專利名稱：一種唐古特白刺總酚提取物及其提取方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及灌木組織提取物及其提取方法和應用，具體涉及一種從唐古特白刺葉和果中提取的總酚提取物及其提取方法和應用。
背景技術：
唐古特白刺是蔡藜科(Zygophyllaceae)白刺屬(Nitraria L.)中較進化的植物種，也是名貴中藥鎖陽的寄生灌木，在柴達木盆地的沙漠綠洲邊緣，鹽堿沙灘地大量分布，生長環境海拔1900~3500m，分布面積約25萬km2，盆地相對集中成片具有開發價值的天然唐古特白刺林約50~60萬畝。唐古特白刺具有抗高溫、抗沙埋、耐干旱、耐鹽堿、耐嚴寒等特殊生物學特性，這些特性與植物體內的生物活性物質息息相關。其生長地還有“白刺死3年不算死，白楊活3年不算活”的謗語。作為沙生植物中少有的漿果狀核果植物，唐古特白刺果實的色、形、味類似于櫻桃，有“沙櫻桃”之美譽。它是西部蒙、藏、維等少數民族的傳統藥材，其入藥記載于《中國沙漠地區藥用植物》，在《中藥大辭典》中被稱為卡密，以果熟時采收，曬干入藥。具有健脾胃、滋補強壯、調經活血的功能，主治身體瘦弱、氣血兩虧、脾胃不和、消化不良、月經不調、虛寒腰痛等癥。唐古特白刺果實在民間還被用于治療神經衰弱，感冒等癥。現代研究發現唐古特白刺果實富含維生素C、氨基酸、多糖類、黃酮、生物堿等，具有降血脂、降血糖、防治動脈動粥樣硬化、抗氧化以及提高SOD酶活力的作用，能夠較為顯著的提高人體免疫功能、抗疲勞、耐寒冷以及抗缺氧等應激能力。唐古特白刺色素提取物在ORAC(抗氧化能力指數)測定中顯示出很強的抗氧化能力，其抗氧化能力指數明顯高于寧夏枸杞；有研究指出唐古特白刺果實提取物具有良好的抗氧化性可能與其中含有豐富的多酚類活性物質有關；對唐古特白刺果汁營養成分的研究表明，唐古特白刺果汁中含量最高的營養成分為總酚，其次是原花青素，原花青素在真核細胞內能抑制核線粒體的變異，具有抗氧化活性、酶抑制活性、抗致突變活性、降低毛細血管通透性等功能，可用于抗衰老，抗白內障，抗潰瘍及改善視力，已被廣泛應用到藥物、化妝品和功能性食品等領域。賈忠建等從唐古特白刺種子中分得6個黃酮類化合物:異鼠李素-7-0- a -L-鼠李糖式、山奈素-7-0-a -L-鼠李糖式、異鼠李素-7-0-β -D-葡萄糖式、榭皮素-7_0_ a -L-鼠李糖甙、異鼠李糖、槲皮素，前4個化合物為首次從該屬植物中分得。唐古特白刺葉作為民間藥用于治療痙攣、神經痛和心律不齊等癥。段金廒等從唐古特白刺葉中分得8個黃酮類及酚酸類化合物，分別為:3-甲氧基-4-羥基-反式桂皮酸、對-羥基-反式肉桂酸、3-羥基-4-甲氧基-苯甲酸、鄰-羥基苯甲酸、3，5-二甲醚-山柰黃素-7-0- β -D-葡萄糖甙、3-甲醚-山柰黃素-7-0- β -D-葡萄糖甙、異鼠李素-7-0- β -D-葡萄糖甙、異鼠李素-3-0- β -D-蕓香糖甙。黃酮類化合物具有抗氧化、降低脂質過氧化反應、降低心肌耗氧量、防治血管硬化、降壓、抗衰老、抗自由基和抗癌、防癌等作用。合理開發利用唐古特白刺資源，特別是將其葉變廢為寶開發成新藥物和保健品，并不會對生態環境造成危害，對人類社會也是大有裨益的。

發明內容
發明目的:針對現有技術中存在的不足，本發明的目的是提供一種唐古特白刺葉總酚提取物，對唐古特白刺進行合理開發利用。本發明的另一目的是提供一種上述唐古特白刺總酚提取物的提取方法。本發明還有一目的是提供上述唐古特白刺總酚提取物在抗氧化、抗腫瘤方面的應用。技術方案:為了實現上述發明目的，本發明采用的技術方案如下:一種唐古特白刺總酚提取物，由以下方法制得:(I)取唐古特白刺植物材料，干燥，用5 15倍量5(Γ100%乙醇水溶液浸泡后回流提取數次，每次提取I飛h，過濾，得乙醇提取液和濾渣，合并乙醇提取液，靜置12 48h，濾去沉淀，回收溶劑得第一粗提物；(2)將濾渣用5 15倍 量水回流提取3次，每次提取f5h，過濾，合并水提液，水提液經適當濃縮，于冷卻后加入5(Γ100%乙醇水溶液，靜置12 48h，過濾得濾液，減壓蒸餾之得第二粗提物；(3)水溶第一粗提物，上大孔吸附樹脂柱，水洗脫糖后，用5(Γ100%乙醇水溶液洗脫，收集乙醇洗脫液，回收溶劑得第三粗提物；(4)水溶第二粗提物，上大孔吸附樹脂柱，水洗脫糖后，用5(Γ100%乙醇水溶液洗脫，收集乙醇洗脫液，回收溶劑得第四粗提物；(5)水溶第三粗提物和第四粗提物，合并，依次用1(Γ20倍量二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取；回收溶劑分別得二氯甲烷部位提取物、乙酸乙酯部位提取物、正丁醇部位提取物；濃縮萃取后所剩水相，以甲醇洗至濃縮物不能再被溶解，得水部位提取物，合并甲醇溶解部分、回收溶劑得甲醇部位提取物；所述總酚提取物包括第一粗提物、第二粗提物、第三粗提物、第四粗提物、二氯甲烷部位提取物、乙酸乙酯部位提取物、正丁醇部位提取物、水部位提取物及甲醇部位提取物。所述唐古特白刺植物材料為唐古特白刺的果或葉。當為唐古特白刺葉，提取總酚提取物時，優選:先用5(Γ100%乙醇水溶液溶解第四粗提物，過濾，濃縮濾液得到第五粗提物；再將第三粗提物和第五粗提物擴散于水使混懸并合并，沉淀以乙酸乙酯溶解，濃縮溶劑得到第六粗提物，清液則過大孔吸附樹脂，水洗脫糖后以5(Γ100%乙醇水溶液洗至無色，濃縮乙醇洗脫液得第七粗提物；將第七粗提物擴散于5 15倍量水，依次用5 15倍量水二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇各萃取三次；回收溶劑分別得二氯甲烷部位提取物、乙酸乙酯部位提取物、正丁醇部位提取物；濃縮萃取后所剩水相，以甲醇洗至濃縮物不能再被溶解，得水部位提取物，合并甲醇溶解部分、回收溶劑得甲醇部位提取物；所述的總酚提取物還包括第六粗提物、第七粗提物。一種提取唐古特白刺總酚提取物的方法，包括以下步驟:(I)取唐古特白刺植物材料，干燥，用5 15倍量5(Γ100%乙醇水溶液浸泡后回流提取數次，每次提取I飛h，過濾，得乙醇提取液和濾渣，合并乙醇提取液，靜置12 48h，濾去沉淀，回收溶劑得第一粗提物；(2)將濾渣用5 15倍量水回流提取3次，每次提取l 5h，過濾，合并水提液，水提液經適當濃縮，于冷卻后加入50~100%乙醇水溶液，靜置12 48h，過濾得濾液，減壓蒸餾之得第二粗提物；(3)水溶第一粗提物，上大孔吸附樹脂柱，水洗脫糖后，用50~100%乙醇水溶液洗脫，收集乙醇洗脫液，回收溶劑得第三粗提物；(4)水溶第二粗提物，上大孔吸附樹脂柱，水洗脫糖后，用50~100%乙醇水溶液洗脫，收集乙醇洗脫液，回收溶劑得第四粗提物；(5)水溶第三粗提物和第四粗提物，合并，依次用10~20倍量二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取；回收溶劑分別得二氯甲烷部位提取物、乙酸乙酯部位提取物、正丁醇部位提取物；濃縮萃取后所剩水相，以甲醇洗至濃縮物不能再被溶解，得水部位提取物，合并甲醇溶解部分、回收溶劑得甲醇部位提取物。所述唐古特白刺植物材料為唐古特白刺的果或葉。當為唐古特白刺葉，提取總酚提取物時，優選:先用50~100%乙醇水溶液溶解第四粗提物，過濾，濃縮濾液得到第五粗提物；再將第三粗提物和第五粗提物擴散于水使混懸并合并，沉淀以乙酸乙酯溶解，濃縮溶劑得到第六粗提物，清液則過大孔吸附樹脂，水洗脫糖后以50~100%乙醇水溶液洗至無色，濃縮乙醇洗脫液得第七粗提物；將第七粗提物擴散于5 15倍量水，依次用5 15倍量水二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇各萃取三次；回收溶劑分別得二氯甲烷部位提取物、乙酸乙酯部位提取物、正丁醇部位提取物；濃縮萃取后所剩水相，以甲醇洗至濃縮物不能再被溶解，得水部位提取物，合并甲醇溶解部分、回收溶劑得甲醇部位提取物。所述的唐古特白刺總酚提取物在抗氧化中的應用。所述的抗氧化評價方法包括DPPH自由基法和ORAC分析。所述的唐古特白刺總酚提取物在制備抗腫瘤藥物中的應用。所述的腫瘤為白血病、肝癌、肺癌、乳腺癌和結腸癌。應用中涉及的腫瘤細胞株包括白血病細胞HL-60、肝癌細胞SMMC-7721、肺癌細胞Α-549、乳腺癌細胞MCF-7、結腸癌細胞SW480。有益效果:與現有技術相比，本發明的唐古特白刺總酚提取物，提取工藝簡單，容易操作，所制備的提取物，具有較強的抗氧化性及一定的體外腫瘤生長抑制活性，具有很好的實用性。可對唐古特白刺進行合理開發利用，為植物資源化，提供了可靠的技術支持。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明做進一步的說明。以下實施例所使用的材料為:唐古特白刺葉、果實均由中國林科院收集，所有收集的標本進行系統鑒定，干燥標本保存于南京理工大學。白血病細胞HL-60、肝癌細胞SMMC-7721、肺癌細胞Α-549、乳腺癌細胞MCF-7、結腸癌細胞SW480均來自昆明植物所。以下實施例所使用的藥品為:ΑΑΡΗ(2，2' _偶氮二(2_脒基丙烷)二鹽酸鹽)購于Wako化學品有限公司，Trolox (6-輕基-2，5, 7, 8-四甲基苯并二氫卩比喃_2_羧酸)、Folin - Ciocalteu reagent (福林酹試劑)、FL(磷酸氫二鈉突光素)、沒食子酸，以上試劑購于Fisher Scientific公司，DPPH(1，1-二苯基-2-三硝基苯肼)購于阿拉丁試劑公司，其他所有化學品為分析試劑。實施例1取731.5g唐古特白刺葉于40°C烘干，用95%乙醇水溶液回流提取，第一次提取3h、第二次和第三次各lh，乙醇總用量為19.25L ;過濾，得濾液和第一濾渣，合并濾液靜置24h，濾去沉淀，回收溶劑得第一粗提物MH-Y-1 ;將前步得到的第一濾渣用水回流提取3次，第一次提取3h、第二次和第三次各Ih ;過濾，合并水提液，水提液經適當濃縮，于冷卻后加入乙醇，靜置24h，過濾得濾液，減壓蒸餾之得第二粗提物MH-Y-2 ;將第一粗提物MH-Y-1擴散于水中，過HPD-600大孔吸附樹脂，水洗脫糖后，棄去此水洗脫液,用95%乙醇水溶液洗脫，收集此乙醇洗脫液，回收乙醇得75.1g第三粗提物；將第二粗提物MH-Y-2擴散于水中，過HPD-600大孔吸附樹脂，水洗脫糖后,棄去此水洗脫液,用95%乙醇水溶液洗脫，收集此乙醇洗脫液，回收乙醇得32.1g第四粗提物；用95%乙醇水溶液溶解第四粗提物，過濾，濃縮濾液得到0.419g第五粗提物；將第三粗提物和第五粗提物合并擴散于水成混懸液，沉淀以乙酸乙酯溶解，濃縮溶劑得到Ilg第六粗提物MH-3，清液則過HPD-600大孔吸附樹脂，水洗脫糖后以95%乙醇水溶液洗至無色，濃縮乙醇洗脫液得第七粗提物MH-4。將第七粗提物MH-4擴散于IOOmL水依次用IOOmL 二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇各萃取三次?；厥杖軇┓謩e得14.345g 二氯甲烷部位提取物MH-a、0.560g乙酸乙酯部位提取物MH_b、0.932g正丁醇部位提取物MH-c。濃縮萃取后所剩水相，以甲醇洗至濃縮物不能再被溶解，得水部位提取物MH-e，合并甲醇溶解部分、回收溶劑得2.047g甲醇部位提取物MH_d。總酚測定方法:以去離子水溶解提取物并配制成工作標準濃度為O、10、25、50、100、250和500 μ g/mL (ppm)的樣品溶液；將50 μ L的樣品溶液或標準品轉移至規格為13mmX IOOmm的硼娃管中，向其中加入430 μ L的去離子水和20 μ L的Folin-Ciocalteu試齊U，混勻，待反應5min后再加入50 μ L的20%碳酸鈉和450 μ L的去離子水，室溫避光靜置60min后在725nm處測定吸光度。根據標準曲線計算總酚含量。唐古特白刺葉的總酚提取物的總酚含量表示為每Ig唐古特白刺葉的總酚提取物相當于沒食子酸的微克數。部分唐古特白刺葉的總酚提取物總酚含量測定結葉如表I所示。表I從植物葉中抽提出的提取物中總酚含量
權利要求
1.一種唐古特白刺總酚提取物，其特征在于，由以下方法制得: (1)取唐古特白刺植物材料，干燥，用5 15倍量5(Γ100%乙醇水溶液浸泡后回流提取數次，每次提取I飛h，過濾，得乙醇提取液和濾渣，合并乙醇提取液，靜置12 48h，濾去沉淀，回收溶劑得第一粗提物； (2)將濾渣用5 15倍量水回流提取3次，每次提取I飛h，過濾，合并水提液，水提液經適當濃縮，于冷卻后加入5(Γ100%乙醇水溶液，靜置12 48h，過濾得濾液，減壓蒸餾之得第二粗提物； (3)水溶第一粗提物，上大孔吸附樹脂柱，水洗脫糖后，用5(Γ100%乙醇水溶液洗脫，收集乙醇洗脫液，回收溶劑得第三粗提物； (4)水溶第二粗提物，上大孔吸附樹脂柱，水洗脫糖后，用5(Γ100%乙醇水溶液洗脫，收集乙醇洗脫液，回收溶劑得第四粗提物； (5)水溶第三粗提物和第四粗提物，合并，依次用1(Γ20倍量二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取；回收溶劑分別得二氯甲烷部位提取物、乙酸乙酯部位提取物、正丁醇部位提取物；濃縮萃取后所剩水相，以甲醇洗至濃縮物不能再被溶解，得水部位提取物，合并甲醇溶解部分、回收溶劑得甲醇部位提取物； 所述總酚提取物包括第一粗提物、第二粗提物、第三粗提物、第四粗提物、二氯甲烷部位提取物、乙酸乙酯部位提取物、正丁醇部位提取物、水部位提取物及甲醇部位提取物。
2.根據權利要求1所述的唐古特白刺總酚提取物，其特征在于:所述唐古特白刺植物材料為唐古特白刺的果或葉。
3.根據權利要求1所述的唐古特白刺總酚提取物，其特征在于:所述的唐古特白刺植物材料為唐古特白刺葉，提取總酚提取物時，先用5(Γ100%乙醇水溶液溶解第四粗提物，過濾，濃縮濾液得到第五粗提物；再將第三粗提物和第五粗提物擴散于水使混懸并合并，沉淀以乙酸乙酯溶解，濃縮溶劑得到第六粗提物，清液則過大孔吸附樹脂，水洗脫糖后以5(Γ100%乙醇水溶液洗至無色，濃縮乙醇洗脫液得第七粗提物；將第七粗提物擴散于5 15倍量水，依次用5 15倍量水二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇各萃取三次；回收溶劑分別得二氯甲烷部位提取物、乙酸乙酯部位提取物、正丁醇部位提取物；濃縮萃取后所剩水相，以甲醇洗至濃縮物不能再被溶解，得水部位提取物，合并甲醇溶解部分、回收溶劑得甲醇部位提取物；所述的總酚提取物還包括第六粗提物、第七粗提物。
4.一種提取唐古特白刺總酚提取物的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)取唐古特白刺植物材料，干燥，用5 15倍量5(Γ100%乙醇水溶液浸泡后回流提取數次，每次提取I飛h，過濾，得乙醇提取液和濾渣，合并乙醇提取液，靜置12 48h，濾去沉淀，回收溶劑得第一粗提物； (2)將濾渣用5 15倍量水回流提取3次，每次提取I飛h，過濾，合并水提液，水提液經適當濃縮，于冷卻后加入5(Γ100%乙醇水溶液，靜置12 48h，過濾得濾液，減壓蒸餾之得第二粗提物； (3)水溶第一粗提物，上大孔吸附樹脂柱，水洗脫糖后，用5(Γ100%乙醇水溶液洗脫，收集乙醇洗脫液，回收溶劑得第三粗提物； (4)水溶第二粗提物，上大孔吸附樹脂柱，水洗脫糖后，用5(Γ100%乙醇水溶液洗脫，收集乙醇洗脫液，回收溶劑得第四粗提物；(5)水溶第三粗提物和第四粗提物，合并，依次用1(Γ20倍量二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃?。换厥杖軇┓謩e得二氯甲烷部位提取物、乙酸乙酯部位提取物、正丁醇部位提取物；濃縮萃取后所剩水相，以甲醇洗至濃縮物不能再被溶解，得水部位提取物，合并甲醇溶解部分、回收溶劑得甲醇部位提取物。
5.根據權利要求4所述的提取唐古特白刺總酚提取物的方法，其特征在于:所述唐古特白刺植物材料為唐古特白刺的果或葉。
6.根據權利要求5所述的唐古特白刺總酚提取物，其特征在于:所述的唐古特白刺植物材料為唐古特白刺葉，提取總酚提取物時，先用5(Γ100%乙醇水溶液溶解第四粗提物，過濾，濃縮濾液得到第五粗提物；再將第三粗提物和第五粗提物擴散于水使混懸并合并，沉淀以乙酸乙酯溶解，濃縮溶劑得到第六粗提物，清液則過大孔吸附樹脂，水洗脫糖后以5(Γ100%乙醇水溶液洗至無色，濃縮乙醇洗脫液得第七粗提物；將第七粗提物擴散于5 15倍量水，依次用5 15倍量水二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇各萃取三次；回收溶劑分別得二氯甲烷部位提取物、乙酸乙酯部位提取物、正丁醇部位提取物；濃縮萃取后所剩水相，以甲醇洗至濃縮物不能再被溶解 ，得水部位提取物，合并甲醇溶解部分、回收溶劑得甲醇部位提取物。
7.權利要求1所述的唐古特白刺總酚提取物在抗氧化中的應用。
8.權利要求1所述的唐古特白刺總酚提取物在制備抗腫瘤藥物中的應用。
9.根據權利要求8所述的應用，其特征在于:所述的腫瘤為白血病、肝癌、肺癌、乳腺癌和結腸癌。
全文摘要
本發明公開了一種唐古特白刺總酚提取物及其提取方法和應用，總酚提取物由以下方法制得干燥唐古特白刺，酒精回流提取得乙醇提取液和濾渣，回收乙醇得第一粗提物；濾渣用水回流提取數次，得水提液，濃縮，加酒精，減壓蒸餾得第二粗提物；分開水溶第一、二粗提物，過大孔吸附樹脂柱，進行水洗脫糖后，用酒精洗脫，收集乙醇洗脫液，回收溶劑得第三、四粗提物；再繼續對第三、四粗提物進行提取，最終分別獲得二氯甲烷部位提取物、乙酸乙酯部位提取物、正丁醇部位提取物、水部位提取物和甲醇部位提取物。該唐古特白刺總酚提取物，提取工藝簡單，容易操作，總酚提取物含量高，可工業化規模生產。所制備的提取物，具有較強的抗氧化性及一定的體外腫瘤生長抑制活性。
文檔編號A61P35/00GK103110674SQ20131004254
公開日2013年5月22日 申請日期2013年2月1日 優先權日2013年2月1日
發明者成鐵龍, 馬慧, 賈愛群, 史勝青, 張景波, 江澤平 申請人:中國林業科學研究院, 南京理工大學