專利名稱：化合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及新穎的光敏劑和它們在分子的光化學內在化和光動力學療法中的用途。
本領域已知有許多光敏劑。在暴露于光之后，它們可能變成有毒的或者可能釋放毒性物質，例如單態氧或其他氧化基團，它們損害細胞物質或生物分子，包括細胞膜和細胞結構，而這類細胞或膜損害可能最終殺死細胞。這些細胞毒性效果已經用于治療多種異常或疾病，包括腫瘤疾病。這類治療被稱為光動力學療法(PDT)，牽涉將光敏劑(光化學治療劑)用于肌體受影響的區域，繼之以暴露于活化光來活化光敏劑和使它們轉化為細胞毒性形式，借此殺死受影響的細胞或者減少它們的增殖潛力。
最近，光動力學效應已經被提議作為一種向胞質引入別的膜不透性分子的工具，以這樣一種方式使之未必導致細胞破壞或死亡。在這種被稱為″光化學內在化″或PCI的方法中，將所要內在化或者轉移的分子與感光劑聯合施用于細胞。細胞暴露于適當波長的光，活化感光化合物，該化合物繼而引起胞內分隔膜的破裂和隨后分子釋放至胞質。
光敏劑可以通過多種機理直接或間接地發揮它們的作用。因而例如，某些光敏劑當被光活化時直接變成有毒的，而其它生成一種毒性物，例如氧化劑如單態氧或氧-衍生的自由基，它們對細胞物質和生物分子例如脂質、蛋白質和核酸是極其有害的。
已知的光敏劑例如包括補骨脂素、卟啉、二氫卟酚和酞菁染料。卟啉光敏劑通過一種毒性氧的生成間接地起作用，被認為是PDT的特別有利的候選者。卟啉是天然存在的合成血紅素的前體。特別是，當鐵(Fe2+)在亞鐵螯合酶的作用下結合在原卟啉IX(PpIX)中時，產生血紅素。PpIX是極強的光敏劑，而血紅素沒有感光作用。
本領域已知有多種以卟啉為基礎的或者與卟啉有關的光敏劑，在文獻中有所描述。這類試劑的實例包括Photofrin，它們最近被批準用作光敏劑，治療某些癌癥。不過，由于Photofrin必須是腸胃外給藥的(例如靜脈內)，其缺點是這會導致延長皮膚的光敏作用，可以持續幾個星期。由于Photofrin由卟啉的大寡聚體組成，當局部施用時它也不容易穿透皮膚。其他以卟啉為基礎的光敏劑也存在相似的問題，例如所謂的″血卟啉衍生物″(HpD)，它們也有報道用在癌癥光化學療法中。
最近，磺化的中-四苯基卟啉(TPPSn)，例如二磺化的中-四苯基卟吩TPPS2a和TPPS2o，和四磺化的中-四苯基卟吩TPPS4，已被研究用作感光劑，已經發現其相對于HpD和Photofrin而言具備一些重要的優點。特別是它們的腫瘤正常組織比高，因此考慮用在光化學療法中(Peng et al.，Cancer Lett.361-10，1987；Evensen et al.，Photodynamic therapy of tumorsand other diseases(Ed.G.Jori and C.Perria)，p.215-219，Libreria ProngettoPubl.Padova；and Winkelman，Cancer Res.22589-596，1962)。TPPS2a最近也被發現適合于用作高分子光化學內在化的光敏劑(Berg et al.，CancerRes.591180-1183，1999；Hgset et al.，Hum.Gene Ther.11869-880，2000；and Selbo et al.，Int.J.Cancer 87853-859，2000)。
不過，在臨床使用TPPS2a中的主要缺點是它的紅光吸收低。事實上，所有已知卟啉衍生物的臨床應用的主要限制是它們所響應的光的最長波長具有相對低的吸收，位于約620-630nm。在這樣的波長下，光僅能穿透活組織內很短的距離，所以不能到達深部的細胞或組織，例如腫瘤細胞。因此需要找到可供替代的四吡咯化合物，它們仍然具備已知以卟啉為基礎的光敏劑的有利性質，還在更長的波長下表現更高的吸收，在那里組織的穿透性更大。
本發明致力于滿足這種需求，特別是致力于提供光敏效果強于現有技術所述以卟啉為基礎的化合物的試劑。
現已發現，磺化的中-四苯基卟啉(例如二磺化的中-四苯基卟啉)的卟啉大環中一個雙鍵的還原所得化合物驚人地具有高的光敏性質。特別是與對應的卟啉相比，這類化合物具有高的光譜性質，還已經發現對暴露于紅光的消光系數表現出意外的增加，例如對波長范圍在630至680nm的光。這類化合物因而被視為不僅特別適合于常規的光動力學療法，而且特別適合用于大分子的光化學內在化方法。
從一方面來看，本發明因而提供一種光敏劑，它包含磺化的中-四苯基二氫卟酚，例如二磺化的中-四苯基二氫卟酚，或其藥學上可接受的鹽。在這類化合物中，至少一個四苯基環通常將攜帶1、2或3個、優選1個磺酸酯基。本發明優選的化合物包括其中兩個苯基環各自被單一磺酸酯基取代的那些。
從另一方面來看，本發明提供一種光敏劑，可通過還原磺化的中-四苯基卟啉的卟啉大環中一個雙鍵而得，特別是可通過還原二磺化的中-四苯基卟啉的卟啉大環例如TPPS2a中一個雙鍵而得。這類化合物的藥學上可接受的鹽構成本發明的另一方面。
根據本發明的光敏劑的實例包括式I化合物 (其中X是-SO3H；n、p、q和r各自獨立地是0或1；和n、p、q和r之和是1至4的整數，優選為至少2，例如2或4)和其藥學上可接受的鹽。
式I化合物的異構形式也被視為構成本發明的一部分，例如其中被還原的雙鍵位于任意其余三個吡咯環之一。任何包含至少一種式I化合物或其異構體的異構體混合物都被視為構成本發明的一部分。特別適合用在本發明中的式I化合物異構體的實例包括下列式Ia-Ic化合物
(其中X、n、p、q和r是如上所定義的)。
式I、Ia、Ib和Ic化合物中，任一n、p、q和r之一是1，這意味著存在單一的磺酸酯基與苯基環連接在任意的環位置(也就是鄰-、間-或對-)。在存在一個以上磺酸酯基的情況下，它們可以存在于每個苯基環內相同或不同的環位置。優選地，它們將存在于相同的環位置，最優選為間位或對位。若任一n、p、q和r是零，則這意味著不存在任何環取代基，也就是未取代的苯基。
特別優選的式I、Ia、Ib和Ic化合物是其中n、p、q和r之和是2的那些。最優選這樣的化合物，其中取代的苯基環是彼此相鄰的，例如與還原的吡咯環相鄰，也就是式I化合物中n＝0、p＝0、q＝1和r＝1。另外優選的式I、Ia、Ib和Ic化合物包括，其中n、p、q和r之和是2，并且取代的苯基環是彼此相對的那些，例如其中n＝0、p＝1、q＝0和r＝1的式I化合物。
在每個苯基環中，磺化的基團X可以獨立地存在于鄰位、間位或對位。它將優選地存在于間位或對位，最優選對位。按照本發明優選的化合物包括式II化合物 式II化合物的異構形式也被視為構成本發明的一部分，例如其中被還原的雙鍵位于其余三個吡咯環的任一個。包含至少一種式II化合物或其異構體的任何異構體混合物都被視為構成本發明的一部分。
特別優選的式II化合物是，其中兩個取代的苯基環與被還原的雙鍵相鄰。
本發明的化合物可以利用本領域熟知的標準方法和工藝加以制備。最適宜地，可以借助對應的卟啉的還原作用加以制備。
本發明在進一步的方面因而提供制備本發明化合物的方法，所述方法包含至少一個下列步驟(a)還原磺化的四苯基卟啉或其鐵螯合物，例如還原式III四苯基卟啉
或其鐵螯合物(其中X、n、p、q和r是如上所定義的)；(b)如果需要的話，借助常規的分離技術分離步驟(a)所生成的化合物的混合物；和(c)轉化步驟(a)或步驟(b)所生成的化合物、例如式I化合物為其藥學上可接受的鹽。
步驟(a)中，用作原料的卟啉化合物是商業上可得到的，或者可以利用本領域已知的方法獲得。磺化的卟啉、例如包括TPPS2a(二磺化的四苯基卟吩)，是可從Porphyrin Products，Logan，UT，USA得到的。
步驟(a)中式III卟啉化合物向對應的二氫卟酚的化學轉化是可以按若干不同的方式在化學上實現，例如使用對-甲苯磺酰肼在游離堿卟啉的還原中作為二酰亞胺前體(例如參見Whitlock et a1.，J.Am.Chem.Soc.917485-7489，1969)。作為替代選擇，所需二氫卟酚的制備可以這樣進行，例如使用鈉在沸騰的異戊醇中還原對應的鐵-卟啉(Eisner，J.Chem.Soc.3461-3469，1957；and Eisner et al.，J.Chem.Soc.733-739，1957)。
特別優選用在本發明化合物制備中的是卟啉的光化學還原，可任選在叔胺堿的存在下進行。例如，在胺的存在下，尤其是叔胺，游離堿卟啉可以被光還原為二氫卟酚(例如參見Harel et al.Photochem.Photobiol.23337-341，1976)。
在二酰亞胺的存在下還原卟啉分子可以通過還原卟啉大環中的兩個雙鍵而誘導菌綠素的生成。使用一種胺、特別優選叔胺的光還原過程因此優選用在本發明所需二氫卟酚化合物的制備中。適合用在這樣一種方法中的叔胺的實例包括三乙胺(TEA)、N-甲基吡咯烷酮、三正丁胺、三辛胺等，還原作用一般將在可見光的存在下進行(例如光還原作用)。
卟啉的光化學還原可以這樣適當地進行，在溶劑或溶劑混合物中，例如苯、吡啶、二甲基亞砜等，在10至30℃范圍的溫度下，優選在環境溫度下(例如20至25℃，尤其是22℃)進行還原。
光還原作用可以利用可見范圍的光進行，例如波長在400至640nm的范圍內，優選500至640nm，例如約545±15nm。照射的劑量水平一般適用1至50W/m2，例如約15W/m2，時間在1至90分鐘的范圍內，例如5至40分鐘。通過限制卟啉大環暴露于光的時間，可以減少任何不需要的菌綠素的生成。卟啉的照射方法是本領域熟知的，例如利用燈或激光。在這一點上特別適合的是高壓氙燈或碘鎢燈，例如可從Philips得到的那些。通常，反應是在厭氧條件下進行的，例如可以在暴露于光之前并任選地在暴露于光期間將原料與溶劑的混合物用氮飽和。
本發明的化合物可以以異構體混合物的形式存在，并且可以以這種形式使用。如果需要的話，可以借助本領域已知的方法，例如色譜法和/或分級結晶法，根據它們的物理/化學差異，將本發明的化合物例如式I那些分離為它們的異構體。
如上所述，本發明的化合物可以采取藥學上可接受的鹽的形式。這類鹽優選地是與生理學上可接受的有機或無機酸所生成的酸加成鹽。適合的酸例如包括鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸、乙酸、乳酸、枸櫞酸、酒石酸、琥珀酸、馬來酸、富馬酸和抗壞血酸。例如借助沉淀法，還可以適宜地制備疏水性鹽。適當的鹽例如包括乙酸鹽、溴化物、氯化物、枸櫞酸鹽、鹽酸鹽、馬來酸鹽、甲磺酸鹽、硝酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽、酒石酸鹽、油酸鹽、硬脂酸鹽、甲苯磺酸鹽、鈣鹽、葡甲胺鹽、鉀鹽和鈉鹽。成鹽工藝是本領域的常規技術。
如上所述，本發明的化合物和它們的鹽具有寶貴的藥理性質，也就是光敏性質，這使它們可用于大分子的光化學內在化和用作光化學治療劑。
本發明在進一方面因而提供藥物組合物，包含本文所述光敏劑、例如式I化合物或其藥學上可接受的鹽，以及至少一種藥物載體或賦形劑。
本發明在進一方面提供用作藥物的本文所述光敏劑、例如式I化合物或其藥學上可接受的鹽，例如在光化學內在化方法、光化學療法或診斷中用作光敏劑。
進一方面提供本文所述光敏劑、例如式I化合物或其藥學上可接受的鹽在治療劑制備中的用途，該治療劑用在光化學內在化方法、光化學療法或診斷中，特別是用在治療響應于光化學療法的肌體外或內表面的疾病或異常的方法中。
本文所用的“內在化”表示分子的胞質釋放，包括分子從細胞內/膜結合的腔室向細胞的胞質內釋放的步驟。術語“細胞”在本文中用以包括所有真核細胞(包括昆蟲細胞和真菌細胞)。代表性的“細胞”因而包括所有類型的哺乳動物與非哺乳動物細胞、植物細胞、昆蟲細胞、真菌細胞和原生動物。
向活細胞質內引入分子的方法是有用的工具，可用于操縱和研究生物過程。令人感興趣的是這樣的方法，其中在內在化之后細胞仍然是活的和/或有功能的。有人已經提出光敏劑在以這樣一種方式向細胞質內引入其他膜不透性分子中的用途，而不必導致廣泛的細胞破壞或細胞死亡，例如WO96/07432和WO00/54802。在這種方法中，向細胞同時或者先后施用所要內在化的分子和光敏化合物，此后，該光敏化合物和該分子被細胞吞入或者以其他方式被易位于核內體、溶酶體或其他細胞內受膜限制的腔室。所要易位于細胞內腔室的分子和光敏化合物一起或先后施用于細胞，被細胞攝入細胞內腔室。細胞暴露于適合波長的光后釋放細胞內被內在化的分子，活化光敏化合物，繼而引起細胞內腔室膜的破壞，和隨后分子向胞質的釋放。這種方法被稱為“光化學內在化”或PCI，其中細胞在暴露于光后借助光敏劑的作用從含有有關分子的細胞內腔室釋放該分子。
因而本發明在進一方面提供體外或體內向細胞質內引入分子(也就是轉移分子)的方法，所述方法包含使所述細胞與本文所述光敏劑，例如式I化合物，或其藥學上可接受的鹽接觸；使所述細胞與所要引入的分子接觸；以及將所述細胞用活化該光敏劑有效的波長的光進行照射，例如波長在300-800nm范圍內的光。
精確計時加入所要轉移的分子(也就是轉移分子)和光敏劑的時間和達到上述效果的照射時間需要考慮多種因素，包括所要處理的細胞、轉移分子的屬性、細胞的環境、該方法是體外還是體內進行的、和給藥是直接到靶組織還是到遠程部位。考慮這些因素，本領域技術人員容易確定適當的時機。通常，將在照射之前加入轉移分子和光敏劑。例如，照射之前1至72小時，優選4至48小時，例如照射之前4至24小時，可以將它們同時或單獨施用。
在某些情況下，轉移分子將與光敏劑同時給藥。因而本發明在進一方面提供一種藥物組合物，包含本文所述光敏劑與轉移分子一起。還可以另外含有藥學上可接受的載體或賦形劑。
本發明在進一方面提供用在治療中的藥物組合物，包含本文所述光敏劑與轉移分子一起，例如用在癌癥或基因療法中。
本發明在進一方面提供本文所述光敏劑和/或轉移分子在藥物制備中的用途，該藥物用在治療中，例如癌癥或基因治療，其中使所述光敏劑和所述轉移分子(單獨、同時或先后)與患者的細胞或組織接觸，將所述細胞或組織用波長有效活化所述光敏劑的光照射。包含這類方法的治療方法構成本發明的進一方面。
本發明的光敏劑因而可以用于體外(也就是在培養物中)或體內轉運或者轉染到任何分子至活細胞的胞質內。它們不僅可以用于轉移分子(或其部分或片段)至細胞內部，而且在某些情形中用于在細胞表面上呈遞或者表達它們。因而，在轉移分子向細胞質的轉運和釋放之后，如果有關細胞是特異化細胞，例如抗原呈遞細胞，那么該分子或片段可以轉運至該細胞表面，在那里它可以被呈遞在細胞外部，也就是細胞表面上。這類方法在疫苗接種領域具有特別的實用性，其中可以向細胞內引入疫苗組分，也就是抗原或免疫原，用于呈遞在該細胞的表面上，目的是誘導、促進或增加免疫應答。WO00/54802描述了關于能夠在細胞表面上表達分子的實用性的進一步細節。
可以利用本發明光敏劑而引入到細胞質內的轉移分子包括不易穿透細胞膜的分子。另外，本文所述的試劑能夠增加僅能部分穿透細胞膜或胞吞小泡膜的分子的胞質釋放和活性。轉移分子可以是有機化合物、蛋白質或蛋白質片段，例如肽、抗體或抗原或者它們的片段。另一類可以利用本發明試劑引入的轉移分子是細胞毒性藥物，例如蛋白質毒素或細胞毒性有機化合物。利用本文所述的方法，能夠將可能具有臨床癌癥治療價值但是受胞質攝取低或者沒有攝取而限制分子引入到胞質內，并且定向于特定細胞。核糖體失活蛋白是這樣一種分子的實例。
根據轉移分子的屬性，本文所述的方法可以用于治療多種病癥，例如類風濕性關節炎、動脈粥樣硬化與其他心血管疾病、病毒與其他感染、牛皮癬、光化性角化病、傷口愈合、骨折愈合、疣和遺傳性病癥，例如囊性纖維變性、戈林氏綜合征和運動失調性毛細血管擴張癥。
另一類適當的轉移分子是核酸。可以使用核酸的基因形式，例如編碼治療性蛋白質、反義RNA分子、核酶、RNA適體或構成寡核苷酸的三鏈體。或者，可以采用非編碼分子形式的核酸，例如合成的DNA或RNA反義分子、核酶、適體、構成寡核苷酸的三鏈體、肽核酸(PNA)、轉錄因子“decoy”DNA或嵌合寡核苷酸，用于修復患者的特異性突變。在適當時核酸分子可以是全基因或核酸片段的形式，可選地摻入到載體分子中，例如質粒載體。后者的形式在轉移分子用在基因療法中時具有特別的應用性，其中基因被治療性地轉移至患者細胞。這可以用于治療很多疾病，例如癌癥、心血管疾病、病毒感染和單基因病癥，例如囊性纖維變性。
任選地可以將光敏劑和轉移分子之一或二者連接于或締合于或共軛于載體分子、定向分子或載體，這能夠促進或增加光敏劑或轉移分子的攝取或者能夠定向或釋放這些實體至特定的細胞類型、組織或細胞內腔室。載體系統的實例包括聚賴氨酸或其他聚陽離子、硫酸葡聚糖、不同的陽離子型脂質、脂質體、再生的LDL-粒子或空間穩定化的脂質體。這些載體系統一般能夠改善轉移分子和/或光敏劑的藥動學并增加細胞攝取，還可以定向轉移分子和/或光敏劑于細胞內腔室，這尤其有益于獲得光化學內在化，但是它們一般不具有定向轉移分子和/或光敏劑于特定細胞(例如癌癥細胞)或組織的能力。不過，為了實現這類特異性或選擇性定向載體分子，可以將轉移分子和/或光敏劑締合于、鍵合于或共軛于特異性定向分子，這將促進轉移分子向所需細胞或組織內的特異性細胞攝取。這類定向分子還可以定向將分子轉移至細胞內腔室，這尤其有益于獲得光化學內在化。
可以采用很多不同的定向分子，例如Curiel，D.T.(1999)，Ann.NewYork Acad.Sci.886，158-171；Bilbao，G.et al.(1998)，in Gene Therapy ofCancer(Walden et al.，eds.，Plenum Press，New York)，Peng K.W.andRussell S.J.(1999)，Curr.Opin.Biotechnol.10，454-457，Wickham T.J.(2000)，Gene Ther.7，110-114所述。
可以將載體分子和/或定向分子締合于、鍵合于或共軛于轉移分子、光敏劑或這二者，并且可以使用相同或不同的載體或定向分子。這類定向分子或載體還可以用于使轉移分子定向于特定的細胞內腔室，這尤其有益于采用PCI例如溶酶體或核內體。
如上所述，根據本發明的光敏劑還可以用在光動力學療法、特定的光化學療法或診斷中。這類方法在專利和科技文獻中都有詳盡記載，例如WO96/28412和98/30242。
當在PDT中使用光敏劑時，可以治療的疾病和異常包括任何對光化學療法有反應的惡性、惡性前與非惡性的疾病或異常，例如腫瘤或其他生長，皮膚疾病，例如牛皮癬和光化性角化病與痤瘡、皮膚磨損，和其他疾病或感染，例如細菌、病毒或真菌感染，例如皰疹病毒感染。
可以利用本發明化合物治療的內部與外部肌體表面包括皮膚和所有其他上皮與漿膜表面，例如包括粘膜、器官(例如呼吸道、胃腸道和生殖泌尿道)的內襯和帶有向這類表面排空的導管的腺體(例如肝、毛囊與皮脂腺、乳腺、唾液腺和精囊)。除了皮膚以外，這類表面例如包括陰道、子宮內膜和泌尿道上皮的內襯。這類表面還可以包括在切除患病或癌性組織之后(例如在腫瘤切除后的腦腔如神經膠質瘤)所形成的體腔。
示范性表面因而包括(i)皮膚和結膜；(ii)口腔、咽、食管、胃、腸與腸附件、直腸和肛管的內襯；(iii)鼻通道、鼻竇、鼻咽、氣管、支氣管和細支氣管的內襯；(iv)輸尿管、膀胱和尿道的內襯；(v)陰道、子宮頸和子宮的內襯；(vi)胸膜壁層和胸膜臟層；(vii)腹膜和盆腔的內襯，和這些腔內所含有的器官的表面；(viii)硬腦脊膜和腦脊膜；(ix)光活化光能夠接近的實體組織中的任何腫瘤，例如在手術時直接方式或者經由通過針頭插入的光導纖維。
按照本領域熟知的技術，可以利用一種或多種生理學上可接受的載體或賦形劑按常規方式配制本發明的組合物。可以根據給藥的選擇與所需途徑、治療目的等按慣用方式選擇組合物與載體或賦形劑材料的屬性、劑量等。劑量同樣可以按慣用方式加以確定，并且可以依賴于轉移分子(若存在的話)的屬性、治療的目的、患者的年齡、給藥的方式等。
組合物可以被局部、口服或全身給藥。就在PDT中的用途而言，局部給藥的組合物是優選的，該組合物包括凝膠劑、霜劑、軟膏劑、噴霧劑、洗劑、油膏劑、藥棒、藥皂、粉劑、陰道環、氣霧劑、滴劑、溶液劑和本領域任何其他常規的藥物劑型。對不可接近部位的局部給藥可以借助本領域已知的技術加以實現，例如利用導管或其他適當的藥物釋放系統。
或者，組合物可以做成適合于口服或腸胃外給藥的形式，例如皮內、皮下、腹膜內或靜脈內注射。另外一些藥物劑型因而包括普通或包衣片劑、膠囊劑、混懸劑和溶液劑，其中含有活性組分，可選地與一種或多種惰性常規載體和/或稀釋劑一起。
如上所述化合物在組合物中的濃度依賴于化合物的預期用途、組合物的屬性、給藥的方式、所要治療的病癥和患者，可以根據選擇加以改變或調整。不過一般就在PDT中的用途而言，光敏劑的濃度范圍可以在0.01至50％的范圍內，例如0.05至20％，例如1-10％，按重量計。就在PCI中的用途而言，重要的是光敏劑的濃度是這樣的，一旦被細胞攝取，例如進入或者締合于一個或多個細胞內腔室，并且被照射活化，則一個或多個細胞結構被破壞，例如一個或多個細胞內腔室被溶解或破壞。例如，可以按10至50μg/ml的濃度使用光敏劑。就體外使用而言，該范圍可以更寬得多，例如0.05-500μg/ml。就人體內用而言，當全身給藥時，可以在0.05-20mg/kg體重的范圍內使用光敏劑，或者用于局部用藥使用0.1-20％的溶液。當在PCI中使用本文所述化合物時，用光敏劑培育細胞的時間(也就是“接觸”時間)可以從幾分鐘至若干小時不等，例如甚至長達48小時或更長。培育時間應當是這樣的，以便光敏劑被適當的細胞攝取。用光敏劑培育細胞可以任選地繼之以用無光敏劑培養基培育一段時間，然后使細胞暴露于光和/或加入轉移分子。
確定本發明用的靶分子的合適劑量對本領域技術人員來說是常規實踐。若轉移分子是蛋白質或肽，就體外應用而言，一般將使用劑量小于5mg/ml(例如0.1-5mg/ml)的轉移分子，就體內應用而言，一般將使用劑量小于5mg/kg(例如0.1-5mg/kg)的轉移分子。若轉移分子是核酸，就體外應用而言，轉移分子的示范劑量將是大約0.1-50μg核酸每104個細胞，就體內應用而言為大約10-6-1g核酸每次注射于人。
在本文所述化合物或組合物的給藥(例如對肌體表面)之后，使所治療的區域暴露于光，以達到所需效果，例如光化學內在化或光化學治療效果。活化光敏劑的光照射步驟可以按照本領域熟知的技術和工藝加以進行。能夠提供所需波長和光強度適合的光源是本領域熟知的。在本發明的方法中肌體表面或細胞暴露于光的時間可以各不相同。例如，在PCI中，轉移分子內在化至胞質內的效率似乎隨著暴露于光的時間增加而增加。一般而言，照射步驟的時間長度為幾分鐘至若干小時，例如優選至多60分鐘，例如1至30分鐘，例如0.5至3分鐘或1至5分鐘，或者1至10分鐘，例如3至7分鐘，優選大約3分鐘，例如2.5至3.5分鐘。適當的光劑量可以由本領域技術人員加以選擇，將依賴于蓄積在靶細胞或組織中的光敏劑的量。照射一般將按40至200焦耳/cm2的劑量水平施用，例如100焦耳/cm2，能流范圍小于200mW/cm2。在本文所述方法中，用波長在500-750nm、例如550至700nm范圍內的光照射特別適合于體內使用。
本發明在進一步方面因而提供外部或內部肌體表面疾病或異常的治療方法，所述方法包含對受影響的表面給以本文所述光敏劑，例如式I化合物，或其藥學上可接受的鹽，使所述表面暴露于光，優選光的波長范圍為300-800nm，例如500-700nm。
肌體不同部位的照射方法是本領域熟知的，例如用燈或激光(例如參見Van den Bergh，Chemistry in Britain，May 1986 p.430-439)。就不可接近的區域而言，利用光導纖維易于實現。
可以將本發明化合物與其他光敏劑例如ALA或Photofrin，或者可以增強光化學治療效果的其他活性組分一起配制和/或給藥。例如，可以包括螯合劑與如氨基多元羧酸(例如EDTA)，目的是增強Pp的蓄積，從而增加光敏效果。螯合劑適宜按0.05至20％例如0.1至10％按重量計的濃度使用。
還可以使用表面滲透助劑，特別是二烷基亞砜例如二甲基亞砜(DMSO)，以增強光化學治療效果。適宜在0.2至50％例如約10％按重量計的濃度范圍內提供表面滲透劑。
根據所治療的病癥和組合物的屬性，用在本發明中的化合物可以與這類其他任選用的試劑共同給藥，例如在單一的組合物中，或者它們可以先后或單獨給藥。實際上在很多情況下，在用在本發明中的化合物的給藥之前，在單獨的步驟中用表面滲透助劑預處理，可以獲得特別有益的光化學治療效果。
從另一方面來看，本發明因而提供一種產品，包含本文所述光敏劑例如式I化合物，或其藥學上可接受的鹽，以及至少一種表面滲透助劑，任選地和一種或多種螯合劑，作為組合的制劑，同時、單獨或先后用于治療響應于光化學療法的外部或內部肌體表面的疾病或異常。
或者認為，本發明在這方面還提供試劑盒，用在外部或內部肌體表面疾病或異常的光化學療法中，該試劑盒包含
a)第一容器，含有本文所達光敏劑，例如式I化合物，或其藥學上可接受的鹽；b)第二容器，含有至少一種表面滲透助劑；和任選包含c)一種或多種螯合劑，包含在所述第一容器內或第三容器中。
不言而喻，采用本文所述化合物的治療方法不可避免地牽涉所治療疾病或異常的熒光。這種熒光的強度可以用于消除異常的細胞，同時熒光的定位可以用于使該異常或疾病的大小、程度和情形可視化。
如此鑒別或確認在研究部位的異常或疾病然后可以通過另一種的治療技術加以治療，例如手術或化學治療，或者借助本發明的治療方法，繼續構建熒光或者進一步施用本發明化合物于適當的部位。不言而喻，診斷技術可能要求可視化的熒光水平低于治療性處置。因而一般而言，0.2至30％、例如1-5％(w/w)的濃度范圍是適合的。在用于治療之前已經考慮過給藥的部位、方法和方式，也可用于這里所述的診斷用途。
本發明的化合物還可以用于體外診斷技術，例如用于檢查包含在體液中的細胞。與非正常組織有關的熒光更高，可以是異常或疾病的指征。這種方法是非常靈敏的，可以用于清楚地檢測異常或疾病，例如膀胱癌或肺癌，分別檢查尿樣或唾液樣本中的上皮細胞。除了尿和唾液以外，其他可以用于診斷的體液包括血液、精液、淚、脊髓液等。還可以評價組織樣本或制備物，例如活組織檢查的組織或骨髓樣本。本發明因而延及本發明化合物或其鹽按照上述光化學治療方法用于診斷的用途，和用于進行所述診斷的產品和試劑盒。
本發明在另一方面涉及通過測定患者體液或組織樣本來體外診斷異常或疾病的方法，所述方法包含至少下列步驟i)混合所述體液或組織與本文所述光敏劑，例如式I化合物，或其藥學上可接受的鹽，ii)使所述混合物暴露于光，例如波長在300-800nm范圍內的光，iii)確定熒光的水平，和iv)比較熒光水平與對照物水平。
參照附圖，下列非限制性實施例將詳細描述本發明，圖中

圖1顯示在暴露于單色光不同時間階段之前和之后，在三乙胺(TEA)的苯溶液存在下的TPPS2a吸收光譜。
圖2顯示暴露光對TPPS2a的646-655nm峰最大光密度的影響。使含有TPPS2a的溶液在TEA的苯溶液的存在下暴露于單色光，并測量光密度。
圖3顯示TPPS2a暴露于光所生成的衍生物的HPLC色譜分析。使TPPS2a在TEA的苯溶液的存在下暴露于非單色光，借助反相HPLC評價熒光性衍生物的生成。使溶液暴露于光，分離樣本用于測量。
圖4顯示TPCS2a和用TPCS2a處理的V79細胞的細胞提取物的HPLC色譜分析。按照圖3暴光10分鐘后生成TPCS2a，將V79細胞用1μg/mlTPCS2a處理(a)。培育18小時后從細胞中提取TPCS2a，用HPLC評價(b)。峰保留時間標于圖上。
圖5顯示用TPPS2a和TPCS2a處理的V79細胞的熒光顯微圖。將細胞用(a)1μgml TPPS2a或(b)1μg/ml TPCS2a培育18小時，繼之以在無致敏劑培養基中培育1小時，然后進行顯微鏡評價。
圖6顯示V79細胞中β-AGA活性失活的能流-響應曲線，使V79細胞暴露于1μg/ml TPCS2a達18小時，繼之以在無致敏劑培養基中培育1小時，然后暴露于紅光。
圖7顯示用TPPS2a和TPCS2a培育并且暴露于(a)紅光或(b)藍光的V79細胞的劑量-響應曲線。將細胞用1或2μg/ml TPPS2a或1μg/ml TPCS2a培育18小時，繼之以在無致敏劑培養基中培育1小時，然后暴露于光。
圖8顯示V79細胞中在光化學與核糖體失活蛋白聯合處理后的蛋白質合成。在沒有(實心圓)或有(空心圓)1μg/ml核糖體失活蛋白的存在下將細胞用1μg/ml TPCS2a處理，暴露于紅光。本圖和前圖中的線段顯示一式三份進行實驗的標準偏差。
實施例材料和方法材料光敏劑TPPS2a由Porphyrin Products(Logan，UT，USA)提供。將TPPS2a的儲備溶液(2mg/ml)溶于DMSO，DMSO來自Sigma(St.Louis，MO，USA)。核糖體失活蛋白購自Sigma。毒素儲備溶液(2mg/ml)是這樣制備的，將核糖體失活蛋白粉末溶于PBS，pH8.5，保存在-20℃下備用。對-硝基苯基-N-乙酰基-D-氨基葡糖苷購自Sigma(St.Louis，MO，USA)。
四苯基二氫卟酚二磺酸鹽，即TPCS2a，的制備基本上按照Harel等所述方法，從TPPS2a制備四苯基二氫卟酚二磺酸鹽(TPCS2a)(Photochem.Photobiol.23337-341，1976)。
制備950μl苯/三乙胺(TEA)(18∶7)、32μl二甲基亞砜(DMSO)與18μlTPPS2a(來自1mg/ml DMSO溶液)的混合物，并在1ml比色杯中用氮飽和5分鐘。然后使混合物暴露于來自500W高壓氙燈的光，該燈裝有Bauschand Lomb光柵單色儀。使比色杯按15W/m2暴露于545±15nm光。借助UDT 11A光檢測器和223放射濾波器監測能流比率。借助Perkin-ElmerLambda 15UV/VIS分光光度計有規律地測量吸收光譜。光通過路徑為1cm。
為TPCS2a的大規模生產(用于細胞研究)，在蓋有塑料箔的燒瓶內制備混合物，在暴光期間連續用氮沖洗。保持光的路徑小于1cm。使混合物暴露于一組TL’/03燈，在暴露于光期間輕輕地搖動。照射后，將混合物冷凍干燥，溶于DMSO。
細胞培養使用來自中國倉鼠肺成纖維細胞的既定細胞系V79(ATCC CCL-93)的細胞。在37℃下，在用含5％CO2的空氣沖洗的恒溫箱內，使細胞生長在MEM培養基中，其中含有10％胎牛血清(FCS，Gibco，Paisley，UK)、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素(Gibco)。將細胞每周次代培養兩次。
用光敏劑標記將細胞接種在25cm2燒瓶(Nunclon，Denmark)內，其中含有含10％FCS的MEM培養基，在37℃下放置4-5小時，以充分地附著于酶解物。隨后，將細胞用培養基洗滌3次，暴露于含1μg/ml TPPS2a或TPCS2a的含血清培養基達18小時。隨后將細胞用無致敏劑培養基洗滌3次，在暴露于光之前培育1小時。然后使細胞暴露于通過Cinemoid 35濾波器過濾的紅光(Phillips TL 20 W/09)或藍光(Appl.Photophysics，Nood.3026，London)。來自紅燈和藍燈到達細胞的能流比率分別為1.35mW/cm2和1.5mW/cm2。
毒性測定借助集落生成試驗測量細胞存活率，如Berg等所述(Photochem.Photobiol.53203-210，1991)。將1500個細胞接種在25cm2塑料組織培養瓶內，如上所述用光敏劑和光處理。光化學處理后，將V79細胞在37℃含血清培養基中放置5天，以便生成可計數的集落。然后將細胞固定在乙醇中，用亞甲基藍染色，計數集落。向蛋白質中摻入[3H]-亮氨酸，評估對蛋白質合成的抑制作用，在暴露于光之后24小時測量，如Llorente等所述(FEBS Lett.431200-204，1998)。
HPLC在酸化的甲醇(含5μl濃HCl的10ml甲醇)中刮取細胞，從細胞中提取卟啉，如Berg等所述(Br.J.Cancer 74688-697，1996)。使細胞碎屑沉淀，收集上清液。將提取物用N2沖洗直至體積減少至大約150-200μl和使另外沉淀的蛋白質形成沉淀，濃縮卟啉。將100μl上清液與235μl10mM Na2PO4混合，借助5M KOH調節pH至大約10.5，直接用于HPLC分析。借助這種工藝從細胞中定量提取卟啉。將光敏劑的儲備溶液直接稀釋在起始緩沖液中。
HPLC系統由泵(Spectra Physics 8800)、反相柱(Supelcosil LC-18-T(4.6×250mm)，Supelco，S.A.，Gland，Switzerland)、熒光檢測器(LDCfluoromonitor III)和積分儀(Spectra Physics Data-jet)組成，連接有計算機。溶劑A是甲醇與水的混合物(體積比30∶70)，含有1.5mM磷酸鹽，調節至pH7.0。溶劑B是甲醇與水的混合物(體積比95∶5)，含有1.5mM磷酸鹽，調節至pH7.5。應用在40％與20％溶劑A之間的30分鐘線性梯度，繼之以5分鐘線性梯度至100％溶劑B。在330-400nm的波長范圍內激發，檢測熒光。借助截留濾波器消除熒光中的散射光，該濾波器僅發射波長長于410nm的光。
熒光顯微鏡檢查在顯微鏡研究中使用28cm2皿(Falcon 3002，Becton Dickinson，Plymouth，UK)。將細胞用PBS洗滌一次，將蓋玻片小心地置于PBS層頂部。隨后借助裝有epifluorescence的Zeiss Axioplan顯微鏡(Zeiss，Obercochen，Germany)研究細胞。利用HBO/100W汞燈進行激發。借助冷卻了的電荷偶合器件(CCD)照相機(TE2，Astromed，Cambridge，UK)研究細胞和細胞熒光。計算機控制照相機的操作，用于數字圖象的處理和儲存。顯微鏡裝有390-440nm帶通濾波器、470nm二色分束器和610nm長路徑濾波器。
酶測定如Beaufay等所述測量溶酶體酶β-AGA的光化學失活(J.Cell Biol.61188-200，1974)。該方法基于對-硝基苯酚的生成(從底物對-硝基苯基-N-乙酰基-D-氨基葡糖苷生成)，可以在420nm下借助分光光度法測量之。在暴光之后立即分離細胞，準備用于酶分析。
實施例1TPPS2a的光化學還原按照Harel等所述方法(Photochem.Photobiol.23337-341，1976)，在用氮飽和的三乙胺(TEA)的苯溶液中使TPPS2a暴露于光。在比色杯中使溶液暴露于545nm的光，如上“材料和方法”所述。
圖1顯示在暴露于光之后的吸收光譜變化和終產物的光譜，后者是二氫卟酚所特有的。Q-帶第1帶的峰從646nm移動到655nm，最大處的強度增加5.8倍(圖2)。在593nm以及505nm、518nm和577nm處觀測等消光點。照射后的吸收帶是二氫卟酚的特征。
為了擴大二氫卟酚的制備規模用于細胞研究，使更大體積的TPPS2a暴露于光，如“材料和方法”所述進行準備。655nm吸收峰增加的時間比例與上述相似，如圖2所示。生成二氫卟酚后進行HPLC，如圖3所示，顯示生成了若干二氫卟酚異構體。暴露于光達10分鐘的溶液進一步用于培養物中細胞的處理。照射10分鐘后，約23％產物具有與TPPS2a相似的保留時間，但是峰顯示典型的二氫卟酚吸收光譜。
實施例2TPCS2a的光生物學評價使用細胞系V79的中國倉鼠肺成纖維細胞進行二氫卟酚TPCS2a的光化學效應的生物學評價。將細胞用二氫卟酚培育過夜，從細胞中提取光敏劑，用HPLC評價提取物。如圖4所示，細胞提取物中熒光峰的圖樣與儲備溶液相似。利用反相C-18柱進行色譜分析，保留時間一般隨化合物的疏水性而增加。發現二氫卟酚的細胞攝取隨異構體的疏水性而增加。
以前已經發現光敏劑TPPS2a定位于用這種化合物培育的細胞的胞吞小泡中(Berg et al. Photochem.Photobiol.52481-487，1990)。發現TPCS2a的細胞內的定位與TPPS2a相似，表明TPCS2a也定位于胞吞小泡中(見圖5)。溶酶體酶β-N-乙酰基-氨基葡糖苷酶的光化學失活進一步證明了這一點(見圖6)。因而，通過比較溶酶體定位性光敏劑TPPS2a的細胞內熒光圖樣，借助熒光顯微鏡檢查和直接借助溶酶體酶β-AGA的光化學失活測量，顯示TPCS2a間接定位于V79細胞的胞吞小泡中。
在光動力學療法中使用二氫卟酚代替卟啉的益處是二氫卟酚在紅光波長區的消光系數更高。通過比較用TPPS2a和TPCS2a處理的細胞暴露于藍光和紅光，清楚地證明了這一點(見圖7)。圖7中可以見到，用TPPS2a或TPCS2a處理的細胞對藍光是同等敏感的，而用TPCS2a處理的細胞對紅光的敏感性比用卟啉TPPS2a處理的細胞高6倍(圖7a)。
借助I型核糖體失活蛋白質毒素核糖體失活蛋白的內在化評價TPCS2a在胞吞小泡中的細胞內定位，因而及其可能的在大分子光化學內在化(PCI)中的用途。已經發現核糖體失活蛋白單獨或者與光聯合都發揮低毒性(Berg et al.Cancer Res.591180-1183，1999)。在用1μg/ml核糖體失活蛋白處理18小時的細胞中，蛋白質的合成減少了約10％。不過如圖8所示，在暴光之后24小時測量蛋白質合成，發現TPCS2a和光大大加強核糖體失活蛋白的細胞毒性。由單獨TPCS2a誘導的蛋白質合成有輕微(20％)的減少，這在clonogenicity測定中沒有觀察到。結果證明，核糖體失活蛋白在用TPCS2a光化學處理后被內在化于細胞內。
討論本研究顯示，在厭氧條件下，在TEA的存在下，二磺化的四苯基卟吩能夠借助光化學還原作用還原為它的二氫卟酚形式。光化學還原作用引起由若干二氫卟酚異構體的生成所導致的Q-帶第I帶的消光系數增加5.8倍。當與母體卟啉TPPS2a比較時，發現在V79細胞中二氫卟酚TPCS2a使細胞對光失活作用敏感的光敏能力在藍光下是等效的，在紅光下的效率高6倍。
熒光顯微鏡檢查顯示TPCS2a間接定位于V79細胞的胞吞小泡中。借助溶酶體酶β-AGA的光化學失活測量直接確認了這一點。發現β-AGA失活率相對于細胞存活率而言與以前關于TPPS2a的發現相似(Berg et al.，Int.J.Cancer 59814-822，1994)，表明這些化合物在胞吞小泡的膜與腔之間存在相似的分布。
還顯示可以采用TPCS2a作為大分子光化學內在化(PCI)的光敏劑，正如核糖體失活蛋白的PCI所證明的。
權利要求
1.光敏劑，包含磺化的中-四苯基二氫卟酚或其藥學上可接受的鹽。
2.如權利要求1所要求保護的光敏劑，其中存在于所述二氫卟酚中的四個苯基環至少有一個被一個磺酸酯基取代。
3.如權利要求1或權利要求2所要求保護的光敏劑，其中存在于所述二氫卟酚中的兩個苯基環各自被單一的磺酸酯基取代。
4.如權利要求1所要求保護的光敏劑，其中所述二氫卟酚是式(I)化合物 (其中X是-SO3H；n、p、q和r各自獨立地是0或1；n、p、q和r之和是1至4的整數，優選為至少2，例如2或4)；異構體，或任意上述之一的藥學上可接受的鹽。
5.如權利要求4所要求保護的光敏劑，其中n、p、q和r之和是2，每個基團X存在于每個苯基環內相同的環位置。
6.如權利要求5所要求保護的光敏劑，其中所述環位置是間-位或對-位。
7.如權利要求4至6任意一項所要求保護的光敏劑，其中n、p、q和r之和是2，取代的苯基環相鄰于還原的吡咯環。
8.如權利要求4所要求保護的光敏劑，其中所述二氫卟酚是式(II)化合物 異構體、或任意上述之一的藥學上可接受的鹽。
9.可通過還原磺化的中-四苯基卟啉的卟啉大環中一個雙鍵而得到的光敏劑或其藥學上可接受的鹽。
10.如權利要求9所要求保護的光敏劑，其中所述卟啉大環是二磺化的中-四苯基卟啉。
11.如權利要求10所要求保護的光敏劑，其中所述卟啉是TPPS2a(四苯基卟吩二磺酸酯)。
12.制備如權利要求1至11任意一項所定義的光敏劑的方法，所述方法包含至少一個下列步驟(a)還原磺化的四苯基卟啉或其鐵螯合物；(b)如果需要的話，分離步驟(a)所生成的化合物的混合物；(c)轉化步驟(a)或步驟(b)所生成的化合物為其藥學上可接受的鹽。
13.藥物組合物，包含如權利要求1至11任意一項所定義的光敏劑或其藥學上可接受的鹽，以及至少一種藥物載體或賦形劑。
14.用作藥物的如權利要求1至11任意一項所定義的光敏劑或其藥學上可接受的鹽。
15.如權利要求1至11任意一項所定義的光敏劑或其藥學上可接受的鹽在治療劑制備中的用途，該治療劑用在光化學內在化、光化學療法或診斷方法中。
16.向細胞的胞質引入轉移分子的方法，所述方法包含(a)使所述細胞與如權利要求1至11任意一項所定義的光敏劑或其藥學上可接受的鹽接觸；(b)使所述細胞與所述轉移分子接觸；和(c)將所述細胞用活化該光敏劑有效波長的光進行照射。
17.藥物組合物，包含如權利要求1至11任意一項所定義的光敏劑或其藥學上可接受的鹽、轉移分子和至少一種藥物載體或賦形劑。
18.如權利要求17所要求保護的藥物組合物，其中所述轉移分子選自由有機化合物、蛋白質、蛋白質的片段和核酸組成的組。
19.用在治療中的如權利要求17或權利要求18所要求保護的藥物組合物。
20.如權利要求1至11任意一項所定義的光敏劑或其藥學上可接受的鹽和如權利要求18所定義的轉移分子在藥物制備中的用途，該藥物用在治療中，例如癌癥或基因的治療，其中使所述光敏劑和所述轉移分子(單獨、同時或先后)與患者的細胞或組織接觸，再用波長有效活化所述光敏劑的光照射所述的細胞或組織。
21.如權利要求20所要求保護的用途，用于治療類風濕性關節炎、動脈粥樣硬化、病毒感染、牛皮癬、光化性角化病、創傷、骨折、疣、囊性纖維變性、戈林氏綜合征或運動失調性毛細血管擴張癥。
22.如權利要求1至11任意一項所要求保護的光敏劑或其藥學上可接受的鹽和轉移分子在藥物制備中的用途，該轉移分子選自由編碼治療性蛋白質的基因、反義DNA或RNA分子、核酶、適體、構成寡核苷酸的三鏈體、肽核酸(PNA)、轉錄因子“decoy”DNA和嵌合寡核苷酸組成的組，該藥物用在基因療法中，例如治療癌癥、心血管疾病、病毒感染或單基因疾病如囊性纖維變性的方法。
23.如權利要求17至19任意一項所要求保護的藥物組合物或者如權利要求20至23任意一項所要求保護的用途，其中將所述光敏劑和/或所述轉移分子連接于、締合于或者共軛于載體分子、定向分子或載體。
24.如權利要求1至11任意一項所定義的光敏劑或其藥學上可接受的鹽在治療劑制備中的用途，該治療劑用于治療任何對光化學療法有反應的惡性、惡性前或非惡性異常或疾病，例如腫瘤或其他生長，皮膚疾病，例如牛皮癬或光化性角化病與痤瘡、皮膚磨損，和其他疾病或感染，例如細菌、病毒或真菌感染，例如皰疹病毒感染。
25.外部或內部肌體表面疾病或異常的光化學治療方法，所述方法包含(a)對受影響的表面給以如權利要求1至11所要求保護的光敏劑或其藥學上可接受的鹽；(b)使所述表面暴露于波長為300-800nm的光。
26.產品，包含如權利要求1至11任意一項所要求保護的光敏劑或其藥學上可接受的鹽以及至少一種表面滲透助劑和/或一種或多種螯合劑，作為聯合制備物，同時、單獨或先后用于治療對光化學療法有反應的外部或內部肌體表面疾病或異常。
27.用在外部或內部肌體表面疾病或異常的光化學療法中的試劑盒，包含(a)第一容器，含有如權利要求1至11任意一項所要求保護的光敏劑或其藥學上可接受的鹽；(b)第二容器，含有至少一種表面滲透助劑；和任選地包含(c)一種或多種螯合劑，包含在所述第一容器內或第三容器中。
28.通過測定患者體液或組織樣本來體外診斷異常或疾病的方法，所述方法包含i)混合所述體液或組織與如權利要求1至11任意一項所要求保護的光敏劑或其藥學上可接受的鹽；ii)使所述混合物暴露于光；iii)確定熒光的水平；和iv)比較熒光水平與對照物水平。
全文摘要
本發明提供光敏劑，它是通過還原磺化的中－四苯基卟啉的卟啉大環中單一雙鍵而得，該卟啉優選為二磺化的中－四苯基卟啉，例如TPPS
文檔編號A61P31/12GK1549729SQ02816909
公開日2004年11月24日 申請日期2002年8月30日 優先權日2001年8月30日
發明者克勞德·里明頓, 克里斯蒂安·伯格, 迪姆·特蘭, 帕爾·K·塞爾博, K 塞爾博, 克勞德 里明頓, 特蘭, 蒂安 伯格 申請人:Pci生物技術公司