專利名稱：一種工程化脂肪組織的制備方法
技術領域：
本發明屬于生物材料的組織工程技術領域，具體涉及一種工程化脂肪組織的制備 方法。
背景技術：
每年全世界有數百萬例因創傷、腫瘤切除術和先天性缺陷導致的軟組織缺損患 者，需要通過手術進行修復重建。這些缺損常因脂肪組織的缺失而導致正常組織的形態改 變和功能障礙。隨著對功能性恢復的要求和美觀考慮，對一些深部軟組織的缺損需要塑型， 使患者的心理創傷降到最低。目前軟組織重建常用的方法包括各種組織瓣移植或人工合成替代物的植入，但目 前尚無一種填充材料可以滿足所有的臨床需要。利用自體脂肪組織移植(游離移植或真皮 脂肪瓣移植)修復軟組織缺損的歷史比較久遠，也有不少臨床應用的報告，但因游離移植 的脂肪成活率低、容易吸收，真皮脂肪瓣移植操作復雜、不易塑形，效果并不理想。隨著組織 工程學技術的發展，構建工程化的脂肪組織已成為組織工程研究領域的熱點之一。工程化脂肪組織是應用正常脂肪組織的活細胞或可向脂肪細胞分化的干細胞，在 體外進行大規模培養，再接種到三維結構的生物相容性支架上培養，然后將其從體外培養 環境轉移至體內，能促進與受區細胞整合和血管長入；最終，工程化脂肪組織中的支架材料 在降解過程中逐步被宿主健康的軟組織取代。為使工程化脂肪組織成功地應用于臨床上的 軟組織重建，需要處理好工程化脂肪組織構建程序中的各環節，包括種子細胞和支架材料 的選擇、細胞培養的環境和轉移方式等。種子細胞的選擇應用前脂肪細胞(preadi pocyte)和成熟脂肪細胞(Mature adipocyte)作為種子細胞構建工程化脂肪組織來修復組織缺損，存在以下缺點在移植后 由于新生血管不能快速長入工程化脂肪組織中心區域，成熟脂肪細胞無法得到充足的血 供，很快液化壞死，使組織難以長期存活，常常導致移植的脂肪組織被吸收。成熟的脂肪細 胞在培養過程中處于分化終末期，其增殖能力有限，不能輕易地擴增。前脂肪細胞，雖然容 易培養、擴增，而且能分化為成熟的脂肪細胞，但是前脂肪細胞經多次傳代后，也會喪失分 化能力。干細胞是一類具有自我更新和多向分化能力的細胞，能產生表現型和基因型與自 己完全相同的子細胞，同時還能分化為祖細胞；本發明人研究認為，應用干細胞作為工程化 脂肪組織的種子細胞是理想的選擇。支架材料在組織工程組織的構建中占有舉足輕重的地位。理想的三維支架應具有 臨時細胞外基質(ECM)的作用，為脂肪組織工程種子細胞提供附著、增殖、分化和營養代謝 的場所。細胞以其附著的三維支架為微環境，發展形成新的脂肪組織。現已開發有許多不 同種類的人工合成支架材料，包括聚乙醇酸(PGA)、聚對苯二甲酸乙酯(PET)、多聚共乳乙 交酯酸(PLGA)和聚四氟乙烯(PTEF)，以及天然衍生材料，例如膠原，透明質酸衍生物，基質 膠和纖維蛋白等也已得到應用。在設計支架時需要考慮支架的機械性能、降解特性、免疫 原性、細胞對材料的反應性、臨床應用是否易于操作并能減少成本等。可用于工程化脂肪組
3織構建的支架材料很多，合適的支架材料選擇，應具有適合細胞的黏附、增殖和分化，良好 的生物相容性，可降解及易于操作的特性。美國航天局(NASA)制備的微重力旋轉發生器(rotary cell culturesysterm RCCS)是采用水平旋轉、無氣泡的膜擴散式氣體交換的細胞培養系統。該系統中細胞通過膜 式氣體交換器完成吸氧和排出CO2，任何氣泡都會被清除，消除了旋渦對細胞生長的影響； 細胞和微載體在水平的旋轉式細胞培養容器內產生一個均勻的、極低剪切力的液體懸浮軌 道，細胞可在微載體表面均勻生長，隨著細胞的增殖，可調節旋轉的速度來抵償沉降速率； 由于該系統沒有推進器、空氣升液器，細胞顆粒不會與容器壁或任何易致傷的物體相碰，故 沒有破壞性的剪切力；RCCS最重要的優勢是可以模擬微重力環境，對細胞的生物學行為產 生一定的影響。微重力條件對細胞的增殖和分化有著不同的作用，可以促進細胞的增殖，影 響間充質干細胞的成骨和成軟骨分化。本發明在研究中發現，微重力也有利于脂肪組織的 形成。目前的組織工程脂肪是采用各種材料結合脂肪前體細胞或是干細胞，通過誘導后 在體內形成脂肪。其存在以下缺點血管化不足，體內移植容易液化壞死；誘導時機不確 切，體外誘導時間太長；不能夠大規模生產；可注射的種類較少。因此研發新的制備方法已 成為脂肪組織工程的發展趨勢。經檢索，未見有與本發明相同的工程化脂肪組織制備方法的報道。

發明內容
本發明的目的是提供一種工程化脂肪組織的制備方法，使所獲得的工程化脂肪組 織具有粒徑大小可調和可注射的優點，適用于軟組織充填、修復軟組織缺損造成的凹陷畸 形、美容塑形，快速成活形成脂肪組織。本發明所提出的工程化脂肪組織的制備方法，其特征在于，在微重力條件下，將間 充質干細胞接種到微粒化的生物支架材料上，并向脂肪細胞方向誘導，在微重力旋轉發生 器中生長、成熟形成具有活性的工程化脂肪組織；所述的微粒化生物支架材料是明膠、膠 原、透明質酸、殼聚糖、硫酸軟骨素、聚乳酸、聚羥基乙酸、脫細胞真皮、脫細胞豬小腸粘膜下 層的任一種或是任幾種的組合；所述的微粒化生物支架材料粒徑為20 1000 μ m。所述的 間充質干細胞為可向脂肪細胞分化的間充質干細胞，是骨髓間充質干細胞、脂肪源性間充 質干細胞、牙齦間充質干細胞、牙髓干細胞的任一種。本發明所述的工程化脂肪組織的制備方法，包括有微粒化生物支架的制備、培養 基的配制、以及工程化脂肪組織的三維培養，具體步驟包括步驟一.選擇微粒化生物支架微粒化生物支架材料可以選擇已商品化的產品或 自行制備；其材質為機體可接受的生物可降解材料，包括明膠、膠原、透明質酸、殼聚糖、硫 酸軟骨素、聚乳酸、聚羥基乙酸、脫細胞真皮、脫細胞豬小腸粘膜下層的任一種或是幾種的 組合；微粒化生物支架材料粒徑為20 1000 μ m，是空心球狀、或實心球狀、或多孔微粒狀 結構的任一種；步驟二 .配制培養基按9 1的體積比將α-MEM商用培養液與胎牛血清混合為 基礎液；按500ml基礎液標準加入堿性成纖維細胞生長因子2 50ng，腺嘌呤12 17mg， 轉鐵蛋白1 10mg，維生素C5 30mg，制備成基礎培養基；再用基礎培養基配制以下培養基；誘導培養基在基礎培養基中加入10 200 μ M地塞米松，0. 1 ImM異丁基甲基 黃嘌呤，100 300 μ M吲哚美辛，10 100 μ g/ml胰島素；維持培養基在基礎培養基中加有10 100 μ g/ml胰島素；步驟三.細胞的獲取將原代間充質干細胞按20 200個細胞/cm2接種到細胞 培養板上，用α-MEM商用培養液與胎牛血清按4 1的體積比混合的培養液，在體外經過 擴增培養10 15天，每3天換液一次；間充質干細胞呈克隆樣生長，而摻雜其中的非間充 質干細胞由于接種密度低，其生長受到抑制，從而獲取多克隆的干細胞；將多克隆的間充質 干細胞經過傳代培養，獲取第3 5代的間充質干細胞；步驟四.將獲取的間充質干細胞與微粒化生物支架重量按IO6 IO7個細胞/g的 比例加入微重力旋轉發生器中，培養液為基礎培養基；接種后靜置0. 5 1小時，旋轉5 15分鐘后再靜置，如此靜置旋轉反復3 4次后，開始旋轉培養，轉速15轉/分；步驟五.在旋轉培養過程中，每2天排空在旋轉培養過程中產生的氣泡；培養3 4天后，更換培養液為維持培養基；再培養3天后，更換培養液為誘導培養基，繼續培養3 4天，完成工程化脂肪組織的制備。所形成的脂肪，細胞圍繞微粒化生物支架生長，細胞內有 大量脂滴堆積。本發明采用可向脂肪細胞分化的間充質干細胞結合可降解的微粒化生物支架材 料，在微重力條件下向脂肪細胞方向誘導分化，獲得在體內可發育再生的微粒化脂肪組織。 所制備的工程化脂肪組織不僅與天然脂肪結構相似，具有一定的彈性和韌性，其形狀和大 小能根據具體需求制備，大量生產、長期貯存；且適于Iml注射器注射，便于臨床應用，適用 于大面積軟組織缺損的手術修復；其在體內可以繼續發育為成熟的脂肪組織，易于血管長 入；在臨床治療中可提高脂肪移植成功率，主要功能有用于凹陷畸形的修復(如顳部、頰 部凹陷)，美容充填，軟組織功能重建等；尤其在美容充填中，本發明制備的工程化脂肪組 織可促進外形恢復、防止液化壞死。本發明方法中的間充質干細胞在微粒化生物支架材料表面呈三維方向生長，且隨 著材料的不同可向微粒中心生長，所形成的脂肪結構與天然脂肪相似；在培養過程中，誘導 時間短，啟動了間充質干細胞向脂肪分化的信號通路，但又不在體外達到終末分化，將該工 程化脂肪組織植入體內，可防止脂肪組織的液化，在體內隨著微粒化生物支架材料的降解， 最終形成與天然脂肪類似的結構。附圖及其說明附

圖1為本發明實例1所制備工程化脂肪組織的照片，圖A為相差顯微鏡觀察間 充質干細胞在明膠微球表面生長的照片，可以看出脂肪干細胞在旋轉培養系統中可以很好 的與明膠微球黏附并在其表面生長；圖B為激光共聚焦觀察脂肪間充質干細胞在微球上生 長的照片，可以看出通過細胞膜和細胞核兩種熒光染色可見，脂肪干細胞均勻分布在明膠 微球的表面；圖C為掃描電鏡觀察脂肪干細胞在明膠微球表面生長的照片，可看出脂肪干 細胞在明膠微球上黏附并伸展。附圖2為本發明實例1所制備的工程化脂肪組織移植動物 體內生長情況的照片，圖A為未經向脂肪細胞方向誘導分化的脂肪干細胞與微球移植動物 體內8周的照片；圖B為經向脂肪細胞方向誘導分化的脂肪干細胞與微球移植動物體內8 周的照片，與圖A相比沒有明顯的差別；圖C為未經向脂肪細胞方向誘導分化的脂肪干細胞
5與微球移植動物體內8周后油紅0染色的組織學照片，可見只有少量的脂滴形成；圖D為經 向脂肪細胞方向誘導分化的脂肪干細胞與微球移植動物體內8周后油紅0染色的組織學照 片，可見大量的脂滴形成，與天然脂肪組織類似。
具體實施例方式以下結合實例對本發明技術方案作進一步的詳細說明。實例1、步驟一.微粒化生物支架選擇明膠為材料，制備成粒徑100 150 μ m的實心 球狀結構；方法參考(Adipose tissue engineering based on humanpreadipocytes combined with gelatin microspheres containing basicfibroblast growth factor. Biomaterials. 2003 Jun ；24 (14) :2513_21·)。步驟二 .將α-MEM商用培養液與胎牛血清按9 1的體積比混合為基礎液；按 500ml基礎液標準加入堿性成纖維細胞生長因子10ng，腺嘌呤15mg，轉鐵蛋白5mg，維生素 C 30mg,制備成基礎培養基；再用基礎培養基配制以下培養基誘導培養基在基礎培養基中加入100 μ M地塞米松(dexamethasone，美國Sigma 公司)，0· 5mM 異丁基甲基黃嘌呤(isobutyl-methyl xanthine，美國 Sigma 公司)，200 μ M 吲哚美辛(indomethasone)和50 μ g/ml胰島素；維持培養基在基礎培養基中加入50 μ g/ml胰島素；步驟三.細胞的獲取將自體或者異體來源的脂肪間充質干細胞，在體外按200個 細胞/cm2接種到細胞培養板上，用α-MEM商用培養液與胎牛血清按4 1體積比混合的培 養液，經過擴增培養10天，每3天換液一次；獲得多克隆干細胞；經過傳代培養，獲取第3 5代的脂肪間充質干細胞；步驟四.將體外培養的脂肪間充質干細胞與微粒化生物支架按IO6 IO7個/g的 比例加至微重力旋轉發生器(美國國家航空航天局(NASA)旋轉式細胞培養系統)中，加入 基礎培養基，靜置0. 5小時，旋轉15分鐘后再靜置，如此靜置旋轉反復4次，再以15轉/分 的轉速旋轉培養；步驟五.在旋轉培養過程中，每2天用基礎培養基排空在旋轉培養過程中產生的 氣泡；培養3天后，更換培養液為維持培養基；再培養3天后，更換培養液為誘導培養基，繼 續培養4天，則完成工程化脂肪組織的制備。
0034]所形成的微粒化脂肪組織，細胞圍繞微粒化生物支架生長，細胞內有大量脂滴堆 積(參見附圖1)；其適用于顏面部微小軟組織注射充填美容。實例2、步驟一.微粒化生物支架選擇脫細胞真皮基質為材料，制備成粒徑為300 800 μ m 白勺多孑L球狀結構；方法參考(Expansion and delivery of humanfibroblasts on micronized acellular dermal matrix for skinregeneration. Biomaterials. 2009May ； 30(14) 2666-74)；步驟二 .將α-MEM商用培養液與胎牛血清按9 1的體積比混合為基礎液；按 500ml基礎液標準加入堿性成纖維細胞生長因子50ng，腺嘌呤12mg，轉鐵蛋白10mg，維生素C IOmg,制備成基礎培養基；再用基礎培養基配制以下培養基誘導培養基在基礎培養基中加入10 μ M地塞米松(dexamethasone，美國Sigma 公司)，ImM 異丁基甲基黃嘌呤(isobutyl-methyl xanthine，美國 Sigma 公司)，100 μ M 吲 哚美辛(indomethasone)禾口 10 μ g/ml 胰島素；維持培養基在基礎培養基中加入10 μ g/ml胰島素；步驟三.細胞的獲取將自體或者異體來源的骨髓間充質干細胞，在體外按60個 細胞/cm2接種到細胞培養板上，用α-MEM商用培養液與胎牛血清按4 1體積比混合的 培養液，經過擴增培養，培養15天，每3天換液一次；獲得多克隆干細胞；經過傳代培養，獲 取第3 5代的脂肪間充質干細胞；步驟四.將體外培養的脂肪間充質干細胞與微粒化生物支架按IO6 IO7個/g的 比例加至微重力旋轉發生器中，加入基礎培養基，靜置0. 5小時，旋轉10分鐘后再靜置，如 此靜置旋轉反復4次，再以15轉/分的轉速旋轉培養；步驟五.在旋轉培養過程中，每2天用基礎培養基排空在旋轉培養過程中產生的 氣泡；培養4天后，更換培養液為維持培養基；再培養3天后，更換培養液為誘導培養基，繼 續培養4天，則完成工程化脂肪組織的制備。所形成的微粒化脂肪組織，細胞圍繞微粒化生物支架生長，細胞內有大量脂滴堆 積。其適用于大面積軟組織缺損的充填修復。
權利要求
一種工程化脂肪組織的制備方法，包括有微粒化生物支架的制備，其特征在于，在微重力條件下，將間充質干細胞接種到微粒化的生物支架上，并向脂肪細胞方向誘導，在微重力旋轉發生器中生長、成熟形成具有活性的工程化脂肪組織；所述的微粒化生物支架材料為明膠、膠原、透明質酸、殼聚糖、硫酸軟骨素、聚乳酸、聚羥基乙酸、脫細胞真皮、脫細胞豬小腸粘膜下層的任一種或是任幾種的組合，其粒徑為20～1000μm；所述的間充質干細胞為可向脂肪細胞分化的間充質干細胞，是骨髓間充質干細胞、脂肪源性間充質干細胞、牙齦間充質干細胞、牙髓干細胞的任一種。
2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，具體步驟包括步驟一.選擇微粒化生物支架微粒化生物支架材料為明膠、膠原、透明質酸、殼聚糖、 硫酸軟骨素、聚乳酸、聚羥基乙酸、脫細胞真皮、脫細胞豬小腸粘膜下層的任一種或是幾種 的組合；微粒化生物支架為空心球狀、或實心球狀、或多孔微粒狀結構的任一種；步驟二 .配制培養基按9 1的體積比將α-MEM商用培養液與胎牛血清混合為基礎 液；按500ml基礎液標準加入堿性成纖維細胞生長因子2 50ng，腺嘌呤12 17mg，轉鐵 蛋白1 10mg，維生素C 5 30mg，制備成基礎培養基；再用基礎培養基配制以下培養基； 誘導培養基在基礎培養基中加入10 200 μ M地塞米松，0. 1 ImM異丁基甲基黃嘌 呤，100 300 μ M吲哚美辛，10 100 μ g/ml胰島素；維持培養基在基礎培養基中加有10 100 μ g/ml胰島素；步驟三.細胞的獲取將原代間充質干細胞按20 200個細胞/cm2接種到細胞培養 板上，用α-MEM商用培養液與胎牛血清按4 1的體積比混合的培養液，在體外經過擴增 培養10 15天，每3天換液一次；將多克隆的間充質干細胞經過傳代培養，獲取第3 5 代的間充質干細胞；步驟四.將獲取的間充質干細胞與微粒化生物支架重量按IO6 IO7個細胞/g的比例 加入微重力旋轉發生器中，培養液為基礎培養基；接種后靜置0. 5 1小時，旋轉5 15分 鐘后再靜置，如此靜置旋轉反復3 4次后，開始旋轉培養，轉速15轉/分；步驟五.在旋轉培養過程中，每2天排空在旋轉培養過程中產生的氣泡；培養3 4 天后，更換培養液為維持培養基；再培養3天后，更換培養液為誘導培養基，繼續培養3 4 天，完成工程化脂肪組織的制備。
全文摘要
一種工程化脂肪組織的制備方法，本發明是在微重力條件下，將間充質干細胞接種到微粒化的生物支架上，并向脂肪細胞方向誘導，在微重力旋轉發生器中生長、成熟形成具有活性的工程化脂肪組織；本發明所制備的工程化脂肪組織不僅與天然脂肪結構相似，具有一定的彈性和韌性，其形狀和大小能根據具體需求制備，大量生產、長期貯存；且適于注射，便于臨床應用，適用于大面積軟組織缺損的手術修復；其在體內可以繼續發育為成熟的脂肪組織，易于血管長入；在臨床治療中可提高脂肪移植成功率，可用于凹陷畸形的修復、美容充填、軟組織功能重建等；尤其在美容充填中可促進外形恢復、防止液化壞死。
文檔編號A61L27/24GK101954120SQ201010280320
公開日2011年1月26日 申請日期2010年9月13日 優先權日2010年9月13日
發明者楊改葉 申請人:陜西博鴻生物科技有限公司