專利名稱：人體硬組織修復材料及其制備方法
技術領域：
本發明涉及用來刺激骨骼生長的人體硬組織修復材料，屬于醫藥生物發明領域。
背景技術：
骨缺損在臨床上發病率較高，其治療仍缺乏滿意的骨修復材料。理想的骨修復材料應具有生物相容性、骨傳導性、骨誘導性及成骨性等特性，自體骨由于具有上述所有特性，所以目前臨床上仍以自體骨移植治療骨缺損為常見，自體骨移植是治療骨缺損的“金標準”，但是自體骨移植供骨量有限，且手術時間長，對供區組織造成損害，供區損傷、疼痛等并發癥高達25% 30%。異體骨移植盡管避免了自體骨移植對供區組織造成的損害，但感染率高，存在引起免疫排斥反應的危險。因此，自體骨和異體骨移植在臨床上應用都存在一定的局限。人工合成骨修復材料在避免上述不利因素的同時，還具有易進行質量控制、可標準化批量生產等優點，成為生物醫學材料研究的一個重點。其中多孔羥基磷灰石(HA)生物陶瓷與人體骨中的無機質的化學組成和晶體結構相類似，且具有良好的生物相容性、生物 降解性和骨傳導性，在作為人工骨修復材料和骨組織工程支架材料方面具有更大的應用潛力。然而，現有多孔HA生物陶瓷骨誘導性不足的缺點，使其的應用受到較多限制。自體骨中含有的活性成分能夠誘導新骨的形成。人們在純化脫鈣骨基質移植物活性成份的研究中發現了骨形態發生蛋白家族，其中骨形態發生蛋白-2(BMP-2)是已知的所有骨生長因子中對骨的形成作用最強的因子，可誘導間充質干細胞、成骨前體細胞、肌源性細胞等向骨細胞分化[I]。但BMP-2來源于動物組織，分離純化難且數量有限。目前，采用基因工程技術制備的重組人骨形態發生蛋白-2 (rhBMP-2)已獲美國FDA批準并開始應用于臨床，但是，用基因工程技術生產時工藝復雜，難以大規模生產，成本高，同時存在基因工程產品潛在的安全性問題[2]。最近，國內外一些學者根據BMP-2氨基酸序列中發揮骨誘導作用的核心功能區，合成了由20個氨基酸組成的小分子多肽，體內外實驗發現該BMP-2活性肽的活性位點能充分暴露并與細胞表面受體結合，和BMP-2 —樣具有骨誘導作用，同時穩定性更好，生物活性更強，可用多肽合成儀大規模合成，費用較低[3-6]。如何把BMP-2活性肽通過結合載體、支架等釋放系統，在骨缺損部位發揮骨誘導的作用，也引起了人們的關注。參考文獻10. P. Gautschi, S. P. Frey and R. Zellweger, Bone morphogenetic proteins inclinical applications. Anz Journal of Surgery,2007. 77 (8) p. 626-631.2. G. B. Bishop and T. A. Einhorn, Current and future clinical applicationsof bone morphogenetic proteins in orthopaedic trauma surgery. InternationalOrthopaedics, 2007. 31 (6) p. 721-727.3. A. Saito，Y. Suzuki, S. Ogata, C. Ohtsuki and M. Tanihara，Accelerated bonerepair with the use of a. synthetic BMP-2-derived peptide and bone-marrowstromal cells. Journal of Biomedical Materials Research Part A，2005.72A(I)ρ· 77-82.4. A. Saito, Y. Suzuki, S. Ogata, C. Ohtsuki and M. Tanihara, Prolonged ectopiccalcification induced by BMP-2-derived synthetic peptide. Journal of BiomedicalMaterials Research Part A，2004. 70A(I) :p.115-121.5. A. Saito, Y. Suzuki, M. Kitamura, S. I. Ogata, Y. Yoshihara, S. Masuda，C.Ohtsuki and M. Tanihara，Repair of 20-mm long rabbit radial bone defectsusing BMP-derived peptide combined with an alpha—tricalciumphosphate scaffold.Journal of Biomedical Materials Research Part A，2006. 77A(4) p. 700-706.6. A. Saito, Y. Suzuki, S. Ogata, C. Ohtsuki and M. Tanihara，Activation ofosteo-progenitor cells by anovel synthetic peptide derived from the bonemorphogenetic protein_2knuckle epitope.Biochimica Et BiophysicaActa-Proteinsand Proteomics, 2003. 1651 (1-2) p. 60-67.
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發明內容
基于上述研究進展，我們設想將BMP-2活性肽結合于HA上，在植入體內后，BMP-2活性肽與HA協同作用，通過誘導骨組織在孔內形成，達到強化多孔HA種植體、盡早與宿主骨形成牢固結合的目的。本發明的目的在于克服現有羥基磷灰石骨修復性能的不足，提供具有促進骨骼生長速率的磷酸鈣復合材料。本發明首先根據BMP-2氨基酸序列中誘導成骨的核心功能區，合成了一條含24 28個氨基酸的BMP-2活性多肽。該羥基磷灰石復合材料由羥基磷灰石和由SEQ ID NO 1 10所示的氨基酸序列的多肽組成。對于不同的骨缺損類型，可通過調節多肽與羥基磷灰石的質量比，來控制骨修復速率，在材料在植入部位的吸收速率與骨骼生長的速率相匹配。多肽序列為I.EEEEE EEKIP KASSV PTELS AlSTLYL(SEQ ID NO 1)2. KIP KASSV PTELS AISTL YL EEEEE EE(SEQ ID NO 2)3.EEEE EEKIP KASSV PTELS AISTL YL(SEQ ID NO 3)4. KIPKASSVPTELSAISTLYLEEEEEE(SEQ ID NO 4)5. EEEEEE EEKIP KASSV PTELS AISTL YL(SEQ ID NO 5)6. KIPKASSVPTELSAISTLYLEEEEEEEE(SEQ ID NO 6)7.EEEEE KIPKASSVPTELSAISTLYL(SEQ IDNO 7)8. KIP KASSV PTELS AISTL YL EEEEE(SEQ ID NO 8)9.EEEEKIP KASSV PTELS AISTL YL(SEQ ID NO 9)10. KIP KASSV PTELS AISTL YL EEEE(SEQ ID NO 10)其中所述的BMP-2活性肽，其特征在于由SEQ ID NO :1 10所示的氨基酸序列組成。所述的羥基磷灰石為羥基磷灰石顆粒，線，塊體，支架。同時本發明提供一種人體硬組織修復材料的制備方法，其特征在于包括下述步驟I)將骨形態發生蛋白-2(BMP-2)活性多肽干粉用生理鹽水溶解或5%葡萄糖溶解；2)將羥基磷灰石顆粒和步驟I)獲得的多肽液相混合；3)將上述混合物靜置，取出支架材料，于超凈工作臺中快速風干，無菌封存。其中所述步驟I)中骨形態發生蛋白-2 (BMP-2)活性多肽溶液濃度為O. 05_20mg/mL，優選為0. 5-15mg/ml ;所述步驟2)中多肽與羥基磷灰石的質量比為10 1-1 1000，優選為I : 1-1 10:所示步驟3)靜置為于25-37°C下靜置，其中靜置時間可根據具體實驗進行本領域常用選擇范圍內的調整，例如10-120min或更長，常用為60min。其中所述骨形態發生蛋白-2 (BMP-2)活性多肽的序列由SEQ ID NO :1 10所示。本發明所要解決的第二個技術問題是提供了上述羥基磷灰石復合材料在制備骨 修復材料中的用途。
本發明創造性的將多肽和羥基磷灰石復合固化而成一種新的骨修復材料，動物實驗結果證實通過模仿HA結合蛋白與HA的結合機制，在BMP-2活性肽序列的一端加上多聚谷氨酸多肽序列，形成的新多肽既包括BMP-2氨基酸序列中具有骨誘導作用的核心功能區，又包括多聚谷氨酸多肽序列，通過多聚谷氨酸多肽序列與多孔HA陶瓷孔壁表面的特異性生物結合，加強了骨誘導活性肽與多孔HA陶瓷的結合，從而達到提高多孔HA陶瓷的骨誘導活性肽的攜帶量并局部穩定釋放骨誘導活性肽的目的。動物實驗數據的統計學分析結果表明，組合物與現有的羥基磷灰石相比，克服了現有的羥基磷灰石不具有骨誘導性的缺點，骨修復能力更強，是一種安全高效的骨修復材料。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明作進一步說明，但本發明并不限于一下實施例。下述實施例中，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中，所述百分含量如無特殊說明，均為質量百分含量。實施例中使用的各種單位，統一采用國家標準。實施例I本發明所述的骨修復材料的制備方法ISEQ ID NO :1 10所示的多肽干粉用去離子水溶解，濃度為20mg/mL。取羥基磷灰石顆粒和多肽液，多肽與羥基磷灰石的質量比為10 1，25攝氏度下勻調和60分鐘，gp得到本發明所述的骨修復材料。實施例2本發明所述的骨修復材料的制備方法2SEQ ID NO 1 10所示的多肽干粉用去離子水溶解，濃度為lmg/mL.取多肽液滴在羥基磷灰石片上，25攝氏度下靜置60分鐘，再用PBS溶液清洗掉未吸附的多肽，即得到本發明所述的骨修復材料。多肽與羥基磷灰石的質量比為I : 1000。實施例3本發明所述的骨修復材料的制備方法3SEQ ID NO :1 10所示的多肽干粉用去離子水溶解，濃度為O. 05mg/mL.將羥基磷灰石塊體置于多肽液中，37攝氏度下負壓吸附60分鐘，即得到本發明所述的骨修復材料。多肽與羥基磷灰石的質量比為I : 10。實施例4本發明所述的骨修復材料的制備方法4SEQ ID NO :I 10所示的多肽干粉用去離子水溶解，濃度為O. 5mg/mL.將羥基磷灰石多孔支架置于多肽液中，37攝氏度下負壓吸附60分鐘，即得到本發明所述的骨修復材料。多肽與羥基磷灰石的質量比為I : 5。實施例5多肽與羥基磷灰石親和力實驗以多肽B和多肽C為例，通過體外吸附試驗來研究多肽與羥基磷灰石的親和力。使用FITC標記多肽。分組多肽A :FITC-KIP KASSV PTELS AISTLYL (對照)，多肽 B :FITC_EEEEE EKIPKASSV PTELS AISTLYL (SEQ ID NO :3)，多肽 C :FITC_EEEEEEEE KIP KASSV PTELS AISTLYL (SEQ ID NO :5)。方法將100微克羥基磷灰石顆粒(直徑10-15微米，比表面積為62m2/g)，加入200微升pH值為7. 4的Tris-HCl緩沖液中，配置成懸浮液。將多肽加入懸浮液中，25攝氏度溫度下攪拌I小時，然后將懸浮液于5000rpm轉速下離心10分鐘，收集上清液測量未吸附的多肽量。多肽量測量方法為熒光測定法，熒光激發波長為490nm，發射波長為520nm。 結果多肽A的吸附量為O. 02nmol，多肽B和C的吸附量為O. 9nmol和O. 8nmol,經修飾后，吸附量上升了 3500%。多肽與羥基磷灰石親和力實驗結果表明，多肽A在羥基磷灰石上的吸附量明顯小于其它各組。多肽B和多肽C經多聚谷氨酸多肽序列修飾后，能夠與羥基磷灰石特異性生物結合，而與多肽B和C相類似的其他7種經過優化的多肽也都具有相類似的特異性結合活性。通過上述實驗結果，我們分析原因如下多孔HA陶瓷與生長因子結合力的大小，決定了生長因子的攜帶量，釋放速度和釋放時間。在保持生長因子的活性前提下，可嘗試采取各種手段，包括物理吸附，靜電吸附，化學鏈接等各種手段來加強載體與生長因子的結合。目前通常采用物理吸附的方法使多孔HA生物陶瓷結合生長因子，臨床研究發現，這種承載生長因子的方式，不僅載藥量有限，而且生長因子的釋放速率不易控制，存在初期釋放過快，后期釋放量太少的問題，無法實現持續釋放，生長因子在早期超生理劑量釋放，可能引起對其它組織和器官不必要的副作用，而在后期又很難維持其作用的效果。化學鏈接的方法可使生長因子通過強的化學結合力結合在HA基質上，但是對HA表面化學處理會干擾HA吸附有利的血液蛋白。研究發現，HA比其它材料植入體具有更高的骨傳導性的原因之一在于其植入體內暴露于血液中具有優先吸附黏附蛋白的能力，有利于細胞在其表面的黏附，因此，采用化學鏈接的方法可能會影響其本身的骨傳導性。我們模仿HA結合蛋白與HA的結合機制，在BMP-2活性肽序列的一端加上多聚谷氨酸多肽序列，形成的新多肽既包括BMP-2氨基酸序列中具有骨誘導作用的核心功能區，又包括多聚谷氨酸多肽序列，通過多聚谷氨酸多肽序列與多孔HA陶瓷孔壁表面的特異性生物結合，加強了骨誘導活性肽與多孔HA陶瓷的結合，從而達到提高多孔HA陶瓷的骨誘導活性肽的攜帶量并局部穩定釋放骨誘導活性肽的目的。實施例6體內異位成骨實驗采用大鼠皮下異位成骨模型來評價本發明所述的骨修復材料的骨修復效果。I、實驗樣品制備與分組成年雌性Wistar大鼠36只，體重80 IOOg,隨機分成3組,每組12只。按4周和8周2個時間點，每個時間點6只大鼠。實驗材料A組通過FMOC/tBU固相多肽合成法(現有常規方法)合成多肽SEQID NO 1 10，所得粗肽經過凝膠層析初步純化，最后經過高效液相色譜法純化后濃度為98. 5%，通過質譜儀對多肽鑒定其序列。所合成之多肽為干粉狀，用去離子水溶解，濃度為5mg/mL，0.2ym濾膜過濾除菌后，注射入大鼠皮下。注射過程采用ImL注射器和26號針頭。每個多肽序列每個時間點6只大鼠。實驗材料B組按實施例4的方法用多肽SEQ ID NO : I 10制備骨修復材料，大小為直徑IOmm,厚2mm的多孔圓片。手術置入大鼠皮下。每個多肽序列每個時間點6只大鼠。實驗材料C組取B組同樣的羥基磷灰石多孔圓片手術置入大鼠皮下。每個時間點6只大鼠。2、大體觀察觀察術后動物飲食、活動及傷口愈合情況。取材時觀察植入部位成骨情況和材料·形貌。3、觀測新骨形成量將植入材料和周圍的組織取出，2. 5%戊二醛固定，石蠟包埋，切片，蘇木精一伊紅染色(H&E)，觀察新骨的形成。4、統計學分析統計學分析通過origins. O軟件的統計學分析功能完成。P < O. 05為差異有顯著性。5、結果所有植入區傷口愈合良好，無紅腫感染等術后并發癥發生。A組術后4周和8周，皮下未見硬組織生成，未見炎性反應，組織正常。B組組織切片觀察顯示植入4周后，大量細胞長入材料，有小的新生骨小梁形成，材料部分降解。8周時材料部分降解，有小的新生骨小梁形成，大量成骨細胞貼附在新生骨小梁邊緣。與4周時相比，8周時骨量明顯增多，通過對連續組織切片的計算得到骨形成區占切片總面積的百分比分別為4周10%，8周25%。C組術后4周，植入材料周圍組織內可見少量中性粒細胞和淋巴細胞浸潤，材料未完全降解，被結構疏松的纖維囊包裹。術后8周，植入材料周圍組織內未見炎性細胞浸潤，纖維囊壁變薄。未見明顯骨組織生成。異位成骨實驗的結果表明，A組是單純的多肽溶液，但注射入皮下后多肽溶液會擴散至周邊組織，多肽失活，未起到異位成骨的效果。B組由多肽和羥基磷灰石支架復合而成，多肽隨著羥基磷灰石基質的降解而逐步釋放，誘導皮下組織細胞分化為成骨細胞，分泌骨基質，實驗結果證實其具有異位成骨的效果。實驗材料C是羥基磷灰石多孔圓片，與其它文獻結果一致，不具有異位成骨作用。實施例7骨缺損修復實驗采用兔股骨踝臨界骨缺損模型來評價本發明所述的骨修復材料的骨修復效果。I、動物模型新西蘭兔橈骨中段臨界骨缺損。2、實驗樣品制備與分組實驗材料A組通過FMOC/tBU固相多肽合成法(現有常規方法)合成多肽(KIPKASSVPT ELSAI STLYL)，所得粗肽經過凝膠層析初步純化，最后經過高效液相色譜法純化后濃度為98. 5%，通過質譜儀對多肽鑒定其序列。所合成之多肽為干粉狀，用去離子水溶解，濃度為5mg/mL，0. 2μπι濾膜過濾除菌后，注射入大鼠皮下。注射過程采用ImL注射器和26號針頭。實驗材料B組按實施例4的方法制備骨修復材料，大小為直徑5mm，高15mm的多孔支架。實驗材料C組取B組同樣的羥基磷灰石多孔支架。對照組D :骨缺損空置。按4周，8周和12周3個時間點，每個時間點6只兔子，其中3只右下肢植入實驗材料A，左下肢植入實驗材料B ;另外3只右下肢植入實驗材料C，左下肢骨缺損空置。3、觀察指標3. I大體觀察 觀察術后兔子的活動、飲食和二便情況，傷口有無腫脹，有無分泌物等。3. 2X 線檢查術后4周,8周和12周連續X線攝片觀察骨缺損修復情況，并參照Lane-Sandhu的X線評分標準評分。3. 3生物力學檢查術后12周處死動物，將樣本平置于萬能試驗機操作臺上進行生物力學實驗。3. 4觀測新骨形成量標本取下后，經4%多聚甲醛固定后，用10% EDTA脫鈣。標本常規脫水，浸蠟，包埋，石蠟切片，行HE染色，光鏡觀察材料及周圍組織的變化和植入材料內新骨形成的情況。采用計算機多功能圖像分析系統，對術后8周和12周的股骨植骨區的成骨情況進行定量分析，各組在不同時間點隨機選取3個平面，每個平面隨機選取3個不重疊的視野進行測量，計算新骨生成面積與骨缺損面積的百分比，取其平均數。3. 5統計學分析統計學分析通過origins. O軟件的統計學分析功能完成。P < O. 05為差異有顯著性。4 結果4. I術后兔子生命活動觀察術后Ih兔子蘇醒，3h后進水進食，創面無感染。在實驗周期內，所有兔子都存活，無手術并發癥發生。4. 2X 線觀察實驗材料A組12周內骨缺損未修復，僅在缺損區邊緣有少量新骨形成。實驗材料B組骨缺損在術后4周時界面模糊，材料與缺損邊緣處出現高密度的新生骨組織，術后8周時原有缺損部位被大量高密度新生骨組織填充，已無法分辨植入材料的輪廓及原有缺損部位，術后12周骨缺損完全修復，原有骨缺損的密度與正常骨組織密度接近。實驗材料C組骨缺損在術后4周時材料外形較易分辨，材料與骨界面處有高密度新生骨組織出現，術后8周有較多高密度新生骨組織生成，但其輪廓與骨缺損部位仍可分辨，術后12周，骨缺損區域被部分新生骨組織填充，其密度稍高于正常骨組織。對照組D12周內骨缺損未修復，僅在缺損區邊緣有少量新骨形成。
4. 3Lane_Sandhu 的 X 線評分結果4. 4壓縮強度術后12周各組骨缺損區壓縮強度如表1，經統計學分析，實驗材料B組顯著高于實驗材料C組(P < O. 05)，實驗材料B組和C組均顯著高于對照組D (P < O. 05)。表I術后12周各組骨缺損區壓縮強度
權利要求
1.一種人體硬組織修復材料，其特征在于它包括羥基磷灰石與骨形態發生蛋白-2ΦΜΡ-2)活性多肽構成，具有三維多孔的結構特征。
2.根據權利要求I所述的人體硬組織修復材料，其特征在于所述的骨形態發生蛋白-2 (BMP-2)活性多肽的序列由SEQ ID NO :1 10所示。
3.根據權利要求I或2所述的人體硬組織修復材料，其特征在于所述的羥基磷灰石形態為顆粒、線、塊體、支架的一種或組合。
4.根據權利要求1-3之一所述的人體硬組織修復材料，其特征在于所述的骨形態發生蛋白-2(BMP-2)活性多肽的濃度為O. 05-20mg/mL，其通過吸附結合到支架材料上。
5.一種人體硬組織修復材料的制備方法，其特征在于包括下述步驟 1)將骨形態發生蛋白-2(BMP-2)活性多肽干粉用生理鹽水溶解或5%葡萄糖溶解； 2)將羥基磷灰石顆粒和步驟I)獲得的多肽液相混合； 3)將上述混合物靜置，取出支架材料，于超凈工作臺中快速風干，無菌封存。
6.權利要求5所述的制備方法，其中所述步驟I)中骨形態發生蛋白-2(BMP-2)活性多肽溶液濃度為O. 5-2mg/mL;所述步驟2)中多肽與羥基磷灰石的質量比為10 1-1 1000 ；所示步驟3)靜置為于25-37°C下靜置。
7.權利要求5或6所述的制備方法，所述骨形態發生蛋白-2(BMP-2)活性多肽的序列由SEQ ID NO 1 10所示。
8.利用權利要求5-7之一所述的制備方法制備出的人體硬組織修復材料。
9.權利要求1-4之一或權利要求8所述的人體硬組織修復材料在制備骨修復材料中的用途。
全文摘要
本發明屬于生物醫學材料領域。主要適用于制取骨形態發生蛋白2活性肽與羥基磷灰石復合劑型。其中所述的骨形態發生蛋白2活性肽，其序列如SEQ ID N01～10所示。本發明所述的方法首先是將骨形態發生蛋白2活性肽溶于生理鹽水溶解或5％葡萄糖溶液中，隨后將羥基磷灰石支架也加入其中，使骨形態發生蛋白2活性肽結合在羥基磷灰石顆粒的表面，經離心分離，并清洗干燥后，獲得所需的骨形態發生蛋白與羥基磷灰石復合劑型，即得到本發明所述的人體硬組織修復材料。
文檔編號A61L27/46GK102886075SQ201210347179
公開日2013年1月23日 申請日期2012年9月19日 優先權日2012年9月19日
發明者黃智 , 于博, 周科朝, 張斗, 李志友, 劉正春 申請人:中南大學