專利名稱：治療幽門螺桿菌感染的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及治療幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)感染的方法，用于這類方法的藥物制劑，能維持幽門螺桿菌球形培養(yǎng)物存活的方法，以及使球形轉(zhuǎn)變?yōu)槁菪蔚姆椒ā?br> 幽門螺桿菌是一種革蘭氏陰性菌，它與慢性活性胃炎和消化性潰瘍病密切相關(guān)(Marshall等，Medical Journal of Australia，142439-444(1985)；Buck，G.E.，Journal of Clinical Microbiology，31-12(1990))。在體外培養(yǎng)時，幽門螺桿菌以兩種不同的形態(tài)存在，即可培養(yǎng)的螺旋形和不能培養(yǎng)的球形(Marshall等，Microbios letters，2583-88(1984)；Kung，J.S.L.，和HO，B.，Workshop on Gastroduodenal Pathology andCampylobacter pylori(abstract P9)，編輯F.Megraud和H.Lamouliatte，Bordeaux，F(xiàn)rance(1988))。該細菌的螺旋形在與空氣接觸約2小時后不能存活。在不利條件下，螺旋形分化成球形(Vijayakumari和Ho，ActaGastro-enterologica Belgica，56101(1993))。
迄今為止，只有一個成功地在體外將球形轉(zhuǎn)變?yōu)槁菪蔚膱蟮溃瑯I(yè)已證實該實驗不能重復(Mai等人，Gastroduodenal Pathology andCam pylobacter pylori，PP28-33，編者F.Megraud和H.Lamouliatte，Elsevier Science Publishers(1989))。雖然體外形成球形可通過抗生素或脫除營養(yǎng)物而實現(xiàn)(Nilius等人，Zbl.Bakt.280259-272(1993))，但下列因素妨礙了對該球形的研究缺乏有關(guān)該形式的信息，它在幽門螺桿菌生命周期中的作用，以及缺乏任何獲取該形式的培養(yǎng)物的方法。迄今一直認為幽門螺桿菌的球形實際上是“死的”、非存活的形式，它在該細菌生命周期中的作用尚不清楚。
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)該球形是有活性的且能被誘導轉(zhuǎn)變?yōu)槁菪巍Ｒ环N可能的方法是施用脲酶而實現(xiàn)該轉(zhuǎn)變。WO 95/22987公開了應用基于脲酶的疫苗治療幽門螺桿菌感染。但未公開基于脲酶使球形轉(zhuǎn)變?yōu)槁菪蔚耐ㄓ谩盎瘜W”非免疫方法。由于該細菌的螺旋形可用抗生素處理，這些結(jié)果說明有可能更有效地治療幽門螺桿菌感染，所以再發(fā)生幽門螺桿菌介導的胃病的幾率將大為減小。
因此，本發(fā)明的第一方面提供了治療哺乳動物幽門螺桿菌感染的方法，它包括給哺乳動物施用一種能誘使幽門螺桿菌從球形轉(zhuǎn)變?yōu)槁菪蔚霓D(zhuǎn)變劑。
該轉(zhuǎn)變劑優(yōu)選不是呈疫苗的形式，即不是施用它來激發(fā)任何免疫反應的。
一般說來，施用該轉(zhuǎn)變劑將構(gòu)成涉及施用一種或多種抗生素的治療方案的一部分。所以，在本發(fā)明該方面的一個實施方案中，本方法進一步包括給哺乳動物施用有效量的至少一種抗生素的步驟。
在施用該轉(zhuǎn)變劑之后施用一種或多種抗生素較為合適。這樣，可在施用抗生素之前使球形轉(zhuǎn)變?yōu)槁菪巍?br> 當然，已知抗生素能誘使螺旋形逆變?yōu)榍蛐巍Ｒ虼耍ǔ５那闆r是，需要施用數(shù)次轉(zhuǎn)變劑/抗生素循環(huán)以保證有效地根除幽門螺桿菌。于是，本發(fā)明的第二個方面提供了治療哺乳動物幽門螺桿菌感染的方法，該方法包括至少兩次治療循環(huán)，每次治療循環(huán)包括(i)給哺乳動物施用一種能誘使幽門螺桿菌從球形轉(zhuǎn)變成螺旋形的轉(zhuǎn)變劑；(ii)給哺乳動物施用有效量的至少一種抗生素。
每次治療循環(huán)之后，余留的幽門螺桿菌數(shù)量將越來越少。治療終點可應用可商購的幽門螺桿菌診斷檢驗來測定。
在本發(fā)明這些方面優(yōu)選的實施方案中，施用的轉(zhuǎn)變劑是足以使幽門螺桿菌從球形轉(zhuǎn)變?yōu)槁菪蔚囊欢侩迕浮Ｔ诒景l(fā)明的上下文中，脲酶包括所有形式的脲酶，可以是細菌的(例如幽門螺桿菌或奇異變形菌(Protieus mirabitis)脲酶)或是非細菌的(例如刀豆脲酶)，以及脲酶的一種或多種單獨的亞單位，或者就是得自這類亞單位的肽。在一個實施方案中，只施用脲酶的C亞單位和D亞單位。
如果施用的轉(zhuǎn)變劑是脲酶，則本方法還可包括給哺乳動物施用尿素。尿素可以一起施用或者單獨施用。
給定了幽門螺桿菌有機體生命周期的性質(zhì)，就可見防止螺旋形向球形轉(zhuǎn)變的方法也能有效地提高正常幽門螺桿菌治療方案的效果。因此，本發(fā)明的第三個方面提供了治療哺乳動物幽門螺桿菌感染的方法，該方法包括給哺乳動物施用一種能防止幽門螺桿菌從螺旋形轉(zhuǎn)變?yōu)榍蛐蔚淖柚箘?br> 在本發(fā)明該方面的一個實施方案中，該阻止劑也是脲酶，任選與尿素一起施用。
治療幽門螺桿菌感染的另一個可能的方法是通過使該有機體在螺旋形和球形之間轉(zhuǎn)變而“耗盡”該有機體。于是，本發(fā)明的第四個方面提供了治療哺乳動物幽門螺桿菌感染的方法，該方法包括一次或多次治療循環(huán)，每次治療循環(huán)包括(i)給哺乳動物施用一種能誘使幽門螺桿菌從球形轉(zhuǎn)變?yōu)槁菪蔚霓D(zhuǎn)變劑；和(ii)給哺乳動物施用一種能誘使幽門螺桿菌從螺旋形轉(zhuǎn)變?yōu)榍蛐蔚霓D(zhuǎn)變劑。
在本發(fā)明該方面的一個實施方案中，能誘使向螺旋形轉(zhuǎn)變的轉(zhuǎn)變劑是脲酶，而能誘使向球形轉(zhuǎn)變的轉(zhuǎn)變劑是“抗脲酶”，例如脲酶的抑制劑或特異性抗體。
本發(fā)明的第五個方面提供了治療哺乳動物幽門螺桿菌感染的方法，該方法包括給哺乳動物施用能改變胃中pH的試劑。在該實施方案中，降低pH可使存在的螺旋形幽門螺桿菌提高脲酶產(chǎn)量。脲酶含量的增高能使存在的任何球形轉(zhuǎn)變?yōu)槁菪危谑鞘箍股靥幚砀鼮橛行АＲ虼耍痉椒ㄍǔ＿€包括給哺乳動物施用至少一種抗生素的步驟。改變pH的方法可包括服用可食用的酸或堿。
在本文所述的本發(fā)明的所有方法中，哺乳動物優(yōu)選是人。
本發(fā)明的方法一般應用呈藥物制劑形式的轉(zhuǎn)變劑。因此，本發(fā)明的第六個方面提供了一種藥物制劑，它包括一種能誘使幽門螺桿菌從球形轉(zhuǎn)變?yōu)槁菪蔚霓D(zhuǎn)變劑以及一種或多種藥物上可接受的載體和/或賦形劑。該藥物制劑也優(yōu)選不是呈疫苗的形式。
在本發(fā)明該方面的一個實施方案中，該轉(zhuǎn)變劑是脲酶，而且該藥物制劑也任選包括尿素。
本發(fā)明的藥物制劑可呈含有預定量轉(zhuǎn)變劑的單位劑量形式，例如每個劑量中含脲酶(和任選含尿素)。這樣的一個單位包含例如足夠的脲酶以便在37℃下30min內(nèi)轉(zhuǎn)變3mg尿素，這取決于病人的年齡、體重和病況。
本發(fā)明的藥物制劑應適于口服，并且可呈不同的單位形式，例如膠囊或片劑；粉劑或粒劑；在水成液或非水液體中的溶液或懸浮液；可食用的泡沫體；或水包油型液體乳液或油包水型液體乳液，或任何慣常的或非慣常的藥物形式。
如果脲酶和尿素一起施用，則適當?shù)氖┯眯问綉乐惯@兩種組分混合。
本發(fā)明的第七個方面提供了一種能使幽門螺桿菌從球形轉(zhuǎn)變?yōu)槁菪蔚霓D(zhuǎn)變劑在制備用于治療幽門螺桿菌感染的藥劑中的應用。在該方面的一個實施方案中，該轉(zhuǎn)變劑也是脲酶，且該藥劑也任選包括尿素。該藥劑也優(yōu)選不是疫苗。
本文所述結(jié)果還可應用于體外。因此，本發(fā)明的其它方面提供了(a)將培養(yǎng)物中幽門螺桿菌從球形轉(zhuǎn)變成螺旋形的方法，它包括向球形培養(yǎng)物中添加能誘使幽門螺桿菌從球形轉(zhuǎn)變?yōu)槁菪蔚霓D(zhuǎn)變劑；和(b)將培養(yǎng)物中幽門螺桿菌從螺旋形轉(zhuǎn)變成球形的方法，它包括向螺旋形培養(yǎng)物中添加能誘使幽門螺桿菌從螺旋形轉(zhuǎn)變?yōu)榍蛐蔚霓D(zhuǎn)變劑。
至于(a)，轉(zhuǎn)變劑可呈生長有螺旋形但已從中除去了螺旋形的培養(yǎng)基的形式。螺旋形在培養(yǎng)基中優(yōu)選至少生長了3天。另外，該轉(zhuǎn)變劑是脲酶，任選和尿素一起。
至于(b)，優(yōu)選的轉(zhuǎn)變劑是“抗脲酶”，例如脲酶抑制劑或脲酶的特異性抗體。
因此，體外轉(zhuǎn)變方法為生產(chǎn)球形和螺旋形兩種待生產(chǎn)的抗原來源創(chuàng)造了條件。它們將特別適用于生產(chǎn)特異性抗原，該抗原用于該細菌的兩種形式的診斷檢驗中。
本發(fā)明的各方面的優(yōu)選特征在于，各方面相互之間已作必要的修正。
現(xiàn)在將參照下述實施例闡述本發(fā)明，不能認為下述實施例以任何方式限定本發(fā)明。
實施例1a)細菌菌株和球形幽門螺桿菌的制備應用從患有非潰瘍性消化不良病人分離的局部幽門螺桿菌菌株V2，不過也可同樣應用其它野生型株。最初在巧克力血液瓊脂(CBA)上生長該菌株以檢查純度。然后將該平板培養(yǎng)物用作種菌接種含有30mlBHIH(添加有10％馬血清和0.4％酵母提取物的腦心浸漬物)的250mlSchott平底圓瓶，在37℃下培養(yǎng)72h。該培養(yǎng)物反過來又作為恒化器或分批培養(yǎng)物的種菌。
如Ho和Vijayakumari(Microbios，7659-66(1993))所述那樣裝配含有540ml BHIH的1.5L發(fā)酵罐。用培養(yǎng)3天的2×30ml幽門螺桿菌培養(yǎng)物接種該培養(yǎng)基，給定1∶10(種菌培養(yǎng)基)的比率。每天供應兩次二氧化碳，并將攪拌機調(diào)節(jié)至35rpm。以一定時間間隔取樣，檢查脲酶活性，pH，生存力，和顯微鏡檢查形態(tài)變化。
在這些條件下保持該培養(yǎng)物達3個月，其間繼續(xù)每天監(jiān)控這些細胞。當觀察到均勻/同步培養(yǎng)物時，在10,000g下離心40min收獲細胞并洗滌一次。然后采用改進的甘氨酸法(Ho，B.，和Jiang，B.，EuropeanJournal of Gastroenterology and Hepatology，7121-124(1995))將沉淀物用來制備球形抗原。
也可應用1L Schott圓底瓶或具有密封橡皮塞、帶側(cè)臂的1L錐形瓶，瓶中盛有270ml BHIH。鉆一個直徑為7mm的孔以便能安裝一次性的過濾裝置，該過濾裝置包括直徑為50mm的0.22μm濾器(例如Gelman)。每個270ml BHIH用30ml培養(yǎng)3天的幽門螺桿菌培養(yǎng)物接種。通過該0.22μm濾器每天供給兩次二氧化碳。
在37℃的振蕩培養(yǎng)箱(New Brunswick)中在90rpm下培養(yǎng)該培養(yǎng)物達9周，接著在10,000g下離心40min來收獲細胞。
將所得球形菌在-80℃的甘油-BHIH中貯存2年。需要時，在10,000xg下離心30min收集球形菌，并用PBS(pH7.2)洗滌一次。
誘導培養(yǎng)液(IB)的制備將培養(yǎng)3天的幽門螺桿菌螺旋形菌接種入上述1.5L發(fā)酵罐或1LSchott旋塞瓶或1L錐形瓶中的BHIH。3天后，在10,000xg下離心10min收集上清液。用0.2μm膜濾器將廢培養(yǎng)基過濾兩次。后面稱該濾液為誘導培養(yǎng)液(IB)。將兩個濾器轉(zhuǎn)到CBA板上并在37℃潮濕的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1周。
將球形菌誘導成螺旋形將球形幽門螺桿菌接種入30ml上清液(IB)并在37℃下5％的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至最終濃度為每ml 108個球形菌。將相似量的球形菌接種入30ml新鮮的BHIH作為對照。隨后，隨時間(24hr)往球形培養(yǎng)物中加入新鮮的BHIH。
透射電子顯微術(shù)在24、48、72和96小時的時間間隔，通過離心作用收獲各培養(yǎng)物的等分樣并在PBS中洗滌兩次。將細胞重懸于PBS中并用負染色法處理，用于透射電子顯微術(shù)。
也可將細胞固定于2％戊二醛的0.1M二甲胂酸鹽緩沖液(pH7.0)中達2-3小時或者在4℃下放置一夜，然后用0.1M二甲胂酸鹽緩沖液洗滌兩遍。將細胞重懸于蒸餾水中，再用上述負染色法處理。
將數(shù)滴細胞懸浮液放在涂覆碳的400目銅網(wǎng)上達1分鐘。吸干多余的液體，將銅網(wǎng)風干使之固定。再用1滴1％的磷鎢酸把銅網(wǎng)染色1分鐘，然后吸干過剩的染液。風干后，將銅網(wǎng)用Philips CM120透射電子顯微鏡檢查。
用抗生素處理在BHIH中進一步用5μg/ml阿莫西林處理球形菌以保證任何存在的螺旋形被誘導成球形，或者被殺死。處理之后，將球形菌懸浮液洗滌2次，重懸于初始體積的BHIH中。將1ml懸浮液等分樣接種入新鮮的BHIH并接著培養(yǎng)。
將尿素加入IB和BHIH以5mM的濃度往IB或BHIH中的球形菌內(nèi)加入尿素。以一定的時間間隔取樣供顯微鏡檢查，并在CBA上和BHIH中傳代培養(yǎng)。
結(jié)果在單獨的BHIH或CBA的傳代培養(yǎng)中未生長球形制劑。類似地，用于過濾幽門螺桿菌培養(yǎng)物的第二濾器在單獨的CBA上或BHIH內(nèi)都不表現(xiàn)出任何生長。3天或以上的IB對于脲酶在30min內(nèi)的試驗呈陽性。
在相差顯微術(shù)中顯現(xiàn)出稠密的球形菌。復染法要過30min才生效。在IB中誘導24h后，球形菌變得松散，并開始擠出新生螺旋細胞。可看到一些新生的螺旋形連在“母體”球形殼上。誘導48h時，這種“出生”過程變得更為明顯。在BHIH誘導下，新螺旋形菌變成成熟的細胞并能活動。在2×BHIH中，螺旋形菌活動性更強。將尿素加入IB和BHIH時，生長作用更為明顯，螺旋形早在24h時就出現(xiàn)了。
從再生的球形菌產(chǎn)生的螺旋形菌完全能存活和具有機能。發(fā)現(xiàn)它們能輕易地同KATO III細胞連接。該過程類似于正常螺旋形對KATO III細胞的病原性侵襲。
討論這些結(jié)果表明，可以將幽門螺桿菌由球形誘導轉(zhuǎn)變?yōu)槁菪巍B中的某因子(“誘導物”)也就必定影響該轉(zhuǎn)變過程。此外，發(fā)現(xiàn)未加尿素時螺旋形菌只是部分地轉(zhuǎn)變/生長。
“誘導物”引發(fā)較厚的球形多糖層內(nèi)新生長出螺旋形。所以，營養(yǎng)物/誘導物顯然可通過該覆蓋層。以前得到的資料表明，在球形內(nèi)脲酶亞單位C和D缺乏或存在量較低。上述資料表明IB中存在脲酶。因此，可總結(jié)得知脲酶的亞單位C和D其實就是“誘導物”。
引入新鮮的BHIH培養(yǎng)基提供了必要的營養(yǎng)物以保證充分轉(zhuǎn)變(否則IB會缺失或者甚至耗盡)。提供尿素的生理含量證實尿素在該有機體的代謝過程中起關(guān)鍵性作用。
將這些發(fā)現(xiàn)外推到活體內(nèi)的情形中，認為該生物體在胃上移生后，在糞便中分泌的螺旋形菌轉(zhuǎn)變?yōu)榍蛐我员ＷC來自體內(nèi)存活。當再引入口腔時，它們在齦下蝕斑微需氧條件下保留在那里。存在產(chǎn)生脲酶的其它細菌或者確有其它來源時，就能誘導轉(zhuǎn)變?yōu)槁菪尉Ｒ坏┻@樣轉(zhuǎn)變時，細菌就移生在口中，并從口腔沿消化道向下遷移而移生在胃中。
因此，通過慣常的抗生素消滅螺旋形菌顯然還不夠。只要使存在的球形菌轉(zhuǎn)變?yōu)槁菪尉涂墒刮覆桶l(fā)。所以關(guān)鍵是要根除螺旋形菌和球形菌二者以防止這種復發(fā)。為此，就必須使存在的任何球形菌轉(zhuǎn)變?yōu)槁菪危@樣抗生素處理就可根除所有的幽門螺桿菌感染。
誘導轉(zhuǎn)變?yōu)槁菪慰梢赃@樣來實現(xiàn)，即添加脲酶、任選和作為另外成分的尿素一起添加。
權(quán)利要求
1.治療哺乳動物幽門螺桿菌感染的方法，該方法包括給哺乳動物施用一種能誘使幽門螺桿菌從球形轉(zhuǎn)變?yōu)槁菪蔚霓D(zhuǎn)變劑。
2.權(quán)利要求1的方法，其中的轉(zhuǎn)變劑不是呈疫苗的形式。
3.權(quán)利要求1或2的方法，它進一步包括給哺乳動物施用有效量的至少一種抗生素的步驟。
4.治療哺乳動物幽門螺桿菌感染的方法，該方法包括至少兩次治療循環(huán)，每次循環(huán)包括(i)給哺乳動物施用一種能誘使幽門螺桿菌從球形轉(zhuǎn)變成螺旋形的轉(zhuǎn)變劑；(ii)給哺乳動物施用有效量的至少一種抗生素。
5.治療哺乳動物幽門螺桿菌感染的方法，該方法包括給哺乳動物施用一種能防止幽門螺桿菌從螺旋形轉(zhuǎn)變?yōu)榍蛐蔚霓D(zhuǎn)變劑。
6.權(quán)利要求1至5中任一項的方法，其中轉(zhuǎn)變劑是脲酶。
7.權(quán)利要求6的方法，其中的脲酶是非細菌脲酶。
8.權(quán)利要求7的方法，其中的非細菌脲酶是刀豆脲酶。
9.權(quán)利要求6至8中任一項的方法，其中只施用脲酶的C亞單位和D亞單位。
10.權(quán)利要求6至9中任一項的方法，其中還給哺乳動物施用尿素。
11.治療哺乳動物幽門螺桿菌感染的方法，該方法包括一次或多次治療循環(huán)，每次治療循環(huán)包括(i)給哺乳動物施用一種能誘使幽門螺桿菌從球形轉(zhuǎn)變?yōu)槁菪蔚霓D(zhuǎn)變劑；和(ii)給哺乳動物施用一種能誘使幽門螺桿菌從螺旋形轉(zhuǎn)變?yōu)榍蛐蔚霓D(zhuǎn)變劑。
12.權(quán)利要求11的方法，其中步驟(i)中的轉(zhuǎn)變劑是脲酶。
13.權(quán)利要求12的方法，該方法被權(quán)利要求7至9中任一項或多項的任一個或多個特征修飾。
14.權(quán)利要求12或13的方法，其中將尿素與脲酶一起施用。
15.權(quán)利要求12至14中任一項的方法，其中步驟(ii)中的轉(zhuǎn)變劑是“抗脲酶”。
16.權(quán)利要求15的方法，其中的“抗脲酶”是脲酶抑制劑。
17.治療哺乳動物幽門螺桿菌感染的方法，該方法包括給哺乳動物施用一種能改變胃中pH的轉(zhuǎn)變劑。
18.權(quán)利要求1至17中任一項的方法，其中的哺乳動物是人。
19.一種藥物制劑，它包括一種能誘使幽門螺桿菌從球形轉(zhuǎn)變?yōu)槁菪蔚霓D(zhuǎn)變劑，以及一種或多種藥物上可接受的載體和/或賦形劑。
20.權(quán)利要求19的藥物制劑，其中的轉(zhuǎn)變劑是脲酶。
21.權(quán)利要求19或20的藥物制劑，它不是疫苗。
22.權(quán)利要求19至21中任一項的藥物制劑，它被權(quán)利要求7至9中任一項的任一個或多個特征修飾。
23.權(quán)利要求20至22中任一項的藥物制劑，它還包括尿素。
24.一種能誘使幽門螺桿菌從球形轉(zhuǎn)變成螺旋形的轉(zhuǎn)變劑在制備用于治療幽門螺桿菌感染的藥劑中的應用。
25.權(quán)利要求24的應用，其中的轉(zhuǎn)變劑是脲酶。
26.權(quán)利要求24或25的應用，其中的轉(zhuǎn)變劑不是疫苗。
27.權(quán)利要求25的應用，它被權(quán)利要求7至9中任一項或多項的任一個或多個特征修飾。
28.權(quán)利要求25至27中任一項的應用，其中的藥劑還包括尿素。
29.將培養(yǎng)物中幽門螺桿菌從球形轉(zhuǎn)變成螺旋形的方法，它包括向球形培養(yǎng)物中添加一種能誘使幽門螺桿菌從球形轉(zhuǎn)變?yōu)槁菪蔚霓D(zhuǎn)變劑。
30.權(quán)利要求29的方法，其中的轉(zhuǎn)變劑以生長有螺旋形幽門螺桿菌但已從中除去了螺旋形幽門螺桿菌的培養(yǎng)基形式提供。
31.權(quán)利要求30的方法，其中螺旋形幽門螺桿菌已在培養(yǎng)液中至少生長了3天。
32.權(quán)利要求29至31中任一項的方法，其中的轉(zhuǎn)變劑是脲酶。
33.權(quán)利要求32的方法，它被權(quán)利要求7至9中任一項的任一個或多個特征修飾。
34.將培養(yǎng)物中幽門螺桿菌從螺旋形轉(zhuǎn)變成球形的方法，它包括向螺旋形培養(yǎng)物中添加一種能誘使幽門螺桿菌從螺旋形轉(zhuǎn)變成球形的轉(zhuǎn)變劑。
35.權(quán)利要求34的方法，其中的轉(zhuǎn)變劑是“抗脲酶”。
36.權(quán)利要求35的方法，其中的“抗脲酶”是脲酶抑制劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了治療幽門螺桿菌(H.pylori)感染的新療法,和用于這類方法中的藥物制劑。
文檔編號A61K38/46GK1201395SQ96198128
公開日1998年12月9日 申請日期1996年10月8日 優(yōu)先權(quán)日1995年10月9日
發(fā)明者胡淼 申請人:科泰克斯國際有限公司