專利名稱：microRNA-1的反義鎖核苷酸序列在制備預防或治療心肌梗死后心衰藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種核酸類物質在制備預防或治療疾病藥物中的應用，特別涉及 microRNA-1的反義鎖核苷酸序列在制備預防或治療心肌梗死后心衰藥物中的應用，本發明屬于生物醫藥領域。
背景技術：
心衰是心肌梗死后發生猝死的重要原因。心臟疾病發病機制錯綜復雜，每一種發病機制可導致一種或多種疾病的表現形式，而多種疾病的表現形式可能由單一發病機制所導致，這給此類疾病的預防和治療帶來難度。因此目前為止針對單一靶點的藥物治療，尚不能達到讓人滿意的效果。隨著近來microRNAs研究的興起，這種內源性的非編碼小RNAs已經作為一個基因表達調控的關鍵因子參與許多重要的生理過程。由于單一的microRNA可負向調控多個基因mRNA的表達，使得以關鍵microRNA為靶點的藥物可通過調節多個參與心臟疾病發生的基因的表達，從而給心臟疾病的防治帶來新的希望，因此發現不同病理生理情況下起關鍵調節作用的microRNA亞型變化，并闡明其功能，將會對該疾病的治療帶來新的靶標和產生新的干預策略。已有研究表明microRNA-Ι作為在肌肉中特異表達的微小 RNA，在心肌梗死患者和冠脈結扎的心肌組織中高表達。并證明其通過作用于鉀通道蛋白和心肌Cx43參與了心梗后惡性心律失常的發生。也有研究表明microRNA-Ι在胚胎期可以影響心肌細胞的發育和分化。然而，microRNA-Ι是否參與了心梗后心衰的發生和發展過程， 仍未見報道。因此，本發明采用多種技術手段證明microRNA-Ι在心衰發生發展中的作用， 并采用最新的鎖核苷技術研究microRNA-Ι對心衰發生和發展的防治作用，最終確定檢測外周血液(全血，血漿，血清)microRNA-Ι是否可以作為一種新的生物標志物預測心梗后心衰的發生。

發明內容
為了解決上述技術問題，本發明采用多種技術手段證明了 microRNA-Ι在心衰發生和發展中的作用，并將其作為一種新型的藥物作用靶點，以及生物標志物，應用于預防或治療由心肌梗死導致的心衰的治療。本發明所要解決的技術問題是通過以下技術手段實現的本發明通過研究發現micr0RNA-l在心梗患者外周血液水平與心臟功能呈負相關，并且發現microRNA-1 (5，-UAUGUAUGAAGAAAUGUAAGGU-3，)過表達小鼠出現心臟功能的下降。在此基礎上，結合具體實驗，發現了 microRNA-Ι的反義鎖核苷酸LNA-I (LNA 5，-ATACATACTTCT TTACATTCCA-3，，SEQ ID NO. 1 所示)可以防止心衰的發生。LNA-1 可成為一種預防和治療心肌梗死后心衰的治療。因此，本發明提出了 microRNA-Ι的反義鎖核苷酸在制備預防或治療心肌梗死后心衰藥物中的應用。
microRNA-1的反義鎖核苷酸在制備診斷缺血性心臟病誘發的心衰的試劑中的應用。通過熒光定量PCR，銀染增強的納米微球技術檢測病人外周血液(全血，血漿和血清)中microRNA-1的表達水平，用于對缺血性心臟病誘發心衰的診斷和預防。在本發明的具體實施例中，所述的microRNA-1的反義鎖核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。利用本發明的microRNA-Ι的反義鎖核苷酸序列制備得到的預防或治療心肌梗死后心衰的藥物，其特征在于有效成分為所述的microRNA-Ι的反義鎖核苷酸序列。制備的藥物可以只含microRNA-1，也可通過制成一種藥物組合物的方式實現，其特征在于包含以上所述的microRNA-Ι的反義鎖核苷酸序列及藥學上可接受的載體；其中，所述的載體為病毒、膽固醇，納米顆粒，殼聚糖，脂質體等，合成HiiR-I并與上述的適當載體連接形成藥物，可制成口服制劑或注射制劑等，通過靜脈或肌肉注射的方式，用于治療和預防心肌梗死后心衰的發生。例如將microRNA-Ι的反義鎖核苷酸序列與膽固醇連接制備相應的藥物，其制備方法可采用首先化學合成microRNA-Ι的反義鎖核苷酸序列，在其尾端連接膽固醇的常規核酸制劑的方法；例如將microRNA-Ι的反義鎖核苷酸序列與納米顆粒連接制備相應的藥物，其制備方法可采用化學合成microRNA-Ι的反義鎖核苷酸序列，將其與適宜的納米顆粒混合， 制成連有microRNA-Ι的反義鎖核苷酸序列的納米顆粒，用于心肌梗死后心衰藥物的制備中。為了增加核酸試劑的使用效果，還可輔以專用的穩定劑和特異性免疫增強劑精制而成。一種用于診斷缺血性心臟病誘發的心衰的試劑，其特征在于包含所述的 microRNA-Ι的反義鎖核苷酸序列。


圖1為心肌梗死患者血漿miR-1水平與心功的相關性分析；MIH 有心梗病史；AMI 初發急性心肌梗死圖2為microRNA-Ι轉基因小鼠心臟microRNA-Ι表達水平變化；圖3為TG小鼠心電和電鏡檢測；圖4為TG小鼠心臟功能評價；
圖5為TG小鼠心臟形態學改變；圖6為心肌收縮相關蛋白在miR-lTG小鼠心臟上的表達；圖7為LNA對TG小鼠心臟功能的影響及分子機制。
具體實施例方式下面通過藥理性及臨床觀察實驗并結合實施例對本發明做進一步說明，應該理解的是，這些實施例僅用于例證的目的，決不限制本發明的保護范圍。實施例ImicroRNA-I在心衰中的作用以及microRNA-Ι心臟過表達TG小鼠模型的
4構建實驗材料C57B/L6小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司1. UmicroRNA-I在心梗患者外周血液水平與心臟功能呈負相關本實驗選取49例心肌梗死患者的血樣，發現在初發急性心肌梗死患者血中 microRNA-1水平與射血分數(EF)、左心室短軸縮短率(FQ和二尖瓣口舒張早期峰值速度 (E)與舒張晚期峰值速度(A)的比值呈負相關，實驗結果如圖IA-H所示。1. 2、microRNA_l心臟過表達TG小鼠模型的構建利用real time PCR檢測TG小鼠各臟器中microRNA-1的表達量，結果顯示與非轉基因小鼠(WT)相比，TG小鼠左心室microRNA-1表達升高了 4倍< 0. 05vs. WT) (圖2A所示)，而骨骼肌未發生改變(圖2B所示。)，說明本發明所構建的轉基因小鼠是心臟特異性的轉基因小鼠。1. 2. UmicroRNA-ITG小鼠進行心臟功能的評價如圖3A所示本發明應用心電監測儀記錄了 12只陽性TG小鼠和12只WT小鼠的心電變化，結果顯示從出生后4個月開始，所有12只陽性TG小鼠均出現P-R間期和QRS波群的增寬。表明TG小鼠出現傳導阻滯。圖;3B電鏡觀察表明心肌組織出現明顯閏盤的溶解， Western檢測進一步證明與同齡的WT小鼠相比較，影響閏盤組織結構的的關鍵蛋白Cx43在 TG小鼠心臟表達明顯下降。隨后本發明采用心臟超生和壓力容積環的方法對TG小鼠的心功進行了評價。如圖4A-I所示與同齡WT小鼠相比較TG小鼠的心臟功能隨年齡的增加而下降。主要表現在 EF%，ESP，士dp/dt，PRSW 禾口 τ 的下降和 EDP、ESV 的下降。1. 2. 2、microRNA-1 TG小鼠心臟形態學評價通過對小鼠正常組、microRNA-lTG小鼠2，4，6個月組的心臟/體重進行比較，發現與同齡WT小鼠比較，6個月TG小鼠表現出心臟/體重的增大(圖5A&B)。HE染色觀察并未發現心肌細胞的肥大(圖5C&D)。電子顯微鏡觀察發現2，4，6個月TG小鼠均表現出明顯的肌肉收縮不規則，進一步的定量分析發現TG小鼠肌節長度呈現長短不一的現象(圖5E， F&G)。圖5E亦顯示6各月TG小鼠心肌組織出現明顯的壞死樣變化。1. 2. 3、microRNA-1 TG小鼠心肌相關蛋白MLC2v和CaM表達下降實驗采用Wfestern blot的方法發現microRNA-lTG小鼠心肌收縮相關蛋白MLC2v、 cMyBP-C和CaMKII的磷酸化水平降低(圖6A、B、E)。進一步研究發現是由于cMLCK和CaM 表達下降引起的(圖6C、D、F和G)。實施例2microRNA-l反義鎖核苷酸(LNA)的合成以及LNA對microRNA-lTG小鼠心臟功能和蛋白的影響2. UmicroRNA-I反義鎖核苷酸(LNA)的合成采用基因全序列合成的方法合成microRNA-Ι反義鎖核苷酸(LNA)序列，所合成的序列如下所示LNA :5，-ATACATACTTCT TTACATTCCA-3，(SEQ ID NO. 1 所示)。 2.2、LNA-對microRNA-1 TG小鼠心臟功能和蛋白的影響
將LNA用PBS配置成濃度為0. 4mg/ml的液體，采用在體microRNA-Ι反義鎖核苷酸序列(LNA)尾靜脈注射的方法將所合成的反義鎖核苷酸序列注射入TG小鼠體內。尾靜脈注射:3mg/kg/次，每隔一周注射一次，共注射3次。在末次注射一周后進行各項指標的檢測。結果發現，MiR-I-LNA不僅可以逆轉TG小鼠的心臟功能，還能阻止心肌重構的進一步發展(圖7A-D所示)。這一結果是由于LNA解除了 miR-1對心肌收縮蛋白cMLCK和CaM的抑制作用(圖7E-K所示)。 以上所述僅為本發明的優選實施例，對本發明而言僅是說明性的，而非限制性的； 本領域普通技術人員理解，在本發明權利要求所限定的精神和范圍內可對其進行許多改變，修改，甚至等效變更，但都將落入本發明的保護范圍內。
權利要求
1.microRNA-1的反義鎖核苷酸在制備治療或預防心肌梗死后心衰藥物中的應用。
2.microRNA-1的反義鎖核苷酸在制備診斷缺血性心臟病誘發的心衰的試劑中的應用。
3.如權利要求1或2所述的應用，其特征在于所述的microRNA-Ι的反義鎖核苷酸序列如 SEQ ID NO. 1 所示。
4.一種用于治療或預防心肌梗死后心衰的藥物組合物，其特征在于有效成分為權利要求1或3所述的microRNA-Ι的反義鎖核苷酸序列。
5.如權利要求4所述的藥物組合物，其特征在于所述的藥物組合物中還進一步包括藥學上接受的載體，所述的載體為病毒、膽固醇、納米顆粒、殼聚糖或脂質體。
6.如權利要求4或5所述的藥物組合物，其特征在于所述的藥物組合物為口服制劑或注射制劑。
7.一種用于診斷缺血性心臟病誘發的心衰的試劑，其特征在于包含權利要求2或3所述的microRNA-Ι的反義鎖核苷酸序列。
全文摘要
本發明公開了microRNA-1的反義鎖核苷酸在制備預防和治療心肌梗死后心衰藥物中的應用。制備的藥物可以只含microRNA-1的反義鎖核苷酸序列，也可制成一種藥物組合物，其特征在于包含有效劑量的microRNA-1的反義鎖核苷酸序列及藥學上可接受的載體；其中，所述的載體可為病毒、膽固醇，納米顆粒，殼聚糖，脂質體等，合成microRNA-1的反義鎖核苷酸序列并與上述的適當載體連接形成藥物，可制成注射制劑，通過靜脈或肌肉注射的方式，用于治療心肌梗死后心衰的發生。
文檔編號A61P9/04GK102416184SQ201110405299
公開日2012年4月18日 申請日期2011年12月8日 優先權日2011年12月8日
發明者呂延杰, 楊寶峰, 艾靜 申請人:哈爾濱醫科大學