn)表明，DCCIK組動(dòng)物的平均生存期約是CIK組動(dòng)物的1～2倍(見動(dòng)物試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)表)。
實(shí)驗(yàn)組No.1接種生理鹽水(N.S)對(duì)照組No.2 CIK實(shí)驗(yàn)組No.3 DCCIK實(shí)驗(yàn)組方法每只動(dòng)物接種A549 3×105個(gè)細(xì)胞，接種后24h、72h、144h分別尾部靜脈給生理鹽水、CIK細(xì)胞(5×106)、DCCIK(5×106)，以生存天數(shù)作為觀察指標(biāo)來考察3組實(shí)驗(yàn)的致瘤情況和療效。
CIK與DCCIK對(duì)A549腫瘤動(dòng)物生存期的影響

可見，CIK組和DCCIK組分別與對(duì)照組相比其P值均小于0.001，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間存在有非常顯著的差異，且CIK組和DCCIK組之間也有顯著差異(P＜0.01)。結(jié)果表明CIK和DCCIK都顯示了對(duì)A549腫瘤的強(qiáng)烈抑制作用，其生存期CIK組比對(duì)照組的生存期延長(zhǎng)了1倍多，而DCCIK組比對(duì)照組延長(zhǎng)了幾近2倍。說明DCCIK組比CIK組展示出更強(qiáng)的抑瘤力，提示在臨床上選用DCCIK做腫瘤病人的免疫治療制劑將比CIK更有優(yōu)勢(shì)。
DCCIK細(xì)胞制劑主要用于自體腫瘤的臨床治療，可以配合術(shù)后和放、化療后的輔助治療能有效防轉(zhuǎn)腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。此外，DCCIK細(xì)胞也可用于某些傳染性疾病和中毒性化學(xué)損傷，有較好的臨床應(yīng)用前景。
具體實(shí)施例方式
以下通過具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明1.外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)的制備無菌條件下用血分器取確診的腫瘤患者抗凝外周血，用生理鹽水(0.9％NaCl)等倍稀釋后，用淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll，1.077)，離心(2000rpm×25’)，分離得PBMC，再用Hanks液洗滌2次，鏡下計(jì)細(xì)胞數(shù)，最后用無血清培液(AIM-V)調(diào)節(jié)細(xì)胞密度使成4×106/ml細(xì)胞懸液。
2.非粘附與粘附細(xì)胞分離將細(xì)胞懸液移入6孔板(Nuclon)，置37℃，5％CO2培養(yǎng)2-6h，然后用移液管輕輕沖吸細(xì)胞，將非粘附細(xì)胞懸液收集在離心管中作誘導(dǎo)CIK細(xì)胞備用；而粘附細(xì)胞就留在6孔板上，加入DC培養(yǎng)液(3ml/孔)。
3.非粘附(CIK)細(xì)胞的誘導(dǎo)和擴(kuò)增把離心管中的非粘附細(xì)胞懸液接種到含有IFN-γ(1000U/ml)AIM-V培養(yǎng)液的25cm2培養(yǎng)瓶(100ml/瓶)，置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中24-36h后，把用Hanks液配制的抗CD3單抗(5μg/ml)包被*25cm2培養(yǎng)瓶，同時(shí)加入終濃度IL-1β(100U/ml AIM-V)，IL-2(300U/ml AIM-V)繼續(xù)培養(yǎng)48-72h，鏡下計(jì)數(shù)。用CIK培液調(diào)細(xì)胞密度為4×105/ml，每隔48h按上述相同條件擴(kuò)增1次，培養(yǎng)至第5-7天即收集CIK細(xì)胞備用。
4.粘附(DC)細(xì)胞的誘導(dǎo)和擴(kuò)增在留有粘附細(xì)胞的6孔板上，每孔添加DC培液3ml，內(nèi)含有GM-CSF(800U/ml)和IL-4(500U/ml)，于37℃，5％CO2培養(yǎng)2天后，在各孔添加Galcer(100ng/ml)或CI(200ng/ml)，每天加1次，共3次，連續(xù)刺激3天以后，于第5-7天收集細(xì)胞備用。
5.DC與CIK(1∶5混合)共培養(yǎng)制取DCCIK細(xì)胞取培養(yǎng)至第5-7天之DC和CIK細(xì)胞，計(jì)數(shù)，離心，分別收集DC和CIK細(xì)胞，用AIM-V無血清培養(yǎng)液調(diào)兩細(xì)胞的密度分別為2×105和1×106(DC∶CIK＝1∶5)等體積混合后移入25cm2培養(yǎng)瓶(10ml/瓶)，于37℃，5％CO2培養(yǎng)，每隔48-72h按以上細(xì)胞密度分瓶擴(kuò)大培養(yǎng)1次，經(jīng)5次擴(kuò)大培養(yǎng)后，即可獲5×109～1×1010的DCCIK細(xì)胞。
6.DCCIK細(xì)胞制劑離心收集1～2×109細(xì)胞，用0.9％氯化鈉注射液洗滌2次，離心，棄上清，將細(xì)胞移至250ml輸液瓶中，加入2g人血清白蛋白和250ml 0.9％氯化鈉注射液，制成細(xì)胞懸液，留樣，進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的檢定，凡合格者，低溫保存，待用。
權(quán)利要求
1.一種人體免疫活性細(xì)胞DCCIK抗腫瘤細(xì)胞制劑，其特征在于該制劑是通過下列方法制得的，(1)外周血單個(gè)核細(xì)胞PBMC的制備無菌條件下用血分器取腫瘤患者抗凝外周血，用生理鹽水對(duì)倍稀釋后，用淋巴細(xì)胞分離液Ficoll，1.077，離心2000rpm×25’，分離得PBMC，再用Hanks液洗滌2次，鏡下計(jì)細(xì)胞數(shù)，最后用無血清培養(yǎng)液AIM-V調(diào)節(jié)細(xì)胞密度使成4×106/ml細(xì)胞懸液；(2)非粘附與粘附細(xì)胞分離將細(xì)胞懸液移入6孔板Nuclon，37℃，5％CO2，培養(yǎng)2-6h，然后用移液管輕輕沖吸細(xì)胞，將非粘附細(xì)胞懸液收集在離心管中作誘導(dǎo)CIK細(xì)胞備用，粘附細(xì)胞就留在6孔板上，加入DC培養(yǎng)液3ml/孔待用；(3)非粘附CIK細(xì)胞的誘導(dǎo)和擴(kuò)增把離心管中的非粘附細(xì)胞懸液接種到含有IFN-γ 1000U/ml AIM-V培養(yǎng)液的25cm2培養(yǎng)瓶，100ml/瓶，置37℃，5％CO2培箱中24-36h后，把用Hanks液配制的抗CD3單抗5μg/ml包被25cm2培養(yǎng)瓶，同時(shí)加入終濃度IL-1β 100U/ml AIM-V，IL-2300U/mlAIM-V繼續(xù)培養(yǎng)48-72h，鏡下計(jì)數(shù)，用CIK培養(yǎng)液調(diào)細(xì)胞密度為4×105/ml，每隔48h按上述相同條件擴(kuò)增1次，培養(yǎng)至第5-7天即收集CIK細(xì)胞備用；抗CD3單抗包被方法在AIM-V培液中加入抗CD3單抗，使成為抗CD3單抗?jié)舛葹?～10μg/ml的包被液，在25cm2培瓶中加入5ml包被液，4℃過夜或者37℃溫育2h后，棄去全部包被液即可；(4)粘附DC細(xì)胞的誘導(dǎo)和擴(kuò)增在留有粘附細(xì)胞的6孔板上，每孔添加DC培液3ml內(nèi)含有GM-CSF 800U/ml和IL-4500U/ml，于37℃，5％CO2培養(yǎng)2天后，在各孔添加α-Galcer 100ng/ml或CI(200ng/ml)，每天加1次，共3次，連續(xù)刺激3天后，于第5-7天收集細(xì)胞備用；(5)DC與CIK 1∶5混合共培養(yǎng)制取DCCIK細(xì)胞取培養(yǎng)至第5-7天之DC和CIK細(xì)胞，計(jì)數(shù)，離心，分別收集DC和CIK細(xì)胞，用AIM-V無血清培液調(diào)兩細(xì)胞的密度分別為2×105和1×106，按DC∶CIK＝1∶5等體積混合后移入25cm2培養(yǎng)瓶10ml/瓶，于37℃，5％CO2培養(yǎng)，每隔48-72h按以上細(xì)胞密度分瓶擴(kuò)大培養(yǎng)1次，經(jīng)5次擴(kuò)大培養(yǎng)后即可獲5×109～1×1010的DCCIK細(xì)胞；(6)DCCIK細(xì)胞制劑離心收集1～5×109細(xì)胞，用0.9％氯化鈉注射液洗滌2次，離心，棄上清，將細(xì)胞移至250ml輸液瓶中，加2g人血清白蛋白和250ml 0.9％氯化鈉注射液，制成細(xì)胞懸液制劑。
2.一種人體免疫活性細(xì)胞DCCIK抗腫瘤細(xì)胞制劑的制備方法，其特征在于該方法包括下列步驟(1)外周血單個(gè)核細(xì)胞PBMC的制備無菌條件下用血分器取腫瘤患者抗凝外周血，用生理鹽水等倍稀釋后，用淋巴細(xì)胞分離液Ficoll，1.077，離心2000rpm×25’，分離得PBMC，再用Hanks液洗滌2次，鏡下計(jì)細(xì)胞數(shù)，最后用無血清培養(yǎng)液AIM-V調(diào)節(jié)細(xì)胞密度使成4×106/ml細(xì)胞懸液；(2)非粘附與粘附細(xì)胞分離將細(xì)胞懸液移入6孔板Nuclon，37℃，5％CO2，培養(yǎng)2h，然后用移液管輕輕沖吸細(xì)胞，將非粘附細(xì)胞懸液收集在離心管中作誘導(dǎo)CIK細(xì)胞備用，粘附細(xì)胞就留在6孔板上，加入DC培養(yǎng)液3ml/孔待用；(3)非粘附CIK細(xì)胞的誘導(dǎo)和擴(kuò)增把離心管中的非粘附細(xì)胞懸液接種到含有IFN-γ1000U/ml AIM-V培養(yǎng)液的25cm2培養(yǎng)瓶10-15ml/瓶，置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中24-36h后，把用Hanks液配制的抗CD3單抗5μg/ml包被25cm2培養(yǎng)瓶，同時(shí)加入終濃度IL-1β 100U/ml AIM-V，IL-2300U/ml AIM-V繼續(xù)培養(yǎng)48-72h，鏡下計(jì)數(shù)，用CIK培液調(diào)細(xì)胞密度為4×105/ml，每隔48h按上述相同條件擴(kuò)增1次，培養(yǎng)至第5-7天即收集CIK細(xì)胞備用；抗CD3單抗包被方法在AIM-V培液中加入抗CD3單抗，使成為抗CD3單抗?jié)舛葹?～10μg/ml的包被液，在25cm2培養(yǎng)瓶中加入5ml包被液，4℃過夜或者37℃溫育2h后，棄去全部包被液即可；(4)粘附DC細(xì)胞的誘導(dǎo)和擴(kuò)增在留有粘附細(xì)胞的6孔板上，每孔添加DC培液3ml內(nèi)含有GM-CSF 800U/ml和IL-4500U/ml，于37℃，5％CO2培養(yǎng)2天后，在各孔添加α-Galcer 100ng/ml或CI(200ng/ml)，每天加1次，共3次，連續(xù)刺激3天后，于第5-7天收集細(xì)胞備用；(5)DC與CIK 1∶5混合共培養(yǎng)制取DCCIK細(xì)胞取培養(yǎng)至第5-7天之DC和CIK細(xì)胞，計(jì)數(shù)，離心，分別收集DC和CIK細(xì)胞，用AIM-V無血清培養(yǎng)液調(diào)兩細(xì)胞的密度分別為2×105和1×106，按DC∶CIK＝1∶5等體積混合后移入25cm2培養(yǎng)瓶10ml/瓶，于37℃，5％CO2培養(yǎng)，每隔48-72h按以上細(xì)胞密度分瓶擴(kuò)大培養(yǎng)1次，經(jīng)5次擴(kuò)大培養(yǎng)后即可獲5×109～1×1010的DCCIK細(xì)胞；(6)DCCIK細(xì)胞制劑離心收集1～5×109細(xì)胞，用0.9％氯化鈉注射液洗滌2次，離心，棄上清，將細(xì)胞移至250ml輸液瓶中，加2g人血清白蛋白和250ml 0.9％氯化鈉注射液，制成細(xì)胞懸液制劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種人體免疫活性細(xì)胞DCCIK細(xì)胞制劑的制備方法，其特征在于其中所述的步驟(3)，非粘附CIK細(xì)胞的誘導(dǎo)和擴(kuò)增，采用固相抗CD3單克隆抗體刺激的方法，包括在無血清培養(yǎng)AIM-V中加入抗CD3單抗，使成為抗CD3單抗?jié)舛葹?～10μg/ml的包被液，加入培養(yǎng)瓶，4℃過夜或37℃溫育2h后，傾去全部包被液后，移入經(jīng)IFN-γ處理過非粘附的細(xì)胞懸液接受抗CD3單抗的刺激。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種人體免疫活性細(xì)胞DCCIK細(xì)胞制劑制備方法，其特征在于其中所述的步驟(4)，DC的誘導(dǎo)和擴(kuò)增，除去DC培養(yǎng)液中除添加GM-CSF和IL-4外，還在各培養(yǎng)孔中添加α-Galcer 100ng/ml或CI 200ng/ml，每24h 1次，共3次。
5.一種人體免疫活性細(xì)胞DCCIK在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了人體免疫活性細(xì)胞(DCCIK)抗腫瘤細(xì)胞制劑及制備方法。該方法用有關(guān)細(xì)胞因子對(duì)取自患者外周血分別誘導(dǎo)成DC與CIK，在應(yīng)用α－Galcer或CI對(duì)DC反復(fù)沖擊后與CIK細(xì)胞按比例作混合共培養(yǎng)，即獲DCCIK細(xì)胞。與同源CIK比較，其增殖活性和細(xì)胞毒活性均有較大提高。該DCCIK為未經(jīng)相關(guān)腫瘤抗原沖擊而對(duì)同源腫瘤具有特異靶向和高效廣譜殺瘤作用。可有效防止腫瘤術(shù)后和放化療后的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。在與其他療法配合下，可延長(zhǎng)患者生存期并改善生活質(zhì)量。
文檔編號(hào)A61K35/14GK1990044SQ20051011238
公開日2007年7月4日 申請(qǐng)日期2005年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月30日
發(fā)明者劉祥麟, 王定華 申請(qǐng)人:上海中科英達(dá)生物技術(shù)有限公司