專利名稱：包含聚亞烷基二醇的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物、其應用及其制備方法
技術領域：
本發明涉及藥物-寡聚體偶聯物，更具體涉及生長激素藥物-寡聚體偶聯物。
背景技術：
生長激素已被用于生長激素缺乏兒童的替代治療。生長激素還被研究作為一種治療多種分解代謝病癥如燒傷、外科手術和吸收不良的助劑。生長激素對鈣離子潴留和骨生成的積極作用也可以用于治療骨質疏松和非愈合性骨折。
生長激素可以通過肌內或皮下注射給藥。在這些方法中，可以優選皮下注射，因為它有利于自我給藥。但是，這兩種方法由于導致可能與注射給藥有關的生理和/或心理創傷，特別是兒童的生理和/或心理創傷，因而可能不是最佳的方法。
已將藥學活性分子如蛋白質和多肽與多分散的聚乙二醇的混合物或多分散的含有聚乙二醇的聚合物的混合物偶聯得到多分散的藥物-寡聚體偶聯物的混合物。例如，Ekwuribe的美國專利5,359,030提出將多肽如促生長素抑制素、生長激素和/或促生長因子與多分散的聚乙二醇修飾的糖脂聚合物和多分散的聚乙二醇修飾的脂肪酸聚合物偶聯。由各種組合得到的多分散的聚合物的數均分子量優選范圍在大約500至大約10,000道爾頓內。
聚乙二醇(PEG)一般由堿催化的環氧乙烷的開環聚合反應生產。所述反應通過將環氧乙烷加到乙二醇，并以氫氧化鉀作為催化劑而引發。這種方法得到數均分子量在確定的分子量范圍之內的多分散的聚乙二醇聚合物的混合物。例如，由Sigma-Aldrich of Milwaukee，Wisconsin提供的PEG產物是作為多分散的混合物得到的，例如PEG400(Mn380-420)、PEG 1,000(Mn950-1,050)、PEG 1,500(Mn1,400-1,600)和PEG 2,000(Mn1,900-2,200)。
期望得到非多分散的生長激素-寡聚體偶聯物的混合物，其中所述寡聚體包含聚亞烷基二醇。
發明概述包含根據本發明的實施方案的聚亞烷基二醇的生長激素-寡聚體偶聯物的混合物可能表現出比多分散的類似的偶聯物的混合物更高的體內活性，其中所述多分散的混合物具有與本發明的混合物相同的數均分子量。這種增高的活性可能導致較低的劑量要求。而且，包含根據本發明的聚亞烷基二醇的生長激素-寡聚體偶聯物的混合物可以比多分散的類似的偶聯物的混合物更有效地在體外腸消化模型中存留。而且，包含根據本發明的實施方案的聚亞烷基二醇的生長激素-寡聚體偶聯物的混合物還可能導致比多分散的類似的偶聯物的混合物更小的受試者間的差異。
本發明的實施方案提供一種基本上單分散的偶聯物的混合物，其中每個偶聯物包括與含有聚亞烷基二醇部分的寡聚體偶合的生長激素藥物。所述聚亞烷基二醇部分優選具有至少2、3或4個聚亞烷基二醇亞基，并最優選具有至少7個聚亞烷基二醇亞基。所述聚亞烷基二醇部分優選為聚丙二醇。所述寡聚體優選還包含親脂部分。所述生長激素藥物優選為人生長激素。寡聚體優選與人生長激素的氨基官能團共價偶合。所述偶聯物優選為兩親平衡，因而溶于水并能夠穿透生物膜。所述寡聚體可以包含通過不可水解的鍵與藥物共價偶合的第一聚亞烷基二醇部分和通過可水解的鍵與第一聚亞烷基二醇部分共價偶合的第二聚亞烷基二醇部分。所述混合物優選為單分散的混合物，最優選為完全單分散的混合物。
本發明的其它實施方案提供一種基本上單分散的偶聯物的混合物，其中每個偶聯物包含與含有聚亞烷基二醇部分的寡聚體偶合的生長激素藥物，且所述的混合物的體內活性大于具有與所述基本上單分散的混合物相同的數均分子量的多分散的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物的體內活性。
本發明的進一步的其它實施方案提供一種基本上單分散的偶聯物的混合物，其中每個偶聯物包含與含有聚亞烷基二醇部分的寡聚體偶合的生長激素藥物，且所述混合物體外活性大于具有與所述基本上單分散的混合物相同的數均分子量的多分散的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物的體外活性。
本發明的其它實施方案提供一種基本上單分散的偶聯物的混合物，其中每個偶聯物包含與含有聚亞烷基二醇部分的寡聚體偶合的生長激素藥物，且與具有與所述基本上單分散的混合物相同的數均分子量的多分散的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物對胰凝乳蛋白酶降解的抵抗力相比，所述混合物對胰凝乳蛋白酶降解的抵抗力增大。
本發明的進一步的其它實施方案提供一種基本上單分散的偶聯物的混合物，其中每個偶聯物包含與含有聚亞烷基二醇部分的寡聚體偶合的生長激素藥物，且所述混合物的受試者間的差異性小于具有與所述基本上單分散的混合物相同的數均分子量的多分散的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物的受試者間的差異性。
本發明的其它實施方案提供一種偶聯物的混合物，其中每個偶聯物包括與含有聚亞烷基二醇部分的寡聚體偶合的生長激素藥物，且所述混合物具有標準偏差小于大約22道爾頓的的分子量分布。
本發明的進一步的其它實施方案提供一種偶聯物的混合物，其中每個偶聯物包括與含有聚亞烷基二醇部分的寡聚體偶合的生長激素藥物，且所述混合物的分散系數(DC)大于10,000，其中DC=(Σi=1nNiMi)2Σi=1nNiMi2Σi=1nNi-(Σi=1nNiMi)2]]>其中n為樣品中不同分子的數量；Ni為樣品中ith分子的數量；和Mi為ith分子的質量。
本發明的其它實施方案提供一種偶聯物的混合物，其中每個偶聯物包括與寡聚體偶合的生長激素藥物，并具有相同數量的聚亞烷基二醇亞基。
本發明的其它實施方案提供一種偶聯物的混合物，其中每個偶聯物具有相同的分子量并具有下式
生長激素藥物 其中B為鍵合部分；L為接頭部分；G、G′和G″為獨立選擇的間隔部分；R為親脂部分而R′為聚亞烷基二醇部分，或者R′為親脂部分而R為聚亞烷基二醇部分；T為末端部分；h、i、j、k、m和n獨立地為0或1，附帶條件是當R為聚亞烷基二醇部分時，m為1；當R′為聚亞烷基二醇部分時，n為1；和p為1至生長激素藥物上親核殘基數的整數。
本發明還提供不同實施方案的混合物的合成方法。
本發明還提供包含本發明的偶聯物的混合物的藥物組合物。還提供通過給需要治療的受試者施用有效量的這種藥物組合物而治療生長激素缺乏的方法。
本發明還提供通過給動物施用有效量的上述不同實施方案的偶聯物的混合物而加速動物的生長速率的方法。
根據本發明的實施方案的生長激素藥物-寡聚體的偶聯物的混合物與常規的多分散的生長激素藥物-寡聚體的偶聯物的混合物相比，可以增加體內活性和/或降低受試者間的差異性和/或減少胰凝乳蛋白酶降解。
圖的簡要說明

圖1例示根據本發明的實施方案的包含聚乙二醇部分和脂肪酸部分的活化的聚合物的混合物的一般合成路線；圖2例示根據本發明的實施方案的mPEG的混合物的合成路線；圖3例示根據本發明的實施方案的活化的mPEG7-己基寡聚體的混合物的合成路線；
圖4例示根據本發明的實施方案的活化的mPEG7-辛基寡聚體的混合物的合成路線；圖5例示根據本發明的實施方案的活化的PEG-癸基寡聚體的混合物的合成路線；圖6例示根據本發明的實施方案的活化的硬脂酸酯-PEG6寡聚體的混合物的合成路線；圖7例示根據本發明的實施方案的活化的硬脂酸酯-PEG8寡聚體的混合物的合成路線；圖8例示根據本發明的實施方案的活化的PEG3寡聚體的混合物的合成路線；圖9例示根據本發明的實施方案的活化的棕櫚酸酯-PEG3寡聚體的混合物的合成路線；圖10例示根據本發明的實施方案的活化的PEG6寡聚體的混合物的合成和人生長激素與活化的PEG6寡聚體偶聯的路線；圖11例示根據本發明的實施方案的不同的丙二醇單體的合成路線；圖12例示根據本發明的實施方案的不同的丙二醇聚合物的合成路線；圖13例示根據本發明的實施方案的不同的丙二醇聚合物的合成路線；圖14為使用2當量的活化的MPEG6寡聚體和5當量的活化的MPEG6寡聚體的圖10所示的偶聯反應的HPLC痕跡(HPLC梯度50％-90％乙腈，30分鐘)；圖15為使用30當量的活化的MPEG6寡聚體的圖10所示的偶聯反應的HPLC痕跡(HPLC梯度0％-95％乙腈，20分鐘)；圖16為使用2當量的活化的MPEG6寡聚體的圖10所示的偶聯反應的MALDI光譜；圖17為使用5當量的活化的MPEG6寡聚體的圖10所示的偶聯反應的HPLC痕跡(HPLC梯度50％-70％乙腈，30分鐘)；圖18為來自圖17所示的部分純化的餾分B的MALDI光譜；圖19為來自圖17所示的部分純化的餾分C的MALDI光譜；圖20為來自圖17所示的部分純化的餾分D和E的MALDI光譜；
圖21為來自圖17所示的部分純化的餾分E的電噴霧光譜；圖22為來自使用30當量的活化的MPEG6寡聚體的圖10所示的偶聯反應的反應混合物的電噴霧光譜；圖23為人生長激素與圖9的活化的寡聚體的偶聯反應的HPLC痕跡；圖24為使用1當量的人生長激素和2當量的圖9的活化的寡聚體的偶聯反應的的HPLC痕跡；圖25為使用1當量的人生長激素和5當量的圖8的活化的寡聚體的偶聯反應的的HPLC痕跡；圖26為對應于圖25的偶聯HPLC痕跡的峰的左半部分的餾分的MALDI光譜；圖27為對應于圖25的偶聯HPLC痕跡的峰的右半部分的餾分的MALDI光譜；圖28為使用1當量的人生激素和9當量的圖8的活化的寡聚體的偶聯反應的HPLC痕跡；圖29例示的柱形圖表明通過根據本發明的實施方案的生長激素偶聯物的混合物的螢蟲素酶試驗測得的與人生長激素標準品的活性相比的活性，它們僅供比較目的而不形成本發明的部分；和圖30例示的柱形圖表明通過根據本發明的實施方案的生長激素偶聯物的混合物的螢蟲素酶試驗測得的與人生長激素標準品的活性相比的活性，它們僅供比較目的而不形成本發明的部分。
優選實施方案的詳述現在將根據這里所述的優選的實施方案描述本發明。但應該認識到這些實施方案用于例示本發明的目的，而不被理解為對由權利要求定義的本發明的保護范圍進行限定。
這里所用的術語“非多分散的”用于描述具有與Ekwuribe的美國專利5,359,030所述的多分散的混合物形成對比的分散度的化合物的混合物。
這里所用的術語“基本上單分散的”用于描述化合物的混合物，其中所述混合物中至少大約95％的化合物具有相同的分子量。
這里所用的術語“單分散的”用于描述化合物的混合物，其中所述混合物中大約100％的化合物具有相同的分子量。
這里所用的術語“基本上完全單分散的”用于描述化合物的混合物，其中所述混合物中至少大約95％的化合物具有相同的分子量和具有相同的分子結構。因此，基本上完全單分散的混合物為基本上單分散的混合物，但是基本上單分散的混合物不一定是基本上完全單分散的混合物。
這里所述的術語“完全單分散的”用于描述化合物的混合物，其中所述混合物中大約100％的化合物具有相同的分子量和具有相同的分子結構。因此，完全單分散的混合物為單分散的混合物，但單分散的混合物不一定為完全單分散的混合物。
這里所用的術語“重均分子量”定義為混合物中確定的分子的重量分數與混合物中各分子的分子質量的乘積。“重均分子量”以符號Mw表示。
這里所用的術語“數均分子量”定義混合物的總重量除以混合物中分子數量，并由符號Mn表示。
這里所用的術語“分散系數”(DC)由下式定義DC=(Σi=1nNiMi)2Σi=1nNiMi2Σi=1nNi-(Σi=1nNiMi)2]]>其中n為樣品中不同分子的數量；Ni為樣品中ith分子的數量；和Mi為ith分子的質量。
這里所用的術語“受試者內的差異性”意指在不同的時間施用相同劑量的藥物組合物時同一受試者內存在的活性差異。
這里所用的術語“受試者間的差異性”意指在給每名受試者施用相同劑量的藥物或藥劑時兩名或多名受試者之間的活性差異。
這里所用的術語“生長激素藥物”意指具有生長激素肽的全部或某些生物活性的藥物。
這里所用的術語“生長激素肽”意指人生長激素、人生長激素-釋放激素、動物生長激素或動物生長激素-釋放激素，其中任一種可以由天然、合成或基因工程來源獲得。
這里所用的術語“生長激素肽類似物”意指其中一個或多個氨基酸已被取代但保留了生長激素肽的某些和全部的活性的生長激素肽。對類似物的描述方法是將取代氨基酸和取代位置記錄為一個上標和跟在其后的關于生長激素的描述。例如，“Pro41生長激素，人”意指通常在人生長激素分子的41位發現的氨基酸被脯氨酸取代。
本領域技術人員已知可以通過不同的方法得到生長激素類似物。例如生長激素結構中的某些氨基酸可以被其它氨基酸取代同時不明顯地喪失與結構如抗體的抗原結合區或底物分子上的結合部位的相互結合能力。生長激素的相互作用能力和性質決定了它的生物功能活性，可以在氨基酸序列上完成某些氨基酸序列取代，但仍保持具有類似性能的多肽。
在進行這種取代過程中，可以考慮氨基酸的親水指數。在本技術中一般認識到賦予多肽相互作用的生物功能的親水氨基酸指數的重要性。已知氨基酸的相對親水特征影響所得的多肽的二級結構，進而決定多肽與其它分子如酶、底物、受體、DNA、抗體、抗原等的相互作用。根據疏水性和電荷特征為每種氨基酸指定如下的親水指數異亮氨酸(+4.5)、纈氨酸(+4.2)、亮氨酸(+3.8)、苯基丙氨酸(+2.8)、半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)、蛋氨酸(+1.9)、丙氨酸(+1.8)、甘氨酸(-0.4)、蘇氨酸(-0.7)、絲氨酸(-0.8)、色氨酸(-0.9)、酪氨酸(-1.3)、脯氨酸(-1.6)、組氨酸(-3.2)、谷氨酸(-3.5)、谷氨酰胺(-3.5)、門冬氨酸(-3.5)、天冬酰胺(-3.5)、賴氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。本領域技術人員已知，某些氨基酸可以被其它具有類似的親水指數或分數的氨基酸取代，并仍然得到具有類似生物活性的多肽，即仍獲得生物功能等同的多肽。在完成這些改變過程中，優選親水指數相互在±2范圍之內的氨基酸的取代，特別優選親水指數相互在±1范圍之內的氨基酸的取代，更特別優選親水指數相互在±0.5范圍之內的氨基酸的取代。
在本技術中還認識到類似的氨基酸的取代可以根據親水性而有效地完成。美國專利4,554,101認為蛋白質的最大的局部平均親水性由其相鄰的氨基酸的親水性決定，與蛋白質的生物性能有關。如美國專利4,554,101詳述，對氨基酸殘基賦予以下的親水性值精氨酸(+3.0)、賴氨酸(±3.0)、門冬氨酸(+3.0±1)、谷氨酸(+3.0±1)、絲氨酸(+0.3)、天冬酰胺(+0.2)、谷氨酰胺(+0.2)、甘氨酸(0)、蘇氨酸(-0.4)、脯氨酸(-0.5±1)、丙氨酸(-0.5)、組氨酸(-0.5)、半胱氨酸(-1.0)、蛋氨酸(-1.3)、纈氨酸(-1.5)、亮氨酸(-1.8)、異亮氨酸(-1.8)、酪氨酸(-2.3)、苯基丙氨酸(-2.5)、色氨酸(-3.4)。本領域技術人員已知，氨基酸可以被另一種具有類似的親水值的氨基酸取代，并仍然獲得生物學等同，特別是免疫學等同的多肽。在這些改變中，優選親水值彼此在±2范圍之內的氨基酸取代，特別優選親水值彼此在±1范圍之內的氨基酸取代，更特別優選親水值彼此在±0.5范圍之內的氨基酸取代。
因此如以上所述，氨基酸取代一般基于氨基酸側鏈取代基的相對相似性，例如它們的疏水性、親水性、電荷、尺寸等。考慮前述的多個特征的例舉性取代(即可能相互交換但不顯著的改變多肽的生物活性的氨基酸)對于本領域技術人員來說是已知的，例如它包括精氨酸和賴氨酸、谷氨酸和門冬氨酸、絲氨酸和蘇氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺、和纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸。
這里所用的術語“生長激素肽片斷”意指在生長激素中發現的保持生長激素多肽的某些或全部活性的氨基酸序列的片斷。
這里所用的術語“生長激素肽片斷類似物”意指在生長激素肽上發現并保留所述生長激素多肽的某些或全部的活性的氨基酸序列的節段，其中該節段中的一個或多個氨基酸已被取代。
這里所用的術語“聚亞烷基二醇”指直鏈或支鏈聚亞烷基二醇聚合物。術語“聚亞烷基二醇亞基”指單一的聚亞烷基二醇單位。例如，聚乙二醇亞基為-(CH2CH2O)-。
這里所用的術語“親脂性”意指溶于脂質的能力和/或穿透生物膜、與生物膜相互作用和/或橫穿生物膜的能力，而術語“親脂部分”或“親脂體”意指親脂性的部分和/或在與另一種化學實體結合時增加這種化學實體的親油性的部分。親脂性部分的實例包括但不限于烷基、脂肪酸、脂肪酸酯、膽甾醇基、金剛烷基等。
這里所用的術語“低級烷基”指取代或未取代的具有1-5個碳原子的烷基部分。
這里所用的術語“高級烷基”指取代或未取代的具有6或更多個碳原子的烷基部分。
本發明的實施方案提供基本上單分散的生長激素藥物的混合物-寡聚體偶聯物。所述單分散的混合物中的每個生長激素藥物-寡聚體偶聯物包括與含有聚亞烷基二醇部分的寡聚體偶合的生長激素藥物。優選所述混合物中至少大約96％、97％、98％或99％的偶聯物的混合物具有相同的分子量。更優選所述混合物為單分散的混合物。甚至更優選所述混合物為基本上完全單分散的混合物。進一步更優選所述混合物中至少大約96％、97％、98％或99％的偶聯物具有相同的分子量和具有相同的分子結構。最優選所述混合物為完全單分散的混合物。
所述的生長激素藥物優選為人生長激素。但是，應理解生長激素藥物可以選自本領域技術人員已知的不同的生長激素藥物，例如它包括生長激素肽、生長激素肽類似物、生長激素肽片斷和生長激素肽片斷類似物。生長激素肽包括但不限于生長激素，人(hGH)；生長激素，豬；生長激素，牛；生長激素，雞；生長激素，大鼠；生長激素，小鼠；生長激素，綿羊；生長激素釋放因子，人；生長激素pro-釋放因子，人；生長激素釋放因子，小鼠；生長激素釋放因子，綿羊；生長激素釋放因子，大鼠；生長激素釋放因子，牛；生長激素釋放因子，豬；和生長激素釋放因子，雞。生長激素肽類似物可以如上述通過取代生長激素肽中的一個或多個氨基酸而得到。生長激素肽片斷包括但不限于生長激素1-43，人；生長激素6-13；生長激素釋放因子1-37，人；生長激素釋放因子1-40，人；生長激素釋放因子1-40，酰胺，人；生長激素釋放因子30-44，酰胺，人；生長激素釋放因子1-29，酰胺，大鼠；海沙瑞林(生長激素釋放六肽)；和生長激素釋放因子1-29，酰胺，人。生長激素肽片斷類似物包括但不限于[D-Ala2]-生長激素釋放因子1-29，酰胺，人；[N-Ac-Tyr’，D-Arg2]-生長激素釋放因子1-29，酰胺；[His’，Nle27]-生長激素釋放因子1-32，酰胺；生長激素釋放肽-6([His’，Lys6]-GHRP)；和[D-Lys3]-GHRP-6。
本領域技術人員已知所述的寡聚體可以是包含聚亞烷基二醇部分的不同的寡聚體。優選所述的聚亞烷基二醇部分具有至少2、3或4個聚亞烷基二醇亞基。更優選所述聚亞烷基二醇部分具有至少5或6個聚亞烷基二醇亞基。最優選所述寡聚體的聚亞烷基二醇部分具有至少7個聚亞烷基二醇亞基。所述寡聚體的聚亞烷基二醇部分優選為低級烷基聚亞烷基二醇部分如聚乙二醇部分、聚丙二醇部分或聚丁二醇部分。所述聚亞烷基二醇部分為更優選為具有均一結構的聚丙二醇部分。具有均一結構的聚丙二醇部分實例如下 這種均一的聚丙二醇結構可以描述為僅具有一個與聚丙二醇鏈中的每個氧原子相鄰的甲基取代的碳原子。這種均一的聚丙二醇部分可以表現出親脂和親水特征，因而可以用于在不使用親脂聚合物部分的情況下提供兩親型生長激素藥物-寡聚體偶聯物。而且，聚丙二醇部分的仲醇部分與生長激素藥物的偶合可以得到對酶，例如在腸中發現的胰島素和胰凝乳蛋白酶的降解的抵抗力提高的生長激素藥物(例如人生長激素)。
根據本發明的實施方案的均一的聚丙二醇優選如圖11-13合成，現在將對其進行詳述。如圖11所示，1，2-丙二醇53與伯醇封端劑反應得到仲醇延長單體54。所述伯醇封端劑可以是本領域技術人員理的不同的伯醇封端劑(包括但不限于甲硅烷基氯化合物如叔丁基聯苯甲硅烷基氯和叔丁基二甲基甲硅烷基氯)和酯化試劑如Ac2O。優選所述伯醇封端劑為基本上不與仲醇反應的伯醇封端劑，例如叔丁基聯苯甲硅烷基氯或叔丁基二甲基甲硅烷基氯。仲醇延長單體(54)可以與甲基磺酰氯(MeSO2Cl)反應得到伯醇延長單體甲磺酸酯55。
可選擇地，仲醇延長單體54可以與仲醇封端劑反應得到化合物56。所述仲醇封端劑可以是本領域技術人員已知的不同的仲醇封端劑，包括但不限于芐基氯。化合物56可以與B1解封劑反應除去封端部分B，并得到伯醇延長單體57。所述B1解封劑可以選自本領域技術人員已知的不同的解封劑。當通過形成酯將伯醇封端時，B1解封劑為脫酯劑，例如堿(例如碳酸鉀)。當使用甲硅烷基氯將伯醇封端時，B1解封劑優選為四丁基氟化銨(TBAF)。伯醇延長單體57可以與甲基磺酰氯反應得到仲醇延長單體甲磺酸酯58。
可以如下將伯醇延長單體54和仲醇延長單體57封端。仲醇延長單體54可以與封端劑反應得到化合物59。所述封端劑可以是本領域技術人員已知的不同的封端劑，包括但不限于烷基鹵如氯甲烷。化合物59可以與上述的B1解封劑反應得到伯醇封端單體60。
伯醇封端單體60可以與甲基磺酰氯反應得到仲醇封端單體甲磺酸酯61。伯醇延長單體57可以與封端劑反應得到化合物62。封端劑可以是如上述的不同的封端劑。化合物62可以與B2解封劑反應以除去封端部分B2并得到仲醇封端單體63。B2解封劑可以是本領域技術人員已知的不同的解封劑，包括但不限于鈀/活性碳催化劑存在下的H2。仲醇封端單體可以與甲基磺酰氯反應得到伯醇封端單體甲磺酸酯64。雖然圖11所示的實施方案表示封端單體的合成，但應理解可以進行類似的反應得到封端聚合物。
一般地，鏈延長可以通過伯醇延長單體或聚合物如伯醇延長單體57與伯醇延長單體或聚合物甲磺酸酯如伯醇延長單體甲磺酸酯55反應而進行，以得到不同的均一的聚丙烯鏈；或者通過仲醇延長單體或聚合物如仲醇延長單體54與仲醇延長單體或聚合物甲磺酸酯如仲醇延長單體甲磺酸酯58反應而進行。
例如，在圖13中，伯醇延長單體甲磺酸酯55與伯醇延長單體57得到二聚物化合物65。可選擇地，仲醇延長單體甲磺酸酯58可以與仲醇延長單體54反應得到二聚物化合物65。二聚物化合物65上的B1封端部分可以使用上述的B1解封劑除去以得到伯醇延長二聚物66。伯醇延長二聚物66可以與甲基磺酰氯反應得到仲醇延長二聚物甲磺酸酯67。可選擇地，二聚物化合物65上的B2封端部分可以使用上述的B2解封劑除去以得到仲醇延長二聚物69。仲醇延長二聚物69可以與甲基磺酰氯反應得到伯醇延長二聚物甲磺酸酯70。
本領域技術人員已知，鏈延長過程可以重復進行以得到不同的其它鏈長度。例如如圖13所示，伯醇延長二聚物66可以與伯醇延長二聚物甲磺酸酯70反應得到四聚物化合物72。如圖13進一步所示，普通鏈延長反應路線包括伯醇延長單體或聚合物73與伯醇延長單體或聚合物甲磺酸酯74反應得到均一的聚丙烯聚合物75。m和n的值的范圍各為0-1000，或者更優選m和n各為0-50。雖然圖13所示的實施方案表示伯醇延長單體和/或聚合物與伯醇延長單體和/或聚合物甲磺酸酯反應，應該理解類似的反應可以使用仲醇延長單體和/或聚合物和仲醇延長單體和/或聚合物甲磺酸酯完成。
伯醇延長單體或聚合物的末端或者伯醇延長單體或聚合物甲磺酸酯的末端可以分別與伯醇封端單體或聚合物甲磺酸酯或伯醇封端單體或聚合物反應得到封端的均一的聚丙烯鏈。例如，如圖12所示，伯醇延長二聚物甲磺酸酯70與伯醇封端單體60反應得到封端的(capped/blocked)伯醇延長三聚物71。本領域技術人員已知，B1封端部分可以除去，而所得的封端的伯醇延長三聚物可以與伯醇延長單體或聚合物甲磺酸酯反應以延長封端的三聚物71的鏈。
仲醇延長單體或聚合物的末端或者仲醇延長單體或聚合物的末端甲磺酸酯可以分別與仲醇封端單體或聚合物甲磺酸酯或仲醇封端單體或聚合物反應得到封端的均一的聚丙烯鏈。例如，如圖12所示，仲醇延長二聚物甲磺酸酯67與仲醇封端單體63反應得到封端的(capped/blocked)伯醇延長三聚物68。B2封端部分可以如上述除去，而所得的封端的仲醇延長三聚物可以與仲醇延長鏈節甲磺酸酯反應以延封端的三聚物68的鏈。雖然圖12所示的合成表示二聚物與封端單體反應得到三聚物，應該理解封端過程可以在均一的聚丙二醇部分的合成的任何點上進行，或者可選擇地，可以得到不被封端的均一的聚丙二醇部分。雖然圖12所示的實施方案表示通過用封端單體的合成而進行的聚丁烯寡聚體的封端，應該理解本發明的聚丁烯寡聚體可以使用如以上圖11所述的封端劑直接封端(即不加入封端單體)。
根據本發明的實施方案的均一的聚丙二醇部分可以通過本領域技術人員已知的不同的方法與生長激素藥物，親脂部分如羧酸和/或不同的其它部分偶合，所述方法包括但不限于這里關于聚乙二醇部分所述的方法。
所述寡聚體可以包含一個或多個本領域技術人員已知的其它部分，包括但不限于親水部分、親脂部分、間隔部分、接頭部分和末端部分。寡聚體中的不同部分彼此通過可水解或不可水解的鍵共價偶合。
所述寡聚體還可以包含一個或多個親水部分，包括但不限于糖、聚亞烷基二醇和聚胺/PEG共聚物。相鄰的聚亞烷基二醇部分考慮是相同的部分，如果它們通過醚鍵偶合或具有相同的烷基結構的話。例如，以下部分-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-是單一的具有6個聚乙二醇亞基的聚乙二醇部分。相鄰的聚亞烷基二醇部分考慮是不同的部分，如果它們通過除了醚鍵之外的鍵偶合或者如果它們具有不同的烷基結構的話。例如，以下部分 是具有4個聚乙二醇亞基的聚乙二醇部分和具有2個聚乙二醇亞基的親水部分。優選根據本發明的實施方案的寡聚體包含聚亞烷基二醇部分，且不進一步包含親水部分。
所述寡聚體還可以包含一個或多個本領域技術人員已知的親脂部分。所述親脂部分優選為飽和或不飽和、直鏈或支鏈烷基部分或飽和或不飽和、直鏈或支鏈脂肪酸部分。當所述親脂部分為烷基部分時，它優選為直鏈、飽和或不飽和的具有1-28個碳原子的烷基部分。更優選，所述烷基部分具有2-12個碳原子。當親脂部分為脂肪酸部分時，它優選為天然的直鏈、飽和或不飽、具有2-18個碳原子的脂肪酸部分。更優選，所述脂肪酸部分具有3-14個碳原子。最優選所述脂肪酸部分具有至少4、5或6個碳原子。
所述寡聚體還可以包含一個或多個本領域技術人員已知的間隔部分。例如，間隔部分可以用于分隔親水部分與親脂部分，用于分隔親脂部分或親水部分與生長激素藥物，用于分隔第一親水或親脂部分與第二親水或親脂部分，或者用于分隔親水部分或親脂部分與接頭部分。間隔部分優選糖，膽固醇和甘油部分。
所述寡聚體還可以包含一個或多個用于將寡聚體與本領域技術人員已知的生長激素藥物偶合的接頭部分。接頭部分優選選自烷基和脂肪酸部分。
所述寡聚體還可以包含一個或多個處在不與生長激素藥物偶合的寡聚體的一個或多個末端的末端部分。所述末端部分優選為烷基或烷氧基部分，更優選為低級烷基或低級烷氧基部分。最優選所述末端部分為甲基或甲氧基。雖然末端部分優選為烷基或烷氧基部分，應該理解末端部分可以是本領域技術人員已知的不同的部分，包括但不限于糖、膽固醇、醇和脂肪酸。
所述寡聚體優選與生長激素藥物共價偶合。在某些實施方案中，利用可水解的鍵(例如酯或碳酸酯鍵)將生長激素藥物與寡聚體偶合。可水解的偶合可以提供用作前藥的生長激素藥物-寡聚體偶聯物。在某些情況下，例如其中的生長激素藥物-寡聚體偶聯物不具有活性(即所述偶聯物缺乏通過生長激素藥物的主要作用機制影響身體的能力)，可水解的偶合可能提供延時釋放或控釋效果，在一個或多個寡聚體從它們各自的生長激素藥物-寡聚體偶聯物上裂解得到活性藥物時在確定的時間內施用生長激素藥物。在其它實施方案中，利用不可水解的鍵(例如氨基甲酸酯、酰胺或醚鍵)將生長激素藥物與寡聚體偶合。當期望生長激素藥物-寡聚體偶聯物在血流中進行長期，優選至少2小時的循環時，可以優選使用不可水解的鍵。當寡聚體與生長激素藥物共價偶合時，所述寡聚體還包含一個或多個用于將寡聚體與本領域技術人員已知的生長激素藥物共價偶合的鍵合部分。鍵合部分優選選自共價鍵、酯部分、碳酸酯部分、氨基甲酸酯部分、酰胺部分和仲胺部分。寡聚體上的多于一個的部分可以與生長激素藥物共價偶合。
雖然所述寡聚體優選與生長激素藥物共價偶合，但應該理解所述寡聚體可以與生長激素藥物非共價偶合形成非共價偶聯的生長激素藥物-寡聚體復合物。本領域技術人員已知，非共價偶合包括但不限于氫鍵、離子鍵、范德瓦爾斯鍵和膠束或脂質體包囊。本領域技術人員已知，根據本發明的實施方案，寡聚體可以被適宜地構造、修飾和/或適宜地官能化以賦予以所選擇的方式進行非共價偶聯的能力(例如賦予氫鍵能力)。根據本發明的其它實施方案，寡聚體可以由不同的化合物衍生，這些化合物包括但不限于氨基酸、寡肽、肽、膽汁酸、膽汁酸衍生物、脂肪酸、脂肪酸衍生物、水楊酸、水楊酸衍生物、氨基水楊酸和氨基水楊酸衍生物。所得的寡聚體可以與藥物分子、藥品和/或藥物賦形劑非價偶合(復合)。所得的復合物優選具有平衡的親脂和親水性能。根據本發明的進一步的其它實施方案，寡聚體可以由胺和/或烷基胺衍生。在適宜的酸性條件下，所得的寡聚體可以與藥物分子、藥品和/或藥物賦形劑形成非共價偶聯的復合物。由這種復合作用得到的產品優選具有平衡的親脂和親水性能。
多于一個寡聚體(即多個寡聚體)可以與生長激素藥物偶合。多數的寡聚體優選相同。但是，應該理解多數寡聚體可以彼此不同，或者可選擇地，多數寡聚體中有一些可以相同而有一些可以不同。當多個寡聚體與生長激素藥物偶合時，可以優選將一個或多個寡聚體與具有可水解的鍵的生長激素藥物偶合和將一個或多個寡聚體與具有不可水解的鍵的生長激素藥物偶合。可選擇地，所有將多數寡聚體與生長激素藥物偶合的鍵可以是可水解的，但具有不同的水解程度，因而例如一個或多個寡聚體通過在體內水解而快速地從生長激素藥物上除去和一個或多個寡聚體通過在體內水解而緩慢地從生長激素藥物上除去。
所述寡聚體可以在藥物的不同親核殘基上與生長激素藥物偶合，所述親核殘基包括但不限于親核羥基官能團和/或氨基官能團。例如，親核羥基官能團可以見于絲氨酸和/或酪氨酸殘基，而親核氨基官能團可以見于組氨酸和/或賴氨酸殘基和/或一個或多個多肽的N-末端。當寡聚體與一個或多個生長激素多肽的N-末端偶合時，所述偶合優選形成仲胺。例如，當所述生長激素藥物為人生長激素時，所述寡聚體可以是與Phe1、Lys38、Lys41、Lys70、Lys115、Lys140、Lys145、Lys158、Lys168和/或Lys172的氨基官能團偶合。
基本上單分散的本發明的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物可以通過不同的方法合成。例如，通過以下方法合成基本上單分散的羧酸和聚乙二醇組成的寡聚體的混合物使基本上單分散的羧酸的混合物與基本上單分散的聚乙二醇的混合物在足以得到基本上單分散的寡聚體的混合物的條件下反應。然后將所述基本上單分散的混合物的寡聚體活化，從而使它們能夠與生長激素藥物反應得到生長激素藥物-寡聚體偶聯物。用于得到基本上單分散的活化的寡聚體的混合物的合成路線的一個實施方案如圖3所示，并如以下的實施例11-18所述。用于得到基本上單分散的活化的寡聚體的混合物的合成路線的另一個實施方案如圖4所示并如以下的實施例19-24所述。用于得到基本上單分散的活化的寡聚體的混合物的合成路線的進一步的另一個實施方案如圖5所示，并如以下的實施例25-29所述。用于得到基本上單分散的活化的寡聚體的混合物的合成路線的另一個實施方案如圖6所示，并如以下的實施例30-31所述。用于得到基本上單分散的活化的寡聚體的混合物的合成路線的另一個實施方案如圖7所示，并如以下的實施例32-37所述。用于得到基本上單分散的活化的寡聚體的混合物的合成路線的進一步的另一個實施方案如圖8所示，并如以下的實施例38所述。用于得到基本上單分散的活化的寡聚體的混合物的合成路線的另一個實施方案如圖9所示，并如以下的實施例39所述。用于得到基本上單分散的活化的寡聚體的混合物的合成路線的另一個實施方案如圖10所示，并如以下的實施例40所述。
所述的基本上單分散的活化的寡聚體的混合物可以與基本上單分散的生長激素藥物的混合物在足以得到生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物的條件下反應。在以下的實施例40-42中描述了合成的實例。本領域技術人員已知，可以控制反應條件(例如所選擇的摩爾比、溶劑混合物和/或pH)以使通過基本上單分散的活化的寡聚體的混合物與基本上單分散的生長激素藥物的混合物的反應而得到的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物為基本上單分散的混合物。例如，可以通過將反應溶液的pH保持在賴氨酸的pKa以下而抑制在賴氨酸的氨基官能團處的偶聯。
可選擇地，例如所述的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物可以利用HPLC分離(separated和solated)得到基本上單分散的生長激素藥物的混合物-寡聚體偶聯物，例如一、二或三偶聯物。可以利用本領域技術人員已知的不同的技術測定和/或檢驗特定的分離的偶聯物的偶聯程度(例如分離的分子為一、二或三偶聯物)，這些技術包括但不限于質譜。可以利用本領域技術人員已知的不同的技術測定和/或檢驗特定的偶聯物結構(例如所述寡聚體位于人生長激素一偶聯物的Phe1、Lys38、Lys41、Lys70、Lys115、Lys140、Lys145、Lys158、Lys168或Lys172)，這些技術包括但不限于序列分析、肽圖分析、選擇性酶切和/或內肽酶切割。
本領域技術人員已知，生長激素藥物上的一個或多個作用部位可以通過所述生長激素藥物與適宜的封端劑如N-叔丁氧基羰基(t-BOC)或N-(9-芴基甲氧基羰基)(N-FMOC)反應而被封端。例如在所述的生長激素藥物為多肽并期望形成不飽和的在一個或多個多肽N-末端具有寡聚體的偶聯物(即其中并非所有的親核殘基發生偶聯的偶聯物)時，優選這種方法。在這種封端之后，可以使基本上單分散的封端的生長激素藥物的混合物與基本上單分散的活化的寡聚體的混合物反應得到具有與一個或多個親核殘基偶合的寡聚體和具有與其它親核殘基偶合的封端部分的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物。本領域技術人員已知，在偶聯反應之后，可以將生長激素藥物-寡聚體偶聯物解封。如果需要的話，隨后可以如上述分離生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物得到基本上單分散的生長激素藥物的混合物-寡聚體偶聯物。可選擇地，可以在解封之前分離所述的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物。
與常規混合物的性能相比，根據本發明的實施方案的基本上單分散的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物優選具有改善的性能。例如，基本上單分散的生長激素藥物的混合物-寡聚體偶聯物優選體內活性大于多分散的具有與所述的基本上單分散的混合物相同的數均分子量的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物的體內活性。本領域技術人員已知，基本上單分散的混合物的數均分子量和多分散的混合物的數均分子量可以由不同的方法測定，這些方法包括但不限于體積排阻色譜法，例如H.R.Allcock & F.W.Lam pe，CONTEMPORARY POLYMERCHEMISTRY 394-402(第二版，1991)所述的凝膠滲透色譜法。
作為另一個實例，基本上單分散的生長激素藥物的混合物寡聚體偶聯物優選體外活性大于具有與所述基本上單分散的混合物相同的數均分子量的多分散的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物的體外活性。本領域技術人員已知，基本上單分散的混合物的數均分子量和多分散的混合物的數均分子量可以由不同的方法測定，這些方法包括但不限于體積排阻色譜法。本領域技術人員已知，特定混合物的體外活性可以通過不同的方法測定。優選使用從Molecular Devices Corporation ofSunnyvale，California商購得到的Cytosensor微生理機能測定儀測定體外活性。所述微生理機能測定儀監測對被加到在Transwell(Corning，Inc.，Acton，Massachusetts)中培養的細胞的藥物作出反應而發生的細胞外酸化速率的細微變化。這種反應與研究的分子的活性成比例。
作為進一步的另一個實例，與具有與所述基本上單分散的混合物相同的數均分子量的多分散的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物對胰凝乳蛋白酶的降解的抵抗力相比，基本上單分散的生長激素藥物的混合物-寡聚體偶聯物優選對胰凝乳蛋白酶的降解的抵抗力增大。本領域技術人員已知，基本上單分散的混合物的數均分子量和多分散的混合物的數均分子量可以通過不同的方法測定，這些方法包括但不限于體積排阻色譜法。
作為另一個實例，基本上單分散的生長激素藥物的混合物-寡聚體偶聯物的受試者間的差異性小于具有與所述基本上單分散的混合物相同的數均分子量的多分散的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物的受試者間的差異性。本領域技術人員已知，基本上單分散的混合物的數均分子量和多分散的混合物的數均分子量可以是由不同的方法測定，這些方法包括但不限于體積排阻色譜法。本領域技術人員已知，受試者間的差異性可以通過不同的方法測定。受試者間的差異性優選如下計算。測定每名受試者的劑量反應曲線下的面積(AUC)(即劑量反應曲線和基線值之間的面積)。通過計算每名受試者的AUC的總數并用該總數除以受試者數量而確定所有受試者的平均AUC。然后對每名受試者測定受試者的AUC與平均AUC之間的差別的絕對值。隨后計算所得的差異的絕對值的總數得到代表受試者間的差異性的值。較低的值代表較低的受試者間的差異性，而較高的值代表較大的受試者間的差異性。
根據本發明的實施方案的基本上單分散的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物優選具有二個或更多個上述的改善的性能。更優選，根據本發明的實施方案的基本上單分散的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物具有三個或更多個上述的改善的性能。最優選，根據本發明的實施方案的基本上單分散的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物具有所有四個上述的改善的性能。
進一步的其它的根據本發明的實施方案提供具有標準偏差小于大約22道爾頓的分子量分布的偶聯物的混合物。所述混合物中的每個偶聯物包括與含有聚亞烷基二醇部分的寡聚體偶合的生長激素藥物。所述標準偏差優選為小于大約14道爾頓，更優選小于大約11道爾頓。所述分子量分布可以通過本領域技術人員已知的方法測定，所述的方法包括但不限于體積排阻色譜法，例如H.R.Allcock & F.W.Lampe，CONTEMPORARY POLYMER CHEMISTRY 394-402(第二版1991)所述的凝膠滲透色譜法。分子量分布的標準偏差則可以由本領域技術人員已知的統計方法測定。
所述生長激素藥物優選為人生長激素。但是，應該理解所述生長激素藥物可以選自本領域技術人員已知的不同的生長激素藥物，例如它包括生長激素肽、生長激素肽類似物、生長激素肽片斷和生長激素肽片斷類似物。生長激素肽包括但不限于生長激素，人(hGH)；生長激素，豬；生長激素，牛；生長激素，雞；生長激素，大鼠；生長激素，小鼠；生長激素，綿羊；生長激素釋放因子，人；生長激素pro-釋放因子，人；生長激素釋放因子，小鼠；生長激素釋放因子，綿羊；生長激素釋放因子，大鼠；生長激素釋放因子，牛；生長激素釋放因子，豬；和生長激素釋放因子，雞。生長激素肽類似物可以如上述通過取代生長激素肽中的一個或多個氨基酸而得到。生長激素肽片斷包括但不限于生長激素1-43，人；生長激素6-13；生長激素釋放因子1-37，人；生長激素釋放因子1-40，人；生長激素釋放因子1-40，酰胺，人；生長激素釋放因子30-44，酰胺，人；生長激素釋放因子1-29，酰胺，大鼠；海沙瑞林(生長激素釋放六肽)；和生長激素釋放因子1-29，酰胺，人。生長激素肽片斷類似物包括但不限于[D-Ala2]-生長激素釋放因子1-29，酰胺，人；[N-Ac-Tyr1，D-Arg2]-生長激素釋放因子1-29，酰胺；[His1，Nle27]-生長激素釋放因子1-32，酰胺；生長激素釋放肽-6([His1，Lys6]-GHRP)和[D-Lys3]-GHRP-6。
所述寡聚體可以是包含本領域技術人員已知的聚亞烷基二醇部分的不同的寡聚體。優選所述的聚亞烷基二醇部分具有至少2、3或4個聚亞烷基二醇亞基。更優選所述的聚亞烷基二醇部分具有至少5或6個聚亞烷基二醇亞基。最優選所述的寡聚體的聚亞烷基二醇部分具有至少7個聚亞烷基二醇亞基。所述的寡聚體的聚亞烷基二醇部分優選為低級烷基聚亞烷基二醇部分如聚乙二醇部分、聚丙二醇部分或聚丁二醇部分。所述的聚亞烷基二醇部分更優選具有均一的結構的聚丙二醇部分。具有均一的結構的聚丙二醇部分的實例如下 這種均一的聚丙二醇結構可以描述為僅具有一個與聚丙二醇鏈上的每個氧原子相鄰的甲基取代的碳原子。這種均一的聚丙二醇部分可能表現出親脂和親水特征，因而用于在不使用親脂聚合物部分的情況下得到兩親型生長激素藥物-寡聚體偶聯物。而且聚丙二醇部分的仲醇部分與生長激素藥物的偶合可以得到對酶如腸中發現的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶導致的降解的抵抗力增大的生長激素藥物(例如人生長激素)。
根據本發明的實施方案的均一的聚丙二醇優選如圖11-13所示合成，現在將對此進行詳述。如圖11所示，1，2-丙二醇53與伯醇封端劑反應得到仲醇延長單體54。所述伯醇封端劑可以是本領域技術人員已知的不同的伯醇封端劑(包括但不限于甲硅烷基氯化合物如叔丁基聯苯甲硅烷基氯和叔丁基二甲基甲硅烷基氯)和酯化劑如Ac2O。優選所述的伯醇封端劑為基本上不與仲醇反應的伯醇封端劑，例如叔丁基聯苯甲硅烷基氯或叔丁基二甲基甲硅烷基氯。所述的仲醇延長單體(54)可以與甲基磺酰氯(MeSO2Cl)反應得到伯醇延長單體甲磺酸酯55。
可選擇地，仲醇延長單體54可以與仲醇封端劑反應得到化合物56。所述仲醇封端劑可以是本領域技術人員已知的不同的仲醇封端劑，包括但不限于芐基氯。化合物56可以與B1解封劑反應以除去封端部分B1并得到伯醇延長單體57。所述B1解封劑可以選自本領域技術人員已知的不同的解封劑。當通過成酯將所述伯醇封端時，B1解封劑為脫酯劑，例如堿(例如碳酸鉀)。當使用甲硅烷基氯將伯醇封端時，B1解封劑優選為四丁基氟化銨(TBAF)。伯醇延長單體57可以與甲基磺酰氯反應得到仲醇延長單體甲磺酸酯58。
可以如下將伯醇延長單體54和仲醇延長單體57封端。仲醇延長單體54可以與封端劑反應得到化合物59。所述封端劑可以是本領域技術人員已知的不同的封端劑，包括但不限于烷基鹵如氯甲烷。化合物59可以與上述的B1解封劑反應得到伯醇封端單體60。伯醇封端單體60可以與甲基磺酰氯反應得到仲醇封端單體甲磺酸酯61。伯醇延長單體57可以與封端劑反應得到化合物62。所述封端劑可以是如上述的不同的封端劑。化合物62可以與B2解封劑反應以除去封端部分B2和得到仲醇封端單體63。所述B2解封劑可以是本領域技術人員已知的不同的解封劑，包括但不限于鈀/活性碳催化劑存在下的H2。所述仲醇封端單體可以與甲基磺酰氯反應得到伯醇封端單體甲磺酸酯64。雖然圖11所示的實施方案表示封端單體的合成，應該理解可以進行類似的反應以得到封端聚合物。
一般地，鏈延長可以通過以下方法進行使伯醇延長單體或聚合物如伯醇延長單體57與伯醇延長單體或聚合物甲磺酸酯如伯醇延長單體甲磺酸酯55反應得到不同的均一的聚丙烯鏈，或者使仲醇延長單體或聚合物如仲醇延長單體54與仲醇延長單體或聚合物甲磺酸酯如仲醇延長單體甲磺酸酯58反應。
例如，在圖13中，伯醇延長單體甲磺酸酯55與伯醇延長單體57反應得到二聚物化合物65。可選擇地，仲醇延長單體甲磺酸酯58可以與仲醇延長單體54反應得到二聚物化合物65。可以使用上述的B1解封劑除去二聚物化合物65上的B1封端部分得到伯醇延長二聚物66。伯醇延長二聚物66可以與甲基磺酰氯反應得到仲醇延長二聚物甲磺酸酯67。可選擇地，可以使用上述的B2解封劑除去二聚物化合物65上的B2封端部分得到仲醇延長二聚物69。仲醇延長二聚物69可以與甲基磺酰氯反應得到伯醇延長二聚物甲磺酸酯70。
本領域技術人員已知，鏈延長過程可以重復進行以得到不同的其它鏈長度。例如如圖13所示，伯醇延長二聚物66可以與伯醇延長二聚物甲磺酸酯70反應得到四聚物化合物72。如圖13進一步顯示，一般的鏈延長反應路線包括伯醇延長單體或聚合物73與伯醇延長單體或聚合物甲磺酸酯74反應得到均一的聚丙烯聚合物75。m和n的值的范圍可以是0-1000，或者更優選m和n各自為0-50。雖然圖13所示的實施方案表示伯醇延長單體和/或聚合物與伯醇延長單體和/或聚合物甲磺酸酯，但應該理解可以使用仲醇延長單體和/或聚合物和仲醇延長單體和/或聚合物甲磺酸酯完成類似的反應。
伯醇延長單體或聚合物的末端或者伯醇延長單體或聚合物甲磺酸酯的末端可以分別與伯醇封端單體或聚合物甲磺酸酯或伯醇封端單體或聚合物反應得到封端的均一的聚丙烯鏈。例如，如圖12所示，伯醇延長二聚物甲磺酸酯70與伯醇封端單體60反應得到封端的(capped/blocked)伯醇延長三聚物71。本領域技術人員已知，可以除去B1封端部分，且所得的封端的伯醇延長三聚物可以與伯醇延長單體或聚合物甲磺酸酯反應以延長封端的三聚物71的鏈。
仲醇延長單體或聚合物的末端或者仲醇延長單體或聚合物的末端甲磺酸酯可以分別與仲醇封端單體或聚合物甲磺酸酯或仲醇封端單體或聚合物反應得到封端的均一的聚丙烯鏈。例如，如圖12所示，仲醇延長二聚物甲磺酸酯67與仲醇封端單體63反應得到封端的(capped/blocked)伯醇延長三聚物68。可以如以上所述除去所述的B2封端部分，且所得的封端的仲醇延長三聚物可以與仲醇延長鏈節甲磺酸酯反以延長封端的三聚物68的鏈。雖然圖12所示的合成表示二聚物與封端單體反應得到三聚物，但應該理解封端過程可以在均一的聚丙二醇部分的合成中的任何點進行，或者可選擇地，可以得到未被封端的均一的聚丙二醇部分。雖然圖12所示的實施方案表示通過使用封端單體進行合成而將聚丁烯寡聚體封端，應該理解本發明的聚丁烯寡聚體可以是使用以上圖11所述的封端劑而進行直接封端(即不加入封端單體)。
根據本發明的實施方案的均一的聚丙二醇部分可以通過本領域技術人員已知的不同的方法與生長激素藥物、親脂部分如羧酸和/或不同的其它部分偶合，這些方法包括但不限于這里關于聚乙二醇部分所述的方法。
所述寡聚體可以包含一個或多個本領域技術人員已知的其它部分，包括不限于親水部分、親脂部分、間隔部分、接頭部分和末端部分。所述寡聚體中的不同的部分通過可水解或不可水解的鍵與另一寡聚體共價偶合。
所述寡聚體還可以包含一個或多個親水部分，包括但不限于糖、聚亞烷基二醇和聚胺/PEG共聚物。相鄰的聚亞烷基二醇部分考慮是相同的部分，如果它們通過醚鍵偶合并具有相同的烷基結構的話。例如，以下部分-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-是單一的具有6個聚乙二醇亞基的聚乙二醇部分。相鄰的聚亞烷基二醇部分認為是不同的部分，如果它們與除了醚鍵之外的鍵偶合或者它們具有不同的烷基結構。例如，以下部分 是具有4個乙二醇亞基的聚乙二醇部分和具有2個聚乙二醇亞基的親水部分。優選，根據本發明的寡聚體的的實施方案包含聚亞烷基二醇部分，并不進一步包含親水部分。
所述的寡聚體還可以包含一個或多個本領域技術人員已知的親脂部分。所述的親脂部分優選為飽和或不飽和、直鏈或支鏈烷基部分或飽和或不飽和、直鏈或支鏈脂肪酸部分。當所述的親脂部分為烷基部分時，優選直鏈、飽和或不飽和具有1-28個，更優選具有具有2-12個碳原子的碳原子的烷基部分。當所述的親脂部分為脂肪酸部分時，優選天然的脂肪酸是直鏈、天然脂肪酸部分，具有2-18個碳原子。更優選，所述脂肪酸部分具有3-14個碳原子。最優選所述脂肪酸部分具有至少4、5或6個碳原子。
所述寡聚體還可以包含一個或多個本領域技術人員已知的間隔部分。例如間隔部分可以用于分隔親水部分與親脂部分，用于分隔親脂部分或親水部分與生長激素藥物，用于分隔第一親水或親脂部分與第二親水或親脂部分，或用于分隔親水部分或親脂部分與接頭部分。間隔部分優選自糖、膽固醇和甘油部分。
所述的寡聚體還可以包含一個或多個用于將寡聚體與本領域技術人員已知的生長激素藥物偶合。優選接頭部分選自烷基和脂肪酸部分。
所述寡聚體還可以包含一個或多個處在不與生長激素藥物偶合的寡聚體的末端的末端部分。所述末端部分優選為烷基或烷氧基部分，更優選低級烷基或低級烷氧基部分。最優選所述的末端部分為甲基或甲氧基。雖然所述末端部分優選為烷基或烷氧基部分，但應該理解所述的末端部分可以是本領域技術人員已知的不同的部分，包括但不限于糖、膽固醇、醇和脂肪酸。
所述寡聚體優選與生長激素藥物共價偶合。在某些實施方案中，利用可水解的鍵(酯或碳酸酯鍵)將生長激素藥物與寡聚體偶合。可水解的偶合可以得到用作前藥的生長激素藥物-寡聚體偶聯物。例如在某些實施方案中，其中所述的生長激素藥物-寡聚體偶聯物無活性(即所述偶聯物缺乏通過生長激素藥物的主要作用機理而影響效果的能力)，可水解的偶合可以用于延時釋放或控釋效果。在一個或多個寡聚體從它們的各自的生長激素藥物-寡聚體偶聯物上裂解得到活性藥物時，可以在確定的時間內施用生長激素藥物。在其它實施方案中，利用不可水解的鍵(例如氨基甲酸酯、酰胺或醚鍵)將生長激素藥物與寡聚體偶合。當期望使生長激素藥物-寡聚體偶聯物在血流中進行長期，優選至少2小時的循環時，可以優選使用不可水解的鍵。當寡聚體與生長激素藥物共價偶合時，所述寡聚體還包含一個或多個用于與本領域技術人員已知的生長激素藥物的寡聚體共價偶合的鍵合部分。鍵合部分優選選自共價鍵、酯部分、碳酸酯部分、氨基甲酸酯部分、酰胺部分和仲胺部分。所述寡聚體上多于1個部分可以與生長激素藥物共價偶合。
雖然所述寡聚體優選與生長激素藥物共價偶合，但應該理解所述寡聚體可以與生長激素藥物非共價偶合形成非共價偶聯的生長激素藥物-寡聚體復合物。本領域技術人員已知，非共價偶合包括但不限于氫鍵、離子鍵、范德瓦爾斯鍵和膠束或脂質體包囊。本領域技術人員已知，根據本發明的實施方案，寡聚體可以被適宜構建、修飾和/或適宜地官能化以賦予以所選擇地方式進行非共價偶聯的能力(例如賦予氫鍵能力)。根據本發明的其它實施方案，寡聚體可以由不同的化合物的衍生，這些化合物包括但不限于氨基酸、寡肽、肽、膽汁酸、膽汁酸衍生物、脂肪酸、脂肪酸衍生物、水楊酸、水楊酸衍生物、氨基水楊酸和氨基水楊酸衍生物。所得的寡聚體可以與藥物分子、藥品和/或藥物賦形劑非共價偶合(復合)。所得的復合物優選具有平衡的親脂和親水性能。根據本發明的進一步的其它實施方案，寡聚體可以由胺和/或烷基胺衍生。在適宜的酸性條件下，所得的寡聚體可以與藥物分子、藥品和/或藥物賦形劑形成非共價偶聯的復合物。由這種復合作用得到的產品優選具有平衡的親脂和親水性能。
多于一個寡聚體(即多個寡聚體)可以與生長激素藥物偶合。多數的寡聚體優選相同。但是，應該理解多數寡聚體可以彼此不同，或者可選擇地，多數寡聚體中有一些可以相同而有一些可以不同。當多個寡聚體與生長激素藥物偶合時，可以優選將一個或多個寡聚體與具有可水解的鍵的生長激素藥物偶合和將一個或多個寡聚體與具有不可水解的鍵的生長激素藥物偶合。可選擇地，所有將多數寡聚體與生長激素藥物偶合的鍵可以是可水解的，但具有不同的水解程度，因而例如一個或多個寡聚體通過在體內水解而快速地從生長激素藥物上除去和一個或多個寡聚體通過在體內水解而緩慢地從生長激素藥物上除去。
所述寡聚體可以在藥物的不同親核殘基上與生長激素藥物偶合，所述親核殘基包括但不限于親核羥基官能團和/或氨基官能團。例如，親核羥基官能團可以見于絲氨酸和/或酪氨酸殘基，而親核氨基官能團可以見于組氨酸和/或賴氨酸殘基和/或一個或多個多肽的N-末端。當寡聚體與一個或多個生長激素多肽的N-末端偶合時，所述偶合優選形成仲胺。例如，當所述生長激素藥物為人生長激素時，所述寡聚體可以是與Phe1、Lys38、Lys41、Lys70、Lys115、Lys140、Lys145、Lys158、Lys168和/或Lys172的氨基官能團偶合。
具有標準偏差小于大約22道爾頓的分子量分布的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物可以是由不同的方法合成。例如，通過以下方法合成具有標準偏差小于大約22道爾頓的分子量分布并由羧酸和聚乙二醇組成的寡聚體的混合物使具有標準偏差小于大約22道爾頓的分子量分布的羧酸的混合物與具有標準偏差小于大約22道爾頓的分子量分布的聚乙二醇的混合物在足以得到具有標準偏差小于大約22道爾頓的分子量分布的寡聚體的混合物接觸。然后將具有標準偏差小于大約22道爾頓的分子量分布的混合物的寡聚體活化，從而使它們能夠與生長激素藥物反應得到生長激素藥物-寡聚體偶聯物。
用于得到具有標準偏差小于大約22道爾頓的分子量分布的活化的寡聚體的混合物的合成路線的一個實施方案如圖3所示，并如以下實施例11-18所述。用于得到具有標準偏差小于大約22道爾頓的分子量分布的活化的寡聚體的混合物的合成路線的另一個實施方案如圖4所示，并如以下實施例19-24所述。用于得到具有標準偏差小于大約22道爾頓的分子量分布的活化的寡聚體的混合物的合成路線的進一步的另一個實施方案如圖5所示，并如以下的實施例25-29所述。用于得到具有標準偏差小于大約22道爾頓的分子量分布的活化的寡聚體的混合物的合成路線的另一個實施方案如圖6所示，并如以下的實施例30-31所述。用于得到具有標準偏差小于大約22道爾頓的分子量分布的活化的寡聚體的混合物的合成路線的另一個實施方案如圖7所示，并如以下的實施例32-37所述。用于得到具有標準偏差小于大約22道爾頓的分子量分布的活化的寡聚體的混合物的合成路線的另一個實施方案如圖8所示，并如下以下的實施例38所述。用于得到具有標準偏差小于大約22道爾頓的分子量分布的活化的寡聚體的混合物的合成路線的另一個實施方案如圖9所示，并如以下的實施例39所述。用于得到具有標準偏差小于大約22道爾頓的分子量分布的活化的寡聚體的混合物的合成路線的另一個實施方案如圖10所示，并如以下實施例40所述。
使所述的具有標準偏差小于大約22道爾頓的分子量分布的活化的寡聚體的混合物與具有標準偏差小于大約22道爾頓的分子量分布的生長激素藥物的混合物在足以得到生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物的條件下反應。合成實例如以下實施例40-42所述。本領域技術人員已知，可以控制反應條件(例如所選擇的摩爾比、溶劑混合物和/或pH)以使由具有標準偏差小于大約22道爾頓的分子量分布的活化的寡聚體的混合物和具有標準偏差小于大約22道爾頓的分子量分布的生長激素藥物的混合物反應得到的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物是具有標準偏差小于大約22道爾頓的分子量分布的混合物。例如，可以通過將反應溶液的pH保持在賴氨酸的pKa以下而抑制在賴氨酸的氨基官能團上的偶聯。可選擇地，所述的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物可以利用HPLC分離(separated和isolated)得到具有標準偏差小于大約22道爾頓的分子量分布的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物，例如一、二或三偶聯物。可以利用本領域技術人員已知的不同的技術測定和/或檢驗特定的分離的偶聯物的偶聯程度(例如所分離的分子為一、二或三偶聯物)，這些技術包括但不限于質譜。可以利用本領域技術人員已知的不同的技術測定和/或檢驗特定的偶聯物結構(例如所述寡聚體處在人生長激素一偶聯物的Phe1、Lys38、Lys41、Lys70、Lys115、Lys140、Lys145、Lys158、Lys168或Lys172)，這些技術包括但不限于序列分析、肽圖分析、選擇性酶切和/或內肽酶切割。
本領域技術人員已知，例如可以通過使生長激素藥物與適宜的封端劑如N-叔丁氧基羰基(t-BOC)或N-(9-芴基甲氧基羰基)(N-FMOC)反應而將生長激素藥物上的一個或多個反應部位封端。例如在所述的生長激素藥物為多肽并期望形成在多肽的一個或多個N-末端具有一個或多個寡聚體的不飽和的偶聯物(即并非所有的親核殘基被偶聯)時可以優選這種方法。在進行這種封端之后，具有標準偏差小于大約22道爾頓的分子量分布的封端的生長激素藥物的混合物可以與具有標準偏差小于大約22道爾頓的分子量分布的活化的寡聚體的混合物反應得到具有與一個或多個親核殘基偶合的寡聚體和具有與其它親核殘基偶合的封端部分的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物。本領域技術人員已知，在偶聯反應之后可以將生長激素藥物-寡聚體偶聯物解封。如果需要的話，然后可以如上述分離所述的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物得到具有標準偏差小于大約22道爾頓的分子量分布的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物。可選擇地，可以在解封之前分離所述的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物。
根據本發明的實施方案的具有標準偏差小于大約22道爾頓的分子量分布的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物優選具有比常規混合物改善的性能。例如，具有標準偏差小于大約22道爾頓的分子量分布的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物優選的體內活性大于具有與具備標準偏差小于大約22道爾頓的分子量分布的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物相同的數均分子量的多分散的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物的體內活性。本領域技術人員已知，具有標準偏差小于大約22道爾頓的分子量分布的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物的數均分子量和多分散的混合物的數均分子量可以由不同的方法測定，這些方法包括但不限于體積排阻色譜法，例如H.R.Allcock & F.W.Lampe，CONTEMPORARY POLYMER CHEMISTRY 394-402(第二版，1991)所述的凝膠滲透色譜法。
作為另一個實例，具有標準偏差小于大約22道爾頓的分子量分布的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物優選體外活性大于具有與具備標準偏差小于大約22道爾頓的分子量分布的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物相同的數均分子量的多分散的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物的體外活性。本領域技術人員已知，具有標準偏差小于大約22道爾頓的分子量分布的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物的數均分子量和多分散的混合物的數均分子量可以通過不同的方法測定，所述的方法包括但不限于體積排阻色譜法。
本領域技術人員已知，可以通過不同的方法測定特定混合物的體外活性。優選使用從Molecular Devices Corporation of Sunnyvale，California商購的Cytosensort微生理機能測定儀測定體外活性。所述微生理機能測定儀監測對被加到在Transwell中培養的細胞中的藥物作出反應而發生的細胞外酸化速率的細微變化。這種反應與研究的分子的活性成比例。
作為另一個實例，當與具有與具備標準偏差小于大約22道爾頓的分子量分布的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物相同的數均分子量的多分散的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物對胰凝乳蛋白酶降解的抵抗力相比，具有標準偏差小于大約22道爾頓的分子量分布的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物對胰凝乳蛋白酶降解的抵抗力增大。本領域技術人員已知，具有標準偏差小于大約22道爾頓的分子量分布的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物的數均分子量和多分散的混合物的數均分子量可以通過不同的方法測定，這些方法包括但不限于體積排阻色譜法。
作為另一個實例，具有具有標準偏差小于大約22道爾頓的分子量分布的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物優選其受試者間的差異性小于具有與具備標準偏差小于大約22道爾頓的分子量分布的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物相同的數均分子量的多分散的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物的受試者間的差異性。本領域技術人員已知，具有標準偏差小于大約22道爾頓的分子量分布的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物的數均分子量和多分散的混合物的數均分子量可以通過不同的方法測定，這些方法包括不但不限于體積排阻色譜法。可以通過本領域技術人員已知的不同的方法測定受試者間的差異性。優選如下計算受試者間的差異性。測定每名受試者的劑量反應曲線下的面積(AUC)(即劑量反應曲線和基線值之間的面積)。所有受試者的平均AUC通過計算每名受試者的AUC并將此總和除去受試者的數量來確定。然后對每名受試者測定受試者的AUC和平均AUC之間的差異的絕對值。然后計算所得的差異的絕對值的總和得到代表受試者間的差異性的值。較低的值代表較低的受試者間的差異性，而較高的值代表較高的受試者間的差異性。
根據本發明的實施方案的具有標準偏差小于大約22道爾頓的分子量分布的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物優選具有二種或更多種上述的改善性能。更優選，根據本發明的實施方案的具有標準偏差小于大約22道爾頓的分子量分布的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物具有三種或更多種上述的改善的性能。最優選，根據本發明的實施方案的具有標準偏差小于大約22道爾頓的分子量分布的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物具有所有上述的改善性能。
根據本發明的另一個實施方案提供一種偶聯物的混合物，其中每個偶聯物包括與含有聚亞烷基二醇部分的寡聚體偶合的生長激素藥物，且所述混合物的分散系數(DC)大于10,000，其中
DC=(Σi=1nNiMi)2Σi=1nNiMi2Σi=1nNi-(Σi=1NNiMi)2]]>其中n為樣品中不同分子的數量；Ni為樣品中ith分子的數量；和Mi為ith分子的質量。
所述偶聯物的混合物優選其分散系數大于100,000。更優選，所述偶聯物的混合物的分散系數大于500,000，并最優選其分散系數大于10,000,000。變量n、Ni和Mi可以由本領域技術人員已知的不同的方法測定，這些方法包括但不限于以下實施例44所述的方法。
所述的生長激素藥物優選為人生長激素。但是，應該理解所述的生長激素藥物可以選自本領域技術人員已知的不同的生長激素藥物，例如它包括生長激素肽、生長激素肽類似物、生長激素肽片斷和生長激素肽片斷類似物。生長激素肽包括但不限于生長激素，人(hGH)；生長激素，豬；生長激素，牛；生長激素，雞；生長激素，大鼠；生長激素，小鼠；生長激素，綿羊；生長激素釋放因子，人；生長激素pro-釋放因子，人；生長激素釋放因子，小鼠；生長激素釋放因子，綿羊；生長激素釋放因子，大鼠；生長激素釋放因子，牛；生長激素釋放因子，豬；和生長激素釋放因子，雞。可以如上述通過取代生長激素肽上的一個或多個氨基酸而得到生長激素肽類似物。生長激素肽片斷包括但不限于生長激素1-43，人；生長激素6-13；生長激素釋放因子1-37，人；生長激素釋放因子1-40，人；生長激素釋放因子1-40，酰胺，人；生長激素釋放因子30-44，酰胺，人；生長激素釋放因子1-29，酰胺，大鼠；海沙瑞林(生長激素釋放六肽)；和生長激素釋放因子1-29，酰胺，人。生長激素肽片斷類似物包括但不限于[D-Ala2]-生長激素釋放因子1-29，酰胺，人；[N-Ac-Tyr1，D-Arg2]-生長激素釋放因子1-29，酰胺；[His1，Nle27]-生長激素釋放因子1-32，酰胺；生長激素釋放肽-6([His1，Lys6]-GHRP)和[D-Lys3]-GHRP-6。
所述的寡聚體可以是包含本領域技術人員已知的聚亞烷基二醇部分的不同的寡聚體。優選所述的聚亞烷基二醇部分具有至少2、3或4個聚亞烷基二醇亞基。更優選，所述的聚亞烷基二醇部分具有至少5或6個聚亞烷基二醇亞基。最優選所述的寡聚體的聚亞烷基二醇部分具有至少7個聚亞烷基二醇亞基。所述的寡聚體的聚亞烷基二醇部分優選為低級烷基聚亞烷基二醇部分如聚乙二醇部分、聚丙二醇部分或聚丁二醇部分。所述聚亞烷基二醇部分更優選為具有均一結構的聚丙二醇部分。具有均一的結構的聚丙二醇部分的一個實例如下 此均一的聚丙二醇結構可以描述為僅具有一個與聚丙二醇鏈上的每個氧原子相鄰的甲基取代的碳原子。這種均一的聚丙二醇部分可以表現出親脂和親水特征，因而用于在不使用親脂聚合物部分的情況下得到兩親型生長激素藥物-寡聚體偶聯物。而且，聚丙二醇部分的仲醇部分與生長激素藥物偶合可得到對酶如腸中發現的胰島素和胰凝乳蛋白酶導致的降解的抵抗力增大的生長激素藥物(例如人生長激素)。
根據本發明的實施方案的均一的聚丙二醇優選如圖11-13所示合成，現在將對其進行詳述。如圖11所示，1，2-丙二醇53與伯醇封端劑反應得到仲醇延長單體54。所述伯醇封端劑可以是本領域技術人員已知的不同的伯醇封端劑(包括但不限于甲硅烷基氯化合物如叔丁基聯苯甲硅烷基氯和叔丁基二甲基甲硅烷基氯)和酯化劑如AC2O。優選所述的伯醇封端劑為基本上不與仲醇反應的伯醇封端劑，例如叔丁基聯苯甲硅烷基氯或叔丁基二甲基甲硅烷基氯。所述的仲醇延長單體(54)可以與甲基磺酰氯(MeSO2Cl)反應得到伯醇延長單體甲磺酸酯55。
可選擇地，仲醇延長單體54可以與仲醇封端劑反應得到化合物56。所述仲醇封端劑可以是本領域技術人員已知的不同的仲醇封端劑，包括但不限于芐基氯。化合物56可以與B1解封劑反應以除去封端部分B1并得到伯醇延長單體57。所述B1解封劑可以選自本領域技術人員已知的不同的解封劑。當通過成酯將所述伯醇封端時，B1解封劑為脫酯劑，例如堿(例如碳酸鉀)。當使用甲硅烷基氯將伯醇封端時，B1解封劑優選為四丁基氟化銨(TBAF)。伯醇延長單體57可以與甲基磺酰氯反應得到仲醇延長單體甲磺酸酯58。
可以如下將伯醇延長單體54和仲醇延長單體57封端。仲醇延長單體54可以與封端劑反應得到化合物59。所述封端劑可以是本領域技術人員已知的不同的封端劑，包括但不限于烷基鹵如氯甲烷。化合物59可以與上述的B1解封劑反應得到伯醇封端單體60。伯醇封端單體60可以與甲基磺酰氯反應得到仲醇封端單體甲磺酸酯61。伯醇延長單體57可以與封端劑反應得到化合物62。所述封端劑可以是如上述的不同的封端劑。化合物62可以與B2解封劑反應以除去封端部分B2和得到仲醇封端單體63。所述B2解封劑可以是本領域技術人員已知的不同的解封劑，包括但不限于鈀/活性碳催化劑存在下的H2。所述仲醇封端單體可以與甲基磺酰氯反應得到伯醇封端單體甲磺酸酯64。雖然圖11所示的實施方案表示封端單體的合成，應該理解可以進行類似的反應以得到封端聚合物。
一般地，鏈延長可以通過以下方法進行使伯醇延長單體或聚合物如伯醇延長單體57與伯醇延長單體或聚合物甲磺酸酯如伯醇延長單體甲磺酸酯55反應得到不同的均一的聚丙烯鏈，或者使仲醇延長單體或聚合物如仲醇延長單體54與仲醇延長單體或聚合物甲磺酸酯如仲醇延長單體甲磺酸酯58反應。
例如在圖13中，伯醇延長單體甲磺酸酯55與伯醇延長單體57反應得到二聚物化合物65。可選擇地，仲醇延長單體甲磺酸酯58可以與仲醇延長單體54反應得到二聚物化合物65。可以使用上述的B1解封劑除去二聚物化合物65上的B1封端部分得到伯醇延長二聚物66。伯醇延長二聚物66可以與甲基磺酰氯反應得到仲醇延長二聚物甲磺酸酯67。可選擇地，可以使用上述的B2解封劑除去二聚物化合物65上的B2封端部分得到仲醇延長二聚物69。仲醇延長二聚物69可以與甲基磺酰氯反應得到伯醇延長二聚物甲磺酸酯70。
本領域技術人員已知，鏈延長過程可以重復進行以得到不同的其它鏈長度。例如如圖13所示，伯醇延長二聚物66可以與伯醇延長二聚物甲磺酸酯70反應得到四聚物化合物72。如圖13進一步顯示，一般的鏈延長反應路線包括伯醇延長單體或聚合物73與伯醇延長單體或聚合物甲磺酸酯74反應得到均一的聚丙烯聚合物75。m和n的值的范圍可以是0-1000，或者更優選m和n各自為0-50。雖然圖13所示的實施方案表示伯醇延長單體和/或聚合物與伯醇延長單體和/或聚合物甲磺酸酯，但應該理解可以使用仲醇延長單體和/或聚合物和仲醇延長單體和/或聚合物甲磺酸酯完成類似的反應。
伯醇延長單體或聚合物的末端或者伯醇延長單體或聚合物甲磺酸酯的末端可以分別與伯醇封端單體或聚合物甲磺酸酯或伯醇封端單體或聚合物反應得到封端的均一的聚丙烯鏈。例如，如圖12所示，伯醇延長二聚物甲磺酸酯70與伯醇封端單體60反應得到封端的(capped/blocked)伯醇延長三聚物71。本領域技術人員已知，可以除去B1封端部分，且所得的封端的伯醇延長三聚物可以與伯醇延長單體或聚合物甲磺酸酯反應以延長封端的三聚物71的鏈。
仲醇延長單體或聚合物的末端或者仲醇延長單體或聚合物的末端甲磺酸酯可以分別與仲醇封端單體或聚合物甲磺酸酯或仲醇封端單體或聚合物反應得到封端的均一的聚丙烯鏈。例如，如圖12所示，仲醇延長二聚物甲磺酸酯67與仲醇封端單體63反應得到封端的(capped/blocked)伯醇延長三聚物68。可以如以上所述除去所述的B2封端部分，且所得的封端的仲醇延長三聚物可以與仲醇延長鏈節甲磺酸酯反以延長封端的三聚物68的鏈。雖然圖12所示的合成表示二聚物與封端單體反應得到三聚物，但應該理解封端過程可以在均一的聚丙二醇部分的合成中的任何點進行，或者可選擇地，可以得到未被封端的均一的聚丙二醇部分。雖然圖12所示的實施方案表示通過使用封端單體進行合成而將聚丁烯寡聚體封端，應該理解本發明的聚丁烯寡聚體可以是使用以上圖11所述的封端劑而進行直接封端(即不加入封端單體)。
根據本發明的實施方案的均一的聚丙二醇部分可以通過本領域技術人員已知的不同的方法與生長激素藥物、親脂部分如羧酸和/或不同的其它部分偶合，這些方法包括但不限于這里關于聚乙二醇部分所述的方法。
所述的寡聚體可以包含一個或多個本領域技術人員已知的其它部分，包括不限于親水部分、親脂部分、間隔部分、接頭部分和末端部分。所述寡聚體中的不同的部分通過可水解或不可水解的鍵與另一寡聚體共價偶合。
所述寡聚體還可以包含一個或多個親水部分，包括但不限于糖、聚亞烷基二醇和聚胺/PEG共聚物。相鄰的聚亞烷基二醇部分考慮是相同的部分，如果它們通過醚鍵偶合并具有相同的烷基結構的話。例如，以下部分-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-是單一的具有6個聚乙二醇亞基的聚乙二醇部分。相鄰的聚亞烷基二醇部分認為是不同的部分，如果它們與除了醚鍵之外的鍵偶合或者它們具有不同的烷基結構。例如，以下部分 是具有4個乙二醇亞基的聚乙二醇部分和具有2個聚乙二醇亞基的親水部分。優選，根據本發明的寡聚體的的實施方案包含聚亞烷基二醇部分，并不進一步包含親水部分。
所述的寡聚體還可以包含一個或多個本領域技術人員已知的親脂部分。所述的親脂部分優選為飽和或不飽和、直鏈或支鏈烷基部分或飽和或不飽和、直鏈或支鏈脂肪酸部分。當所述的親脂部分為烷基部分時，優選直鏈、飽和或不飽和具有1-28個，更優選具有具有2-12個碳原子的碳原子的烷基部分。當所述的親脂部分為脂肪酸部分時，優選天然的脂肪酸是直鏈、天然脂肪酸部分，具有2-18個碳原子。更優選，所述脂肪酸部分具有3-14個碳原子。最優選所述脂肪酸部分具有至少4、5或6個碳原子。
所述寡聚體還可以包含一個或多個本領域技術人員已知的間隔部分。例如間隔部分可以用于分隔親水部分與親脂部分，用于分隔親脂部分或親水部分與生長激素藥物，用于分隔第一親水或親脂部分與第二親水或親脂部分，或用于分隔親水部分或親脂部分與接頭部分。間隔部分優選自糖、膽固醇和甘油部分。
所述的寡聚體還可以包含一個或多個用于將寡聚體與本領域技術人員已知的生長激素藥物偶合。優選接頭部分選自烷基和脂肪酸部分。
所述寡聚體還可以包含一個或多個處在不與生長激素藥物偶合的寡聚體的末端的末端部分。所述末端部分優選為烷基或烷氧基部分，更優選低級烷基或低級烷氧基部分。最優選所述的末端部分為甲基或甲氧基。雖然所述末端部分優選為烷基或烷氧基部分，但應該理解所述的末端部分可以是本領域技術人員已知的不同的部分，包括但不限于糖、膽固醇、醇和脂肪酸。
所述寡聚體優選與生長激素藥物共價偶合。在某些實施方案中，利用可水解的鍵(酯或碳酸酯鍵)將生長激素藥物與寡聚體偶合。可水解的偶合可以得到用作前藥的生長激素藥物-寡聚體偶聯物。例如在某些實施方案中，其中所述的生長激素藥物-寡聚體偶聯物無活性(即所述偶聯物缺乏通過生長激素藥物的主要作用機理而影響效果的能力)，可水解的偶合可以用于延時釋放或控釋效果。在一個或多個寡聚體從它們的各自的生長激素藥物-寡聚體偶聯物上裂解得到活性藥物時，可以在確定的時間內施用生長激素藥物。在其它實施方案中，利用不可水解的鍵(例如氨基甲酸酯、酰胺或醚鍵)將生長激素藥物與寡聚體偶合。當期望使生長激素藥物-寡聚體偶聯物在血流中進行長期，優選至少2小時的循環時，可以優選使用不可水解的鍵。當寡聚體與生長激素藥物共價偶合時，所述寡聚體還包含一個或多個用于與本領域技術人員已知的生長激素藥物的寡聚體共價偶合的鍵合部分。鍵合部分優選選自共價鍵、酯部分、碳酸酯部分、氨基甲酸酯部分、酰胺部分和仲胺部分。所述寡聚體上多于1個部分可以與生長激素藥物共價偶合。
雖然所述寡聚體優選與生長激素藥物共價偶合，但應該理解所述寡聚體可以與生長激素藥物非共價偶合形成非共價偶聯的生長激素藥物-寡聚體復合物。本領域技術人員已知，非共價偶合包括但不限于氫鍵、離子鍵、范德瓦爾斯鍵和膠束或脂質體包囊。本領域技術人員已知，根據本發明的實施方案，寡聚體可以被適宜構建、修飾和/或適宜地官能化以賦予以所選擇地方式進行非共價偶聯的能力(例如賦予氫鍵能力)。根據本發明的其它實施方案，寡聚體可以由不同的化合物的衍生，這些化合物包括但不限于氨基酸、寡肽、肽、膽汁酸、膽汁酸衍生物、脂肪酸、脂肪酸衍生物、水楊酸、水楊酸衍生物、氨基水楊酸和氨基水楊酸衍生物。所得的寡聚體可以與藥物分子、藥品和/或藥物賦形劑非共價偶合(復合)。所得的復合物優選具有平衡的親脂和親水性能。根據本發明的進一步的其它實施方案，寡聚體可以由胺和/或烷基胺衍生。在適宜的酸性條件下，所得的寡聚體可以與藥物分子、藥品和/或藥物賦形劑形成非共價偶聯的復合物。由這種復合作用得到的產品優選具有平衡的親脂和親水性能。
多于一個寡聚體(即多個寡聚體)可以與生長激素藥物偶合。多數的寡聚體優選相同。但是，應該理解多數寡聚體可以彼此不同，或者可選擇地，多數寡聚體中有一些可以相同而有一些可以不同。當多個寡聚體與生長激素藥物偶合時，可以優選將一個或多個寡聚體與具有可水解的鍵的生長激素藥物偶合和將一個或多個寡聚體與具有不可水解的鍵的生長激素藥物偶合。可選擇地，所有將多數寡聚體與生長激素藥物偶合的鍵可以是可水解的，但具有不同的水解程度，因而例如一個或多個寡聚體通過在體內水解而快速地從生長激素藥物上除去和一個或多個寡聚體通過在體內水解而緩慢地從生長激素藥物上除去。
所述寡聚體可以在藥物的不同親核殘基上與生長激素藥物偶合，所述親核殘基包括但不限于親核羥基官能團和/或氨基官能團。例如，親核羥基官能團可以見于絲氨酸和/或酪氨酸殘基，而親核氨基官能團可以見于組氨酸和/或賴氨酸殘基和/或一個或多個多肽的N-末端。當寡聚體與一個或多個生長激素多肽的N-末端偶合時，所述偶合優選形成仲胺。例如，當所述生長激素藥物為人生長激素時，所述寡聚體可以是與Phe1、Lys38、Lys41、Lys70、Lys115、Lys140、Lys145、Lys158、Lys168和/或Lys172的氨基官能團偶合。
可以由不同的方法合成分散系數大于10,000的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物。例如，通過以下方法合成由羧酸和聚乙二醇組成的分散系數大于10,000的寡聚體的混合物使分散系數大于10,000的羧酸的混合物與分散系數大于10,000的聚乙二醇的混合物在足以得到分散系數大于10,000的寡聚體的混合物的條件下接觸。然后將分散系數大于10,000的混合物的寡聚體活化，從而使它們能夠與生長激素藥物反應得到生長激素藥物-寡聚體偶聯物。用于得到分散系數大于10,000的活化的寡聚體的混合物的合成路線的一個實施方案如圖3所示，并如以下的實施例11-18所述。用于得到分散系數大于10,000的活化的寡聚體的混合物的合成路線的另一個實施方案如圖4所示，并如以下的實施例19-24所述。用于得到分散系數大于10,000的活化的寡聚體的混合物的合成路線的另一個實施方案如圖5所示，并如以下的實施例25-29所述。用于得到分散系數大于10,000的活化的寡聚體的混合物的合成路線的另一個實施方案如圖6所示，并如以下實施例30-31所述。用于得到分散系數大于10,000的活化的寡聚體的混合物的合成路線的另一個實施方案如圖7所示，并如以下的實施例32-37所述。用于得到分散系數大于10,000的活化的寡聚體的混合物的合成路線的另一個實施方案如圖8所示，并如以下的實施例38所述。用于得到分散系數大于10,000的活化的寡聚體的混合物的合成路線的另一個實施方案如圖9所示，并如以下的實施例39所述。用于得到分散系數大于10,000的活化的寡聚體的混合物的合成路線的另一個實施方案如圖10所示，并如以下的實施例40所述。
將分散系數大于10,000的活化的寡聚體的混合物與分散系數大于10,000的生長激素藥物的混合物在足以得到生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物的條件下反應。合成實例如以下實施例40-42所述。本領域技術人員已知，可以控制反應條件(例如所選擇的摩爾比、溶劑混合物和/或pH)以使由分散系數大于10,000的活化的寡聚體的混合物和分散系數大于10,000的生長激素藥物的混合物反應得到的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物是分散系數大于10,000的混合物。例如，可以通過將反應溶液的pH保持在賴氨酸的pKa以下而抑制在賴氨酸的氨基官能團上的偶聯。可選擇地，所述的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物可以利用HPLC分離(separated和isolated)得到分散系數大于10,000的一、二或三偶聯物。可以利用本領域技術人員已知的不同的技術測定和/或檢驗特定的分離的偶聯物的偶聯程度(例如所分離的分子為一、二或三偶聯物)，這些技術包括但不限于質譜。可以利用本領域技術人員已知的不同的技術測定和/或檢驗特定的偶聯物結構(例如所述寡聚體處在人生長激素一偶聯物的Phe1、Lys38、Lys41、Lys70、Lys115、Lys140、Lys145、Lys158、Lys168或Lys172)，這些技術包括但不限于序列分析、肽圖分析、選擇性酶切和/或內肽酶切割。
本領域技術人員已知，例如可以通過使生長激素藥物與適宜的封端劑如N-叔丁氧基羰基(t-BOC)或N-(9-芴基甲氧基羰基)(N-FMOC)反應而將生長激素藥物上的一個或多個反應部位封端。例如在所述的生長激素藥物為多肽并期望形成在多肽的一個或多個N-末端具有一個或多個寡聚體的不飽和的偶聯物(即并非所有的親核殘基被偶聯)時可以優選這種方法。在進行這種封端之后，分散系數大于10,000的封端的生長激素藥物的混合物可以與分散系數大于10,000的活化的寡聚體的混合物反應得到具有與一個或多個親核殘基偶合的寡聚體和具有與其它親核殘基偶合的封端部分的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物。本領域技術人員已知，在偶聯反應之后可以將生長激素藥物-寡聚體偶聯物解封。如果需要的話，然后可以如上述分離所述的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物得到分散系數大于10,000的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物。可選擇地，可以在解封之前分離所述的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物。
根據本發明的實施方案的分散系數大于10,000的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物優選具有比常規混合物改善的性能。例如，分散系數大于10,000的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物優選其體內活性大于具有與分散系數大于10,000的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物相同的數均分子量的多分散的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物的體內活性。本領域技術人員已知，可以通過不同的方法測定分散系數大于10,000的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物的數均分子量和多分散的混合物的數均分子量，這些方法包括不但不限于體積排阻色譜法，例如H.R.Allcock & F.W.Lampe，CONTEMPORARYPOLYMER CHEMISTRY 394-402(第二版，1991)所述的凝膠滲透色譜法。
作為另一個實例，分散系數大于10,000的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物優選其體外活性大于具有與分散系數大于10,000的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物相同的數均分子量的多分散的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物的體外活性。本領域技術人員已知，可以通過不同的方法測定分散系數大于10,000的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物的數均分子量和多分散的混合物的數均分子量，這些方法包括不但不限于體積排阻色譜法。
本領域技術人員已知，可以通過不同的方法測定特定的混合物的體外活性。優選使用從Molecular Devices Corporation of Sunnyvale，California商購的Cytosensort微生理機能測定儀測定體外活性。所述微生理機能測定儀監測對被加到在Transwell中培養的細胞的藥物作出反應而發生的細胞外酸化速率的細微變化。這種反應與研究的分子的活性成比例。
作為另一個實例，當與具有與分散系數大于10,000的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物相同的數均分子量的多分散的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物對胰凝乳蛋白酶降解的抵抗力相比時，分散系數大于10,000的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物對胰凝乳蛋白酶降解的抵抗力增大。本領域技術人員已知，分散系數大于10,000的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物的數均分子量和多分散的混合物的數均分子量可以通過不同的方法測定，這些方法包括不但不限于體積排阻色譜法。
作為另一個實例，分散系數大于10,000的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物優選其受試者間的差異性小于具有與分散系數大于10,000的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物相同的數均分子量的多分散的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物的受試者間的差異性。本領域技術人員已知，分散系數大于10,000的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物的數均分子量和多分散的混合物的數均分子量可以通過不同的方法測定，這些方法包括不但不限于體積排阻色譜法。可以通過本領域技術人員已知的不同的方法測定受試者間的差異性。優選如下計算受試者間的差異性。測定每名受試者的劑量反應曲線下的面積(AUC)(即劑量反應曲線和基線值之間的面積)。所有受試者的平均AUC通過計算每名受試者的AUC并將此總和除去受試者的數量來確定。然后對每名受試者測定受試者的AUC和平均AUC之間的差異的絕對值。然后計算所得的差異的絕對值的總和得到代表受試者間的差異性的值。較低的值代表較低的受試者間的差異性，而較高的值代表較高的受試者間的差異性。
根據本發明的實施方案的分散系數大于10,000的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物優選具有二種或更多種上述的改善性能。更優選，根據本發明的實施方案的分散系數大于10,000的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物具有三種或更多種上述的改善性能。最優選根據本發明的實施方案的分散系數大于10,000的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物具有所有4種上述的改善性能。
根據本發明的其它實施方案，在偶聯物的混合物中，每個偶聯物包括與寡聚體偶合的生長激素藥物并具有相同數量的聚亞烷基二醇亞基。
所述的生長激素藥物優選為人生長激素。但是，應該理解所述的生長激素藥物可以選自不同的本領域技術人員已知的生長激素藥物，例如它包括但不限于生長激素肽、生長激素肽類似物、生長激素肽片斷和生長激素肽片斷類似物。生長激素肽包括但不限于生長激素，人(hGH)；生長激素，豬；生長激素，牛；生長激素，雞；生長激素，大鼠；生長激素，小鼠；生長激素，綿羊；生長激素釋放因子，人；生長激素pro-釋放因子，人；生長激素釋放因子，小鼠；生長激素釋放因子，綿羊；生長激素釋放因子，大鼠；生長激素釋放因子，牛；生長激素釋放因子，豬；和生長激素釋放因子，雞。生長激素肽類似物可以如上述通過取代生長激素肽上的一個或多個氨基酸而得到。生長激素肽片斷包括但不限于生長激素1-43，人；生長激素6-13；生長激素釋放因子1-37，人；生長激素釋放因子1-40，人；生長激素釋放因子1-40，酰胺，人；生長激素釋放因子30-44，酰胺，人；生長激素釋放因子1-29，酰胺，大鼠；海沙瑞林(生長激素釋放六肽)；和生長激素釋放因子1-29，酰胺，人。生長激素肽片斷類似物包括但不限于[D-Ala2]-生長激素釋放因子1-29，酰胺，人；[N-Ac-Tyr1，D-Arg2]-生長激素釋放因子1-29，酰胺；[His1，Nle27]-生長激素釋放因子1-32，酰胺；生長激素釋放肽-6([His1，Lys6]-GHRP)和[D-Lys3]-GHRP-6。
所述的寡聚體可以是包含本領域技術人員已知的聚亞烷基二醇部分的不同的寡聚體。優選所述的聚亞烷基二醇部分具有至少2、3或4個聚亞烷基二醇亞基。更優選，所述的聚亞烷基二醇部分具有至少5或6個聚亞烷基二醇亞基。最優選所述的寡聚體的聚亞烷基二醇部分具有至少7個聚亞烷基二醇亞基。所述的寡聚體的聚亞烷基二醇部分優選為低級烷基聚亞烷基二醇部分如聚乙二醇部分、聚丙二醇部分或聚丁二醇部分。所述聚亞烷基二醇部分更優選為具有均一結構的聚丙二醇部分。具有均一的結構的聚丙二醇部分的一個實例如下 此均一的聚丙二醇結構可以描述為僅具有一個與聚丙二醇鏈上的每個氧原子相鄰的甲基取代的碳原子。這種均一的聚丙二醇部分可以表現出親脂和親水特征，因而用于在不使用親脂聚合物部分的情況下得到兩親型生長激素藥物-寡聚體偶聯物。而且，聚丙二醇部分的仲醇部分與生長激素藥物偶合可得到對酶如腸中發現的胰島素和胰凝乳蛋白酶導致的降解的抵抗力增大的生長激素藥物(例如人生長激素)。
根據本發明的實施方案的均一的聚丙二醇優選如圖11-13所示合成，現在將對其進行詳述。如圖11所示，1，2-丙二醇53與伯醇封端劑反應得到仲醇延長單體54。所述伯醇封端劑可以是本領域技術人員已知的不同的伯醇封端劑(包括但不限于甲硅烷基氯化合物如叔丁基聯苯甲硅烷基氯和叔丁基二甲基甲硅烷基氯)和酯化劑如AC2O。優選所述的伯醇封端劑為基本上不與仲醇反應的伯醇封端劑，例如叔丁基聯苯甲硅烷基氯或叔丁基二甲基甲硅烷基氯。所述的仲醇延長單體(54)可以與甲基磺酰氯(MeSO2Cl)反應得到伯醇延長單體甲磺酸酯55。
可選擇地，仲醇延長單體54可以與仲醇封端劑反應得到化合物56。所述仲醇封端劑可以是本領域技術人員已知的不同的仲醇封端劑，包括但不限于芐基氯。化合物56可以與B1解封劑反應以除去封端部分B1并得到伯醇延長單體57。所述B1解封劑可以選自本領域技術人員已知的不同的解封劑。當通過成酯將所述伯醇封端時，B1解封劑為脫酯劑，例如堿(例如碳酸鉀)。當使用甲硅烷基氯將伯醇封端時，B1解封劑優選為四丁基氟化銨(TBAF)。伯醇延長單體57可以與甲基磺酰氯反應得到仲醇延長單體甲磺酸酯58。
可以如下將伯醇延長單體54和仲醇延長單體57封端。仲醇延長單體54可以與封端劑反應得到化合物59。所述封端劑可以是本領域技術人員已知的不同的封端劑，包括但不限于烷基鹵如氯甲烷。化合物59可以與上述的B1解封劑反應得到伯醇封端單體60。伯醇封端單體60可以與甲基磺酰氯反應得到仲醇封端單體甲磺酸酯61。伯醇延長單體57可以與封端劑反應得到化合物62。所述封端劑可以是如上述的不同的封端劑。化合物62可以與B2解封劑反應以除去封端部分B2和得到仲醇封端單體63。所述B2解封劑可以是本領域技術人員已知的不同的解封劑，包括但不限于鈀/活性碳催化劑存在下的H2。所述仲醇封端單體可以與甲基磺酰氯反應得到伯醇封端單體甲磺酸酯64。雖然圖11所示的實施方案表示封端單體的合成，應該理解可以進行類似的反應以得到封端聚合物。
一般地，鏈延長可以通過以下方法進行使伯醇延長單體或聚合物如伯醇延長單體57與伯醇延長單體或聚合物甲磺酸酯如伯醇延長單體甲磺酸酯55反應得到不同的均一的聚丙烯鏈，或者使仲醇延長單體或聚合物如仲醇延長單體54與仲醇延長單體或聚合物甲磺酸酯如仲醇延長單體甲磺酸酯58反應。
例如在圖13中，伯醇延長單體甲磺酸酯55與伯醇延長單體57反應得到二聚物化合物65。可選擇地，仲醇延長單體甲磺酸酯58可以與仲醇延長單體54反應得到二聚物化合物65。可以使用上述的B1解封劑除去二聚物化合物65上的B1封端部分得到伯醇延長二聚物66。伯醇延長二聚物66可以與甲基磺酰氯反應得到仲醇延長二聚物甲磺酸酯67。可選擇地，可以使用上述的B2解封劑除去二聚物化合物65上的B2封端部分得到仲醇延長二聚物69。仲醇延長二聚物69可以與甲基磺酰氯反應得到伯醇延長二聚物甲磺酸酯70。
本領域技術人員已知，鏈延長過程可以重復進行以得到不同的其它鏈長度。例如如圖13所示，伯醇延長二聚物66可以與伯醇延長二聚物甲磺酸酯70反應得到四聚物化合物72。如圖13進一步顯示，一般的鏈延長反應路線包括伯醇延長單體或聚合物73與伯醇延長單體或聚合物甲磺酸酯74反應得到均一的聚丙烯聚合物75。m和n的值的范圍可以是0-1000，或者更優選m和n各自為0-50。雖然圖13所示的實施方案表示伯醇延長單體和/或聚合物與伯醇延長單體和/或聚合物甲磺酸酯，但應該理解可以使用仲醇延長單體和/或聚合物和仲醇延長單體和/或聚合物甲磺酸酯完成類似的反應。
伯醇延長單體或聚合物的末端或者伯醇延長單體或聚合物甲磺酸酯的末端可以分別與伯醇封端單體或聚合物甲磺酸酯或伯醇封端單體或聚合物反應得到封端的均一的聚丙烯鏈。例如，如圖12所示，伯醇延長二聚物甲磺酸酯70與伯醇封端單體60反應得到封端的(capped/blocked)伯醇延長三聚物71。本領域技術人員已知，可以除去B1封端部分，且所得的封端的伯醇延長三聚物可以與伯醇延長單體或聚合物甲磺酸酯反應以延長封端的三聚物71的鏈。
仲醇延長單體或聚合物的末端或者仲醇延長單體或聚合物的末端甲磺酸酯可以分別與仲醇封端單體或聚合物甲磺酸酯或仲醇封端單體或聚合物反應得到封端的均一的聚丙烯鏈。例如，如圖12所示，仲醇延長二聚物甲磺酸酯67與仲醇封端單體63反應得到封端的(capped/blocked)伯醇延長三聚物68。可以如以上所述除去所述的B2封端部分，且所得的封端的仲醇延長三聚物可以與仲醇延長鏈節甲磺酸酯反以延長封端的三聚物68的鏈。雖然圖12所示的合成表示二聚物與封端單體反應得到三聚物，但應該理解封端過程可以在均一的聚丙二醇部分的合成中的任何點進行，或者可選擇地，可以得到未被封端的均一的聚丙二醇部分。雖然圖12所示的實施方案表示通過使用封端單體進行合成而將聚丁烯寡聚體封端，應該理解本發明的聚丁烯寡聚體可以是使用以上圖11所述的封端劑而進行直接封端(即不加入封端單體)。
根據本發明的實施方案的均一的聚丙二醇部分可以通過本領域技術人員已知的不同的方法與生長激素藥物、親脂部分如羧酸和/或不同的其它部分偶合，這些方法包括但不限于這里關于聚乙二醇部分所述的方法。
所述的寡聚體可以包含一個或多個本領域技術人員已知的其它部分，包括不限于親水部分、親脂部分、間隔部分、接頭部分和末端部分。所述寡聚體中的不同的部分通過可水解或不可水解的鍵與另一寡聚體共價偶合。
所述寡聚體還可以包含一個或多個親水部分，包括但不限于糖、聚亞烷基二醇和聚胺/PEG共聚物。相鄰的聚亞烷基二醇部分考慮是相同的部分，如果它們通過醚鍵偶合并具有相同的烷基結構的話。例如，以下部分-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-O-C2H4-是單一的具有6個聚乙二醇亞基的聚乙二醇部分。相鄰的聚亞烷基二醇部分認為是不同的部分，如果它們與除了醚鍵之外的鍵偶合或者它們具有不同的烷基結構。例如，以下部分 是具有4個乙二醇亞基的聚乙二醇部分和具有2個聚乙二醇亞基的親水部分。優選，根據本發明的寡聚體的的實施方案包含聚亞烷基二醇部分，并不進一步包含親水部分。
所述的寡聚體還可以包含一個或多個本領域技術人員已知的親脂部分。所述的親脂部分優選為飽和或不飽和、直鏈或支鏈烷基部分或飽和或不飽和、直鏈或支鏈脂肪酸部分。當所述的親脂部分為烷基部分時，優選直鏈、飽和或不飽和具有1-28個，更優選具有具有2-12個碳原子的碳原子的烷基部分。當所述的親脂部分為脂肪酸部分時，優選天然的脂肪酸是直鏈、天然脂肪酸部分，具有2-18個碳原子。更優選，所述脂肪酸部分具有3-14個碳原子。最優選所述脂肪酸部分具有至少4、5或6個碳原子。
所述寡聚體還可以包含一個或多個本領域技術人員已知的間隔部分。例如間隔部分可以用于分隔親水部分與親脂部分，用于分隔親脂部分或親水部分與生長激素藥物，用于分隔第一親水或親脂部分與第二親水或親脂部分，或用于分隔親水部分或親脂部分與接頭部分。間隔部分優選自糖、膽固醇和甘油部分。
所述的寡聚體還可以包含一個或多個用于將寡聚體與本領域技術人員已知的生長激素藥物偶合。優選接頭部分選自烷基和脂肪酸部分。
所述寡聚體還可以包含一個或多個處在不與生長激素藥物偶合的寡聚體的末端的末端部分。所述末端部分優選為烷基或烷氧基部分，更優選低級烷基或低級烷氧基部分。最優選所述的末端部分為甲基或甲氧基。雖然所述末端部分優選為烷基或烷氧基部分，但應該理解所述的末端部分可以是本領域技術人員已知的不同的部分，包括但不限于糖、膽固醇、醇和脂肪酸。
所述寡聚體優選與生長激素藥物共價偶合。在某些實施方案中，利用可水解的鍵(酯或碳酸酯鍵)將生長激素藥物與寡聚體偶合。可水解的偶合可以得到用作前藥的生長激素藥物-寡聚體偶聯物。例如在某些實施方案中，其中所述的生長激素藥物-寡聚體偶聯物無活性(即所述偶聯物缺乏通過生長激素藥物的主要作用機理而影響效果的能力)，可水解的偶合可以用于延時釋放或控釋效果。在一個或多個寡聚體從它們的各自的生長激素藥物-寡聚體偶聯物上裂解得到活性藥物時，可以在確定的時間內施用生長激素藥物。在其它實施方案中，利用不可水解的鍵(例如氨基甲酸酯、酰胺或醚鍵)將生長激素藥物與寡聚體偶合。當期望使生長激素藥物-寡聚體偶聯物在血流中進行長期，優選至少2小時的循環時，可以優選使用不可水解的鍵。當寡聚體與生長激素藥物共價偶合時，所述寡聚體還包含一個或多個用于與本領域技術人員已知的生長激素藥物的寡聚體共價偶合的鍵合部分。鍵合部分優選選自共價鍵、酯部分、碳酸酯部分、氨基甲酸酯部分、酰胺部分和仲胺部分。所述寡聚體上多于1個部分可以與生長激素藥物共價偶合。
雖然所述寡聚體優選與生長激素藥物共價偶合，但應該理解所述寡聚體可以與生長激素藥物非共價偶合形成非共價偶聯的生長激素藥物-寡聚體復合物。本領域技術人員已知，非共價偶合包括但不限于氫鍵、離子鍵、范德瓦爾斯鍵和膠束或脂質體包囊。本領域技術人員已知，根據本發明的實施方案，寡聚體可以被適宜構建、修飾和/或適宜地官能化以賦予以所選擇地方式進行非共價偶聯的能力(例如賦予氫鍵能力)。根據本發明的其它實施方案，寡聚體可以由不同的化合物的衍生，這些化合物包括但不限于氨基酸、寡肽、肽、膽汁酸、膽汁酸衍生物、脂肪酸、脂肪酸衍生物、水楊酸、水楊酸衍生物、氨基水楊酸和氨基水楊酸衍生物。所得的寡聚體可以與藥物分子、藥品和/或藥物賦形劑非共價偶合(復合)。所得的復合物優選具有平衡的親脂和親水性能。根據本發明的進一步的其它實施方案，寡聚體可以由胺和/或烷基胺衍生。在適宜的酸性條件下，所得的寡聚體可以與藥物分子、藥品和/或藥物賦形劑形成非共價偶聯的復合物。由這種復合作用得到的產品優選具有平衡的親脂和親水性能。
多于一個寡聚體(即多個寡聚體)可以與生長激素藥物偶合。多數的寡聚體優選相同。但是，應該理解多數寡聚體可以彼此不同，或者可選擇地，多數寡聚體中有一些可以相同而有一些可以不同。當多個寡聚體與生長激素藥物偶合時，可以優選將一個或多個寡聚體與具有可水解的鍵的生長激素藥物偶合和將一個或多個寡聚體與具有不可水解的鍵的生長激素藥物偶合。可選擇地，所有將多數寡聚體與生長激素藥物偶合的鍵可以是可水解的，但具有不同的水解程度，因而例如一個或多個寡聚體通過在體內水解而快速地從生長激素藥物上除去和一個或多個寡聚體通過在體內水解而緩慢地從生長激素藥物上除去。
所述寡聚體可以在藥物的不同親核殘基上與生長激素藥物偶合，所述親核殘基包括但不限于親核羥基官能團和/或氨基官能團。例如，親核羥基官能團可以見于絲氨酸和/或酪氨酸殘基，而親核氨基官能團可以見于組氨酸和/或賴氨酸殘基和/或一個或多個多肽的N-末端。當寡聚體與一個或多個生長激素多肽的N-末端偶合時，所述偶合優選形成仲胺。例如，當所述生長激素藥物為人生長激素時，所述寡聚體可以是與Phe1、Lys38、Lys41、Lys70、Lys115、Lys140、Lys145、Lys158、Lys168和/或Lys172的氨基官能團偶合。
可以通過不同的方法合成其中的每個偶聯物具有相同數量的聚乙二醇亞基的生長激素藥物寡聚體偶聯物的混合物。例如，通過以下方法合成羧酸和聚乙二醇組成的寡聚體的混合物，其中所述混合物中的每個寡聚體具有相同數量的聚乙二醇亞基使羧酸的混合物與其中的每個聚乙二醇分子具有相同數量的聚乙二醇亞基的聚乙二醇的混合物在足以得到其中的每個寡聚體具有相同數量的聚乙二醇亞基的寡聚體的混合物的條件下接觸。然后將其中的每個寡聚體具有相同數量的聚乙二醇亞基的混合物中的寡聚體活化，從而使它們能夠與生長激素藥物得到生長激素藥物-寡聚體偶聯物反應。用于得到其中的每個寡聚體具有相同數量的聚乙二醇亞基的活化的寡聚體的混合物的合成路線的一個實施方案如圖3所示，并如以下的實施例11-18所述。用于得到其中的每個寡聚體具有相同數量的聚乙二醇亞基的活化的寡聚體的混合物的混合物的合成路線的另一個實施方案如圖4所示，并如以下的實施例19-24所述。用于得到其中的每個寡聚體具有相同數量的聚乙二醇亞基的活化的寡聚體的混合物的混合物的合成路線的另一個實施方案如圖5所示，并如以下的實施例25-29所述。用于得到其中的每個寡聚體具有相同數量的聚乙二醇亞基的活化的寡聚體的混合物的混合物的合成路線的另一個實施方案如圖6所示，并如以下的實施例30-31所述。用于得到其中的每個寡聚體具有相同數量的聚乙二醇亞基的活化的寡聚體的混合物的混合物的合成路線的另一個實施方案如圖7所示，并如以下的實施例32-37所述。用于得到其中的每個寡聚體具有相同數量的聚乙二醇亞基的活化的寡聚體的混合物的混合物的合成路線的另一個實施方案如圖8所示，并如以下的實施例38所述。用于得到其中的每個寡聚體具有相同數量的聚乙二醇亞基的活化的寡聚體的混合物的混合物的合成路線的另一個實施方案如圖9所示，并如以下的實施例39所述。用于得到其中的每個寡聚體具有相同數量的聚乙二醇亞基的活化的寡聚體的混合物的混合物的合成路線的另一個實施方案如圖10所示，并如以下的實施例40所述。
所述的其中的每個寡聚體具有相同數量的聚乙二醇亞基的活化的寡聚體的混合物與生長激素藥物的混合物在足以得到生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物的條件下反應。合成的實例如以下實施例40-42所述。本領域技術人員已知，可以控制反應條件(例如所選擇的摩爾比，溶劑混合物和/或pH)以使由其中的每個寡聚體具有相同數量的聚乙二醇亞基的活化的寡聚體的混合物和生長激素藥物的混合物反應得到的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物是其中的每個偶聯物具有相同數量的聚乙二醇亞基的偶聯物的混合物。例如，可以通過將反應溶液的pH保持在賴氨酸的pKa下以下而抑制賴氨酸的氨基官能團處的偶聯。可選擇地，可以利用HPLC分離(separated和isolated)生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物得到生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物，例如一、二或三偶聯物，其中所述混合物中的每個偶聯物具有相同數量的聚乙二醇亞基。可以利用本領域技術人員已知的不同的技術測定和/或檢驗特定的分離的偶聯物的偶聯程度(例如所分離的分子為一、二或三偶聯物)，這些技術包括但不限于質譜。可以利用本領域技術人員已知的不同的技術測定和/或檢驗特定的偶聯物結構(例如所述寡聚體處在人生長激素一偶聯物的Phe1、Lys38、Lys41、Lys70、Lys115、Lys140、Lys145、Lys158、Lys168或Lys172)，這些技術包括但不限于序列分析、肽圖分析、選擇性酶切和/或內肽酶切割。
本領域技術人員已知，例如可以通過使生長激素藥物與適宜的封端劑如N-叔丁氧基羰基(t-BOC)或N-(9-芴基甲氧基羰基)(N-FMOC)反應而將生長激素藥物上的一個或多個反應部位封端。例如在所述的生長激素藥物為多肽并期望形成在多肽的一個或多個N-末端具有一個或多個寡聚體的不飽和的偶聯物(即并非所有的親核殘基被偶聯)時可以優選這種方法。在進行這種封端之后，可以使封端的生長激素藥物的混合物與其中的每個寡聚體具有相同數量的聚乙二醇亞基的活化的寡聚體的混合物反應得到具有與一個或多個親核殘基偶合的寡聚體和具有與親核殘基偶合的封端部分的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物。本領域技術人員已知，在偶聯反應之后可以將生長激素藥物-寡聚體偶聯物解封。如果需要的話，然后可以如上述分離所述的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物得到所述的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物(其中混合物中的每個寡聚體具有相同數量的聚乙二醇亞基)。可選擇地，可以在解封之前分離所述的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物。
根據本發明的實施方案的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物(其中混合物中的每個寡聚體具有相同數量的聚乙二醇亞基)優選具有比常規的混合物改善的性能。例如，所述的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物(其中混合物中的每個寡聚體具有相同數量的聚乙二醇亞基)優選其體內活性大于具有與所述的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物(其中混合物中的每個寡聚體具有相同數量的聚乙二醇亞基)相同的數均分子量的多分散的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物的體內活性。本領域技術人員已知，所述的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物(其中混合物中的每個寡聚體具有相同數量的聚乙二醇亞基)的數均分子量和多分散的混合物的數均分子量可以通過不同的方法測定，這些方法包括不但不限于體積排阻色譜法，例如H.R.Allcock & F.W.Lampe，CONTEMPORARY POLYMER CHEMISTRY 394-402(第二版，1991)所述的凝膠滲透色譜法。
作為另一個實施例，所述的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物(其中混合物中的每個寡聚體具有相同數量的聚乙二醇亞基)優選其體外活性大于具有與所述的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物(其中混合物中的每個寡聚體具有相同數量的聚乙二醇亞基)相同的數均分子量的多分散的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物的體外活性。本領域技術人員已知，所述的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物(其中混合物中的每個寡聚體具有相同數量的聚乙二醇亞基)的數均分子量和多分散的混合物的數均分子量可以通過不同的方法測定，這些方法包括不但不限于體積排阻色譜法。
本領域技術人員已知，可以通過不同的方法測定特定的混合物的體外活性。優選使用從Molecular Devices Corporation of Sunnyvale，California商購的Cytosensort微生理機能測定儀測定體外活性。所述微生理機能測定儀監測對被加到在Transwell中培養的細胞的藥物作出反應而發生的細胞外酸化速率的細微變化。這種反應與研究的分子的活性成比例。
作為另一個實例，同具有與生長激素藥物寡聚體偶聯物的混合物(其中混合物中的每個偶聯物具有相同數量的聚乙二醇亞基)相同數均分子量的多分散的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物對胰凝乳蛋白酶的降解的抵抗力相比，根據本發明的其它實施方案的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物(其中混合物中的每個寡聚體具有相同數量的聚乙二醇亞基)對胰凝乳蛋白酶的降解的抵抗力增大。
本領域技術人員已知，所述的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物(其中混合物中的每個寡聚體具有相同數量的聚乙二醇亞基)的數均分子量和多分散的混合物的數均分子量可以通過不同的方法測定，這些方法包括不但不限于體積排阻色譜法。
作為另一個實例，根據本發明的其它實施方案的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物(其中混合物中的每個偶聯物具有相同數量的聚乙二醇亞基)的受試者間的差異性小于具有與生長激素藥物寡聚體偶聯物的混合物(其中混合物中的每個偶聯物具有相同數量的聚乙二醇亞基)相同數均分子量的多分散的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物的受試者間的差異性。本領域技術人員已知，所述的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物(其中混合物中的每個寡聚體具有相同數量的聚乙二醇亞基)的數均分子量和多分散的混合物的數均分子量可以通過不同的方法測定，這些方法包括不但不限于體積排阻色譜法。可以通過本領域技術人員已知的不同的方法測定受試者間的差異性。優選如下計算受試者間的差異性。測定每名受試者的劑量反應曲線下的面積(AUC)(即劑量反應曲線和基線值之間的面積)。所有受試者的平均AUC通過計算每名受試者的AUC并將此總和除去受試者的數量來確定。然后對每名受試者測定受試者的AUC和平均AUC之間的差異的絕對值。然后計算所得的差異的絕對值的總和得到代表受試者間的差異性的值。較低的值代表較低的受試者間的差異性，而較高的值代表較高的受試者間的差異性。
根據本發明的實施方案的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物(其中混合物中的每個寡聚體具有相同數量的聚乙二醇亞基)優選具有二種或更多種以上所述的改善性能。更優選，根據本發明的實施方案的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物(其中混合物中的每個寡聚體具有相同數量的聚乙二醇亞基)具有三個或更多個上述的改善性能。最優選，根據本發明的實施方案的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物(其中混合物中的每個寡聚體具有相同數量的聚乙二醇亞基)具有所有上述的的改善性能。
根據本發明的其它實施方案得到一種偶聯物的混合物，其中每個偶聯物具有相同的分子量并具有下式生長激素藥物 其中其中B為鍵合部分；L為接頭部分；G、G′和G″為獨立選擇的間隔部分；R為親脂部分而R′為聚亞烷基二醇部分，或者R′為親脂部分而R為聚亞烷基二醇部分；T為末端部分；h、i、j、k、m和n獨立地為0或1，附帶條件是當R為聚亞烷基二醇部分時，m為1；當R′為聚亞烷基二醇部分時，n為1；和p為1至生長激素藥物上親核殘基數的整數。
所述的生長激素藥物優選為人生長激素。但是，應該理解所述的生長激素藥物可以選自本領域技術人員已知的不同的生長激素藥物，例如它包括但不限于生長激素肽、生長激素肽類似物、生長激素肽片斷和生長激素肽片斷類似物。生長激素肽包括但不限于生長激素，人(hGH)；生長激素，豬；生長激素，牛；生長激素，雞；生長激素，大鼠；生長激素，小鼠；生長激素，綿羊；生長激素釋放因子，人；生長激素pro-釋放因子，人；生長激素釋放因子，小鼠；生長激素釋放因子，綿羊；生長激素釋放因子，大鼠；生長激素釋放因子，牛；生長激素釋放因子，豬；和生長激素釋放因子，雞。可以如上述通過取代生長激素肽中的一個或多個氨基酸而得到生長激素肽類似物。生長激素肽片斷包括但不限于生長激素1-43，人；生長激素6-13；生長激素釋放因子1-37，人；生長激素釋放因子1-40，人；生長激素釋放因子1-40，酰胺，人；生長激素釋放因子30-44，酰胺，人；生長激素釋放因子1-29，酰胺，大鼠；海沙瑞林(生長激素釋放六肽)；和生長激素釋放因子1-29，酰胺，人。生長激素肽片斷類似物包括但不限于[D-Ala2]-生長激素釋放因子1-29，酰胺，人；[N-Ac-Tyr’，D-Arg2]-生長激素釋放因子1-29，酰胺；[His’，Nle27]-生長激素釋放因子1-32，酰胺；生長激素釋放肽-6([His’，Lys6]-GHRP)；和[D-Lys3]-GHRP-6。
根據本發明的這些實施方案，R或R′為聚亞烷基部分。所述的聚亞烷基二醇部分優選具有至少2、3或4個聚亞烷基二醇亞基。更優選所述的聚亞烷基二醇部分具有至少5或6個聚亞烷基二醇亞基。最優選所述的寡聚體的聚亞烷基二醇部具有至少7個聚亞烷基二醇亞基。所述的寡聚體的聚亞烷基二醇部分優選為低級烷基聚亞烷基二醇部分如聚乙二醇部分、聚丙二醇部分或聚丁二醇部分。所述的聚亞烷基二醇部分更優選為具有均一的結構的聚丙二醇部分。具有均一的結構的聚丙二醇部分的實例如下 這種均一的聚丙二醇結構可以描述為僅具有一個與聚丙二醇鏈中的每個氧原子相鄰的甲基取代的碳原子。這種均一的聚丙二醇部分可以表現出親脂和親水特征，因而可以用于在不使用親脂聚合物部分的情況下提供兩親型生長激素藥物-寡聚體偶聯物(即m+n之和為1)。而且，聚丙二醇部分的仲醇部分與生長激素藥物的偶合可以得到對酶，例如在腸中發現的胰島素和胰凝乳蛋白酶的降解的抵抗力提高的生長激素藥物(例如人生長激素)。
根據本發明的實施方案的均一的聚丙二醇優選如圖11-13合成，現在將對其進行詳述。如圖11所示，1，2-丙二醇53與伯醇封端劑反應得到仲醇延長單體54。所述伯醇封端劑可以是本領域技術人員理的不同的伯醇封端劑(包括但不限于甲硅烷基氯化合物如叔丁基聯苯甲硅烷基氯和叔丁基二甲基甲硅烷基氯)和酯化試劑如Ac2O。優選所述伯醇封端劑為基本上不與仲醇反應的伯醇封端劑，例如叔丁基聯苯甲硅烷基氯或叔丁基二甲基甲硅烷基氯。仲醇延長單體(54)可以與甲基磺酰氯(MeSO2Cl)反應得到伯醇延長單體甲磺酸酯55。
可選擇地，仲醇延長單體54可以與仲醇封端劑反應得到化合物56。所述仲醇封端劑可以是本領域技術人員已知的不同的仲醇封端劑，包括但不限于芐基氯。化合物56可以與B1解封劑反應除去封端部分B，并得到伯醇延長單體57。所述B1解封劑可以選自本領域技術人員已知的不同的解封劑。當通過形成酯將伯醇封端時，B1解封劑為脫酯劑，例如堿(例如碳酸鉀)。當使用甲硅烷基氯將伯醇封端時，B1解封劑優選為四丁基氟化銨(TBAF)。伯醇延長單體57可以與甲基磺酰氯反應得到仲醇延長單體甲磺酸酯58。
可以如下將伯醇延長單體54和仲醇延長單體57封端。仲醇延長單體54可以與封端劑反應得到化合物59。所述封端劑可以是本領域技術人員已知的不同的封端劑，包括但不限于烷基鹵如氯甲烷。化合物59可以與上述的B1解封劑反應得到伯醇封端單體60。
伯醇封端單體60可以與甲基磺酰氯反應得到仲醇封端單體甲磺酸酯61。伯醇延長單體57可以與封端劑反應得到化合物62。封端劑可以是如上述的不同的封端劑。化合物62可以與B2解封劑反應以除去封端部分B2并得到仲醇封端單體63。B2解封劑可以是本領域技術人員已知的不同的解封劑，包括但不限于鈀/活性碳催化劑存在下的H2。仲醇封端單體可以與甲基磺酰氯反應得到伯醇封端單體甲磺酸酯64。雖然圖11所示的實施方案表示封端單體的合成，但應理解可以進行類似的反應得到封端聚合物。
一般地，鏈延長可以通過伯醇延長單體或聚合物如伯醇延長單體57與伯醇延長單體或聚合物甲磺酸酯如伯醇延長單體甲磺酸酯55反應而進行，以得到不同的均一的聚丙烯鏈；或者通過仲醇延長單體或聚合物如仲醇延長單體54與仲醇延長單體或聚合物甲磺酸酯如仲醇延長單體甲磺酸酯58反應而進行。
例如，在圖13中，伯醇延長單體甲磺酸酯55與伯醇延長單體57得到二聚物化合物65。可選擇地，仲醇延長單體甲磺酸酯58可以與仲醇延長單體54反應得到二聚物化合物65。二聚物化合物65上的B1封端部分可以使用上述的B1解封劑除去以得到伯醇延長二聚物66。伯醇延長二聚物66可以與甲基磺酰氯反應得到仲醇延長二聚物甲磺酸酯67。可選擇地，二聚物化合物65上的B2封端部分可以使用上述的B2解封劑除去以得到仲醇延長二聚物69。仲醇延長二聚物69可以與甲基磺酰氯反應得到伯醇延長二聚物甲磺酸酯70。
本領域技術人員已知，鏈延長過程可以重復進行以得到不同的其它鏈長度。例如如圖13所示，伯醇延長二聚物66可以與伯醇延長二聚物甲磺酸酯70反應得到四聚物化合物72。如圖13進一步所示，普通鏈延長反應路線包括伯醇延長單體或聚合物73與伯醇延長單體或聚合物甲磺酸酯74反應得到均一的聚丙烯聚合物75。m和n的值的范圍各為0-1000，或者更優選m和n各為0-50。雖然圖13所示的實施方案表示伯醇延長單體和/或聚合物與伯醇延長單體和/或聚合物甲磺酸酯反應，應該理解類似的反應可以使用仲醇延長單體和/或聚合物和仲醇延長單體和/或聚合物甲磺酸酯完成。
伯醇延長單體或聚合物的末端或伯醇延長單體或聚合物甲磺酸酯的末端可以分別與伯醇封端單體或聚合物甲磺酸酯或伯醇封端單體或聚合物反應得到封端的均一的聚丙烯鏈。例如，如圖12所示，伯醇延長二聚物甲磺酸酯70與伯醇封端單體60反應得到封端的(capped/blocked)伯醇延長三聚物71。本領域技術人員已知，B1封端部分可以除去，而所得的封端的伯醇延長三聚物可以與伯醇延長單體或聚合物甲磺酸酯反應以延長封端的三聚物71的鏈。
仲醇延長單體或聚合物的末端或仲醇延長單體或聚合物的末端甲磺酸酯可以分別與仲醇封端單體或聚合物甲磺酸酯或仲醇封端單體或聚合物反應得到封端的均一的聚丙烯鏈。例如，如圖12所示，仲醇延長二聚物甲磺酸酯67與仲醇封端單體63反應得到封端的(capped/blocked)伯醇延長三聚物68。B2封端部分可以如上述除去，而所得的封端的仲醇延長三聚物可以與仲醇延長鏈節甲磺酸酯反應以延封端的三聚物68的鏈。雖然圖12所示的合成表示二聚物與封端單體反應得到三聚物，應該理解封端過程可以在均一的聚丙二醇部分的合成的任何點上進行，或者可選擇地，可以得到不被封端的均一的聚丙二醇部分。雖然圖12所示的實施方案表示通過用封端單體的合成而進行的聚丁烯寡聚體的封端，應該理解本發明的聚丁烯寡聚體可以使用如以上圖11所述的封端劑直接封端(即不加入封端單體)。
根據本發明的實施方案的均一的聚丙二醇部分可以通過本領域技術人員已知的不同的方法與生長激素藥物，親脂部分如羧酸和/或不同的其它部分偶合，所述方法包括但不限于這里關于聚乙二醇部分所述的方法。
根據本發明的這些實施方案，R或R′為本領域技術人員已知的親脂部分。所述親脂部分優選為飽和或不飽和、直鏈或支鏈烷基部分或飽和或不飽和、直鏈或支鏈脂肪酸部分。當所述親脂部分為烷基部分時，它優選為直鏈、飽和或不飽和的具有1-28個碳原子的烷基部分。更優選，所述烷基部分具有2-12個碳原子。當親脂部分為脂肪酸部分時，它優選為天然的直鏈、飽和或不飽、具有2-18個碳原子的脂肪酸部分。更優選，所述脂肪酸部分具有3-14個碳原子。最優選所述脂肪酸部分具有至少4、5或6個碳原子。
根據本發明的這些實施方案，間隔部分G、G′和G″是本領域技術人員已知的間隔部分。間隔部分優選選自糖、膽固醇和甘油部分。優選這些實施方案的寡聚體不包括間隔部分(即i、j和k優選為0)。
根據本發明的這些實施方案，接頭部分L可以用于將所述的寡聚體與本領域技術人員已知的生長激素藥物偶合。接頭部分優選選自烷基和脂肪酸。
根據本發明的這些實施方案，所述的末端部分優選為烷基或烷氧基部分，更優選為低級烷基或低級烷氧基部分。最優選所述末端部分為甲基或甲氧基。雖然所述的末端部分優選為烷基或烷氧基部分，但應該理解所述的末端部分可以是本領域技術人員已知的不同的部分，包括但不限于糖、膽固醇、醇和脂肪酸。
根據本發明的這些實施方案，由式A的結構的方括號部分表示的寡聚體與生長激素藥物共價偶合。在某些實施方案中，利用可水解的鍵(例如酯或碳酸酯鍵)將生長激素藥物與寡聚體偶合。可水解的偶合可以得到用作前藥的生長激素藥物-寡聚體偶聯物。在某些情況下，例如在其中的生長激素藥物-寡聚體偶聯物不具有活性(即所述偶聯物缺乏通過生長激素藥物的主要作用機理影響身體的能力)的情況下，可水解的偶合可以提供延時釋放或控釋效果，在一個或多個寡聚體從它們各自的生長激素藥物-寡聚體偶聯物上裂解得到活性藥物時在確定的時間內施用生長激素藥物。在其它實施方案中，利用不可水解的鍵(例如氨基甲酸酯、酰胺或醚鍵)將生長激素藥物與寡聚體偶合。當期望生長激素藥物-寡聚體偶聯物在血流中進行長期，優選至少2小時的循環時，可以優選使用不可水解的鍵。當寡聚體與生長激素藥物共價偶合時，所述寡聚體還包含一個或多個用于將寡聚體與本領域技術人員已知的生長激素藥物共價偶合的鍵合部分。鍵合部分優選選自共價鍵、酯部分、碳酸酯部分、氨基甲酸酯部分、酰胺部分和仲胺部分。
變量p為1至生長激素藥物上親核殘基數的整數。當p大于1小時，多于一個寡聚體(即多個寡聚體)與藥物偶合。根據本發明的這些實施方案，所述的多數寡聚體相同。
所述寡聚體可以在藥物的不同的親核殘基處與生長激素藥物偶合，所述親核殘基包括但不限于親核羥基官能團和/或氨基官能團。例如，親核羥基官能團可以見于絲氨酸和/或酪氨酸殘基，而親核氨基官能團可以見于組氨酸和/或賴氨酸殘基和/或多肽的一個或多個N-末端。當寡聚體與一個或多個生長激素多肽的N-末端偶合時，所述的偶合優選形成仲胺。例如當所述的生長激素藥物為人生長激素時，所述的寡聚體可以與Phe1、Lys38、Lys41、Lys70、Lys115、Lys140、Lys145、Lys158、Lys168、和/或Lys172的氨基官能團偶合。
生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物(其中混合物中的每個偶聯物具有相同的分子量并具有式A的結構)可以由不同的方法合成。例如通過以下方法合成羧酸和聚乙二醇組成的寡聚體的混合物使羧酸的混合物與聚乙二醇的混合物在足以得到寡聚體的混合物的條件下接觸。然后將所述的混合物的寡聚體活化，從而使它們能夠與生長激素藥物反應得到生長激素藥物-寡聚體偶聯物。
用于得到其中的各寡聚體具有相同的分子量并具有式A的寡聚體的結構的活化的寡聚體的混合物的合成路線的一個實施方案如圖3所示，并如以下的實施例11-18所述。用于得到其中的各寡聚體具有相同的分子量并具有式A的寡聚體的結構的活化的寡聚體的混合物如圖4所示，并如以下的實施例19-24所述。用于得到其中的各寡聚體具有相同的分子量并具有式A的寡聚體的結構的活化的寡聚體的混合物的合成路線的另一個實施方案如圖5所示，并如以下實施例25-29所述。用于得到其中的各寡聚體具有相同的分子量并具有式A的寡聚體的結構的活化的寡聚體的混合物的合成路線的另一個實施方案如圖6所示，并如以下實施例30-31所述。用于得到其中的各寡聚體具有相同的分子量并具有式A的寡聚體的結構的活化的寡聚體的混合物的合成路線的另一個實施方案如圖7所示，并如以下實施例32-37所述。用于得到其中的各寡聚體具有相同的分子量并具有式A的寡聚體的結構的活化的寡聚體的混合物的合成路線的另一個實施方案如圖8所示，并如以下實施例38所述。用于得到其中的各寡聚體具有相同的分子量并具有式A的寡聚體的結構的活化的寡聚體的混合物的合成路線的另一個實施方案如圖9所示，并如以下實施例39所述。用于得到其中的各寡聚體具有相同的分子量并具有式A的寡聚體的結構的活化的寡聚體的混合物的合成路線的另一個實施方案如圖10所示，并如以下實施例40所述。
使其中的各寡聚體具有相同的分子量并具有式A的寡聚體的結構的活化的寡聚體的混合物與其中的每個藥物具有相同的分子量的生長激素藥物的混合物在足以得到生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物的條件下反應。合成實施例如以下的實施例40-42所述。本領域技術人員已知，可以控制反應條件(例如所選擇的摩爾比、溶劑混合物和/或pH)以使由其中的各寡聚體具有相同的分子量并具有式A的寡聚體的結構的活化的寡聚體的混合物與生長激素的混合物反應得到的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物反應得到的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物是其中的每個偶聯物具有相同的分子量并具有式A的結構的偶聯物的混合物。例如，可以通過將反應溶液的pH保持在賴氨酸的pKa以下而抑制賴氨酸的氨基官能團處的偶聯。可選擇地，可以利用HPLC分離(separated和isolated)所述的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物得到生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物，例如一、二或三偶聯物，其中混合物中的每個偶聯物具有相同的分子量并具有式A的結構。可以利用本領域技術人員已知的不同技術測定和/或檢驗特定的分離的偶聯物的偶聯程度(例如所述分離的分子為一、二或三偶聯物)，所述技術包括但不限于質譜。可以利用本領域技術人員已知的不同的技術測定和/或檢驗特定的偶聯物結構(例如所述寡聚體位于人生長激素一偶聯物的Phe1、Lys38、Lys41、Lys70、Lys115、Lys140、Lys145、Lys158、Lys168或Lys172)，這些技術包括但不限于序列分析、肽圖分析、選擇性酶切和/或內肽酶切割。
本領域技術人員已知，生長激素藥物上的一個或多個反應部位可以通過生長激素藥物與適宜的封端劑如N-叔丁氧基羰基(t-BOC)或N-(9-芴基甲氧基羰基)(N-FMOC)反應而封端。例如可以在所述的生長激素藥物為多肽并期望形成具有在肽的一個或多個N-末端的寡聚體的不飽和的偶聯物(即并非所有的親核殘基發生偶聯的偶聯物)時，優選這種方法。在這種封端之后，封端的生長激素藥物的混合物可以與其中的每個寡聚體具有相同的分子量并具有式A的寡聚體結構的活化的寡聚體的混合物反應得到具有與一個或多個親核殘基偶合的寡聚體和具有與親核殘基偶合的封端部分的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物。本領域技術人員已知，在偶聯反應之后，可以將生長激素藥物-寡聚體偶聯物解封。如果需要的話，隨后可以如上述分離生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物得到生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物，其中所述混合物中的每個偶聯物具有相同的分子量并具有式A的結構。可選擇地，所述的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物可以是在解封之前分離。
根據本發明的實施方案，其中每個偶聯物具有相同的分子量并具有式A的結構的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物優選具有比常規的混合物改善的性能。例如，其中的每個偶聯物具有相同的分子量并具有式A的結構的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物優選其體內活性大于具有與其中的每個偶聯物具有相同的分子量并具有式A的結構的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物相同的數均分子量的多分散的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物的體內活性。本領域技術人員已知，其中的每個偶聯物具有相同的分子量并具有式A的結構的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物的數均分子量和多分散的混合物的數均分子量可以通過不同的方法測定，這些方法包括不但不限于體積排阻色譜法如H.R.Allcock & F.W.Lampe，CONTEMPORARYPOLYMER CHEMISTRY 394-402(第二版，1991)所述的凝膠滲透色譜法。
作為另一個實例，其中的每個偶聯物具有相同的分子量并具有式A的結構的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物優選其體外活性大于具有與其中的每個偶聯物具有相同的分子量并具有式A的結構的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物相同的數均分子量的多分散的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物的體外活性。本領域技術人員已知，其中的每個偶聯物具有相同的分子量并具有式A的結構的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物的數均分子量和多分散的混合物的數均分子量可以通過不同的方法測定，這些方法包括不但不限于體積排阻色譜法。
本領域技術人員已知，特定的混合物的體外活性可以由不同的方法測定。優選使用可從Molecular Devices Corporation of Sunnyvale，California商購得到的Cytosensort微生理機能測定儀測定體外活性。所述微生理機能測定儀監測對被加到在Transwell中培養的細胞的藥物作出反應而發生的細胞外酸化速率的細微變化。這種反應與研究的分子的活性成比例。
作為另一個實例，在同具有與其中的每個偶聯物具有相同的分子量并具有式A的結構的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物相同的數均分子量的多分散的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物對胰凝乳蛋白酶降解的抵抗力相比，其中的每個偶聯物具有相同的分子量并具有式A的結構的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物優選對胰凝乳蛋白酶降解的抵抗力增大。本領域技術人員已知，其中的每個偶聯物具有相同的分子量并具有式A的結構的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物的數均分子量和多分散的混合物的數均分子量可以通過不同的方法測定，這些方法包括不但不限于體積排阻色譜法。
作為另一個實例，其中的每個偶聯物具有相同的分子量并具有式A的結構的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物優選其受試者間的差異性小于具有與其中的每個偶聯物具有相同的分子量并具有式A的結構的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物相同的數均分子量的多分散的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物的受試者間的差異性。本領域技術人員已知，其中的每個偶聯物具有相同的分子量并具有式A的結構的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物的數均分子量和多分散的混合物的數均分子量可以通過不同的方法測定，這些方法包括不但不限于體積排阻色譜法。可以通過本領域技術人員已知的不同方法測定受試者間的差異性。所述受試者間的差異性優選如下測定。測定每名受試者的劑量反應曲線下的面積(AUC)(即劑量反應曲線和基線值之間的面積)。通過計算每名受試者的AUC的總數并用該總數除以受試者數量而確定所有受試者的平均AUC。然后對每名受試者測定受試者的AUC與平均AUC之間的差別的絕對值。隨后計算所得的差異的絕對值的總數得到代表受試者間的差異性的值。較低的值代表較低的受試者間的差異性，而較高的值代表較大的受試者間的差異性。
根據本發明的實施方案，其中每個偶聯物具有相同的分子量并具有式A的結構的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物優選具有二種或更多種上述的改善性能。更優選，根據本發明的實施方案，其中每個偶聯物具有相同的分子量并具有式A的結構的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物具有三種或更多種上述的改善的性能。最優選，根據本發明的實施方案，其中每個偶聯物具有相同的分子量并具有式A的結構的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物具有上述的改善的性能。
本發明還提供包含根據本發明的實施方案的偶聯物的混合物的藥物組合物。上述的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物可以根據已知的技術制備用于在藥學載體中給藥。例如參見Remington，The Scienceand Practiceof Pharmacy(第9版，1995)。在根據本發明的實施方案的藥物組合物的制備中，一般將生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物與藥學上可接受的載體混合。當然所述的載體在與藥物組合物中的任何其它成分相容的含義上是可接受的，并不應對患者有傷害。所述的載體可以是固體或液體，或者同為固體和液體，并優選與所述的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物制成單元劑型，例如可能包含大約0.01或0.5wt％至大約95％或99wt％的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物的片劑。所述的藥物組合物可以通過任何已知的藥學技術制備，這些藥學技術包括但不限于混合組分，所述組分任選包括一種或多種輔助成分。
根據本發明的實施方案的藥物組合物包括適用于以下的藥物組合物口、直腸、局部、吸入(例如通過氣溶膠)、頰(例如舌下)、陰道、腸胃外(例如皮下、肌內、真皮內、關節內、胸膜內、腹膜內、大腦內、動脈內或靜脈內)、局部(即皮膚和粘膜表面，包括氣道表面)和透皮給藥，但在任何既定的情況下的最適宜的途徑取決于所治療的癥狀的性質與嚴重程度和所使用的特定的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物的性質。
適于口服的藥物組合物可以以下形式存在獨立的單元，如膠囊、扁囊劑、錠劑或片劑，各包含預定量的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物；散劑或顆粒劑；在水或非水液體中的溶液或懸浮液；或者水包油型或油包水型乳液。這種制劑可以通過任何適宜的藥學方法制備，所述方法包括將生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物和適宜的載體(可以包含一個或多個上述的輔助成分)締合的步驟。一般地，根據本發明的實施方案的藥物組合物通過以下方法制備均一和緊密地混合生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物和液體或細分的固體載體，或者液體和細分的固體，然后如果需要的話將所得的混合物成形。例如，可以通過以下方法制備片劑將包含生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物和任選的一個或多個輔助成分的粉末或顆粒壓制或模制。壓制片可以通過在適宜的機器中將混合物壓制成任選混有粘合劑、潤滑劑、惰性稀釋劑和/或表面活性/分散劑的自由流動形式，如散劑或顆粒。模制片可以通過在適宜的機器中模制用惰性液體粘合劑濕潤的粉末化合物。
適于頰(舌下)給藥的藥物組合物包括含有在調味堿，通常為蔗糖和阿拉伯膠或黃芪膠中的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物的糖錠；和包含在惰性堿如明膠和甘油或蔗糖和阿拉伯膠中的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物的錠劑。
適于腸胃外給藥的根據本發明的實施方案的藥物組合物包含生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物的無菌水和非水注射液，所述制劑優選與目標受者的血液等滲。這些制劑可以包含抗氧劑、緩沖劑、抑菌劑和使組合物與目標受者的血液等滲的溶質。水和非水無菌懸浮液可以包含懸浮劑和增稠劑。所述組合物可以存在于單元劑量和多劑量容器，例如密閉的安瓿和小瓶，并可以在僅要求使用前立即加入無菌液體載體如鹽水和注射用水的冷凍干燥的(凍干的)條件下儲存。可以由前述種類的無菌粉末、顆粒和片劑制備臨時注射溶液和懸浮液。例如，可以得到在密閉容器中的包含生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物的可注射、穩定無菌組合物的單元劑型。本發明提供能夠與適宜的藥學上可接受的載體重組形成適于注射至受者的液體組合物的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物的凍干物形式。所述的單元劑型一般包含大約10mg至大約10克的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物。
當所述的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物基本上不溶于水時，可以使用足量的生理學上可接受的乳化劑乳化在含水載體中的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物。一種這樣的有用的乳化劑為磷脂酰膽堿。
適于直腸給藥的藥物組合物優選作為單元劑量栓劑存在。這些組合物可以通過以下方法制備將生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物與一種或多種常規固體載體如可可油混合，然后將所得的混合物成型。
適于皮膚局部應用的藥物組合物優選為藥膏、乳膏、洗液、糊劑、凝膠、噴霧劑、氣溶膠或油的形式。可以使用的載體包括凡士林油、羊毛脂、聚乙二醇、醇、透皮增強劑和其二種或更多種的組合。
適于直腸給藥的藥物組合物可以作為適于與受者的表皮保持長期緊密接觸的獨立的貼劑存在。適于透皮給藥的組合物還可以通過離子電滲法(例如參見Pharmaceutical Research 3(6)318(1986))遞送，且一般采用任選的生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物的緩沖水溶液的形式。適宜的制劑包含檸檬酸鹽或二\三緩沖液(pH 6)或乙醇/水，并包含0.1-0.2M活性成分。
本發明還提供通過施用有效量的這種藥物組合物而治療需要這種治療的受試者的生長激素缺乏的方法。在本發明的范圍內使用的任何生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物的有效量在一定程度上將隨不同的混合物、患者而變，并取決于因素如患者的年齡和癥狀與遞送途徑。可以根據本領域技術人員已知的常規藥代動力學方法確定這種劑量。作為一種一般性的建議，大約0.1至大約50mg/kg的劑量具有療效，其中所有的重量基于生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物的重量計算。較高水平時的毒性考慮可能將靜脈內劑量限定到較低的水平，如至多大約10mg/kg，其中所述的重量基于活性堿的重量計算。大約10mg/kg至大約50mg/kg的劑量可以用于口服。一般地，大約0.5mg/kg至5mg/kg的劑量可以用于肌內注射。給藥頻率一般為每天一、二或三次或控制癥狀所需的給藥頻率。可選擇地，所述的藥物-寡聚體偶聯物可以通過連續地灌輸而施用。治療的持續時間取決于所治療的生長激素缺乏的類型。
加速動物的生長速率的方法包括給動物施用有效量的根據上述的不同的實施方案的偶聯物的混合物。當然，生長激素的有效量取決于進行給藥的動物，并可以由本領域技術人員來確定。
本發明還提供根據本發明的實施方案的偶聯物的混合物的合成方法。雖然以下的合成路線實施方案涉及基本上單分散的混合物的合成，但可以使用類似的合成路線合成根據本發明的實施方案的其它生長激素藥物-寡聚體偶聯物的混合物。
如反應1所示提供基本上單分散的包含聚乙二醇部分的聚合物的混合物1(I) (II)(III)R1為H或親脂部分。R1優選為H、烷基、芳基烷基、芳香部分、脂肪酸部分、脂肪酸部分的酯、膽甾醇基或金剛烷基。R1更優選為H、低級烷基或芳香部分。R1為最優選H、甲基或芐基。
在式I中，n為1-25。優選n為1-6。
X+為陽離子。優選X+為化合物如強堿中的任何陽離子，能夠將PEG上的羥基部分離子。陽離子的實例包括但不限于鈉離子、鉀離子、鋰離子、銫離子和鉈離子。
R2為H或親脂部分。R2優選為直鏈或支鏈烷基、芳基烷基、芳香部分、脂肪酸部分或脂肪酸部分的酯。R2更優選為低級烷基、芐基、具有1-24個碳原子的脂肪酸部分或具有1-24個碳原子的脂肪酸部分的酯。R2最優選為甲基、具有1-18個碳原子的脂肪酸部分或具有1-18個碳原子的脂肪酸部分的乙酯。
在式II中，m為1-25。優選m為1-6。
M為甲磺酸酯部分(即CH3S(O2)-)。
如反應1所示，具有式I的結構的化合物的混合物與具有式II的結構的化合物的混合物反應得到包含聚乙二醇部分并具有式III的結構的混合物。所述的具有式I的結構的化合物的混合物為基本上單分散的混合物。優選式I的化合物的混合物中至少大約96％、97％、98％或99％的化合物具有相同的分子量，更優選式I的化合物的混合物為單分散的混合物。所述的式II的化合物的混合物為基本上單分散的混合物。優選式II的化合物的混合物中至少大約96％、97％、98％或99％的化合物具有相同的分子量，更優選式II的化合物的混合物為單分散的混合物。所述的式III的化合物的混合物為基本上單分散的混合物。優選式III的化合物的混合物中至少大約96％、97％、98％或99％的化合物具有相同的分子量。更優選，式III的化合物的混合物為單分散的混合物。
反應1優選在大約0℃至40℃下進行，更優選在大約15℃至大約35℃下進行，最優選在室溫(大約25℃)下進行。
本領域技術人員已知，反應1可以進行不同的時間。反應1優選進行大約0.25、0.5或0.75小時至大約2、4或8小時。
反應1優選在質子惰性溶劑中進行，例如所述質子惰性溶劑包括但不限于N，N-二甲基乙酰胺(DMA)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亞砜(DMSO)、六甲基磷三酰胺、四氫呋喃(THF)、二噁烷、二乙醚、甲基叔丁基醚(MTBE)、甲苯、苯、己烷、戊烷、N-甲基吡咯烷酮、四氫萘、十氫萘、1，2-二氯苯、1，3-二甲基-2-咪唑烷酮或它們的混合物。更優選所述為DMF、DMA或甲苯。
式I的化合物與式II的化合物的摩爾比優選大于大約1∶1。更優選所述的摩爾比為至少大約2∶1。通過提供過量的式I的化合物可以確保基本上所有式II的化合物發生反應，從而有助于回收下述的式III的化合物。
式I的化合物優選如反應2所示制備能將式IV的PEG2子化的化合物(IV)(I)R1和X+如上述，且所述的式IV的化合物的混合物基本上是單分散的；優選式IV的化合物的混合物中至少大約96％、97％、98％或99％的化合物具有相同的分子量；更優選式IV的化合物的混合物為單分散的混合物。
本領域技術人員已知能夠將式IV的化合物的PEG部分的羥基部分離子的不同的化合物。能夠將羥基部分離子化的化合物優選為強堿。更優選能夠將羥基離子化的化合物選自氫化鈉、氫化鉀、叔丁醇鈉、叔丁醇鉀、丁基鋰(BuLi)和二異丙基胺鋰。能夠將羥基部分離子化的化合物更優選為氫化鈉。
能夠將式IV的化合物的PEG部分上的羥基部分離子化的化合物與式IV的化合物的摩爾比優選為至少大約1∶1，更優選為至少大約2∶1。確信通過提供過量的能夠將羥基部分離子化的化合物，基本上所有的式IV的化合物發生反應得到式I的化合物。因此可以避免在式IV的化合物和式I的化合物在反應產物混合物中同時存在時可能發生的分離困難。
反應2優選在大約0℃至大約40℃下進行，更優選在大約0℃至大約35℃下進行，最優選在大約0℃至室溫(大約25℃)下進行。
本領域技術人員已知反應2可以進行不同的時間。反應2優選進行大約0.25、0.5或0.75小時和大約2、4或8小時的時間。
反應2優選在質子惰性溶劑中完成，所述質子惰性溶劑包括但不限于N，N-二甲基乙酰胺(DMA)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亞砜(DMSO)、六甲基磷三酰胺、四氫呋喃(THF)、二噁烷、二乙醚、甲基叔丁基醚(MTBE)、甲苯、苯、己烷、戊烷、N-甲基吡咯烷酮、二氯甲烷、氯仿、四氫萘、十氫萘、1，2-二氯苯、1，3-二甲基-2-咪唑烷酮或它們的混合物。更優選所述的溶劑為DMF、二氯甲烷或甲苯。
式II的化合物優選如反應3所示制備 R2和Ms如上述，而式V的化合物作為基本上單分散的式V的化合物的混合物存在；優選式V的化合物的混合物中至少大約96％、97％、98％或99％的化合物具有相同的分子量；更優選式V的化合物的混合物為單分散的混合物。
Q為鹵化物，優選氯化物或氟化物。
CH3S(O2)Q為甲基磺酰鹵化物。所述甲基磺酰鹵化物優選為甲基磺酰氯或甲烷磺酰基氟化物。更優選，所述的甲基磺酰鹵化物為甲基磺酰氯。
甲基磺酰基鹵化物與式V的化合物的摩爾比優選大于大約1∶1，更優選至少大約2∶1。確信通過提供過量的甲基磺酰基鹵化物，基本上所有的式V的化合物發生反應得到式II的化合物。因此可以避免在式V的化合物和式II的化合物在反應產物混合物中同時存在時可能發生的分離困難。
反應3優選在大約0℃至大約40℃下進行，更優選在大約0℃至大約35℃下進行，最優選在大約0℃至室溫(大約25℃)下進行。
本領域技術人員已知反應3可以進行不同的時間。反應2優選進行大約0.25、0.5或0.75小時和大約2、4或8小時的時間。
反應3優選在脂肪胺存在下完成，所述脂肪胺包括但不限于一甲基胺、二甲基胺、三甲基胺、一乙基胺、二乙基胺、三乙基胺、一異丙基胺、二異丙基胺、一正丁基胺、二正丁基胺、三正丁基胺、一環己基胺、二環己基胺或它們的混合物。更優選，所述脂肪胺為叔胺如三乙基胺。
本領域技術人員已知，不同的基本上單分散的式V的化合物的混合物可以商購得到。例如，當R2為H或甲基時，式V的化合物分別為PEG或mPEG化合物，并可以從Aldrich of Milwaukee，Wisconsin；Fluka of Switzerland和/或TC1 America of Portland，Oregon商購得到。
當R2為親脂部分如高級烷基、脂肪酸、脂肪酸的酯、膽甾醇基或金剛烷基時，可以由本領域技術人員已知的不同方法得到式V的化合物。式V的化合物優選如下得到4(VI) (VII) (VIII)R3(OC2H4)m-OR2→H(OC2H4)m-OR25(VIII) (V)R2為親脂部分，優選高級烷基、脂肪酸酯、膽甾醇基或金剛烷基，更優選脂肪酸的低級烷基酯，最優選具有1-18個碳原子的脂肪酸的乙酯。
R3為H、芐基、三苯甲基、四氫吡喃或本領域技術人員已知的其它醇保護基。
X2+為以上關于X+所述的陽離子。
m的值如上述。
關于反應4，使式VI的化合物混合物與式VII的化合物的混合物在類似于關于反應1所述的條件下進行反應。式V式VI的化合物的混合物為基本上單分散的混合物。優選式VI的化合物的混合物中至少大約96％、97％、98％或99％的化合物具有相同的分子量。更優選式VI的化合物的混合物為單分散的混合物。式VII的化合物的混合物為基本上單分散的混合物。優選式VII的化合物的混合物中至少大約96％、97％、98％或99％的化合物具有相同的分子量。更優選，式VII的化合物的混合物為單分散的混合物。
關于反應5，可以由本領域技術人員已知的不同方法將式VIII的化合物水解以將R3部分轉化為醇。當R3為芐基或三苯甲基時，所述的水解優選利用H2在本領域技術人員已知的鈀-碳催化劑存在下進行。當然當R3為H時，反應5沒有必要。
式VI的化合物可以商購得到，或者如以上關于反應3所述得到。式VII的化合物可以如以上關于反應2所述得到。
基本上單分散的包含PEG部分并具有式III的結構的聚合物的混合物還可以與其它基本上單分散的包含PEG部分的聚合物反應以延長PEG鏈。例如可以使用以下路線 7(IX) (X) (XI)Ms、m和n如以上關于反應1所述；p與n和m類似，而X2+與如以上關于反應1所述的X+類似。Q如以上關于反應3所述。R2如以上關于反應1所述，并優選為低級烷基。R1為H。反應6優選以類似于關于反應3所述的方式進行。反應7優選在類似于關于反應1所述的方式進行。優選式III的化合物的混合物中至少大約96％、97％、98％或99％的化合物具有相同的分子量，更優選式III的化合物的混合物為單分散的混合物。式X的化合物的混合物為基本上單分散的混合物。優選混合物中至少大約96％、97％、98％或99％的化合物具有相同的分子量，更優選式X的化合物的混合物為單分散的混合物。
根據本發明的實施方案的方法由圖1所示的路線表示，現在將其進行詳述。含有基本上單分散的聚乙二醇的寡聚體的合成起始于基本上單分散的聚乙二醇的一芐基醚(1)的制備。使過量的可商購得到的基本上單分散的聚乙二醇與芐基氯在如Coudert等人所述的氫氧化鈉水溶液存在下反應(Synthetic Communications，16(1)19-26(1986))。然后通過加入NaH制備1的鈉鹽，并使此鈉鹽與由羥基鏈烷酸(2)的酯合成的甲磺酸酯反應。通過催化氫化將甲磺酸酯的取代產物(3)脫芐基化以得到醇(4)。這種醇的甲磺酸酯(5)可以通過加入甲基磺氯制備，并用作與基本上單分散的聚乙二醇衍生物的一甲醚的鈉鹽進行的反應中的親電子試劑，從而將寡聚體的聚乙二醇部分延長至目標長度，得到延長的酯(6)。可以在堿水溶液中將酯水解成酸(7)，并通過與碳化二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺反應轉化成活化的酯(8)。雖然使用N-羥基琥珀酰亞胺將圖1所示的寡聚體活化，但應該理解可以用其它不同的試劑活化本發明的寡聚體，包括但不限于活性氯甲酸苯基酯如氯甲酸對硝基苯基酯、氯甲酸苯基酯、氯甲酸3，4-苯基酯、二氯甲酸苯基酯和二氯甲酸3，4-苯基酯；tresylation和縮醛形成。
進一步參照圖1，q為1-24。優選q為1-18，且q更優選為4-16。R4為能夠經過水解得到羧酸的部分。R4優選為低級烷基，并更優選為乙基。變量n和m如以上關于反應1所述。
用于這里所述的方法的所有原料可以商購得到或可以由本技術中已知的方法使用可商購得到的原料制備。
現在參照以下的實施例對本發明進行詳述。應該認識到這些實施例的目的在于例示本發明的方面，而不是對權利要求定義的范圍進行限定。
實施例實施例1-10除非另外特指，實施例1-10的反應在氮氣氛下使用磁攪拌完成。“加工”意指用有機溶劑萃取，用飽和NaCl溶液洗滌有機相，干燥(MgSO4)，并蒸發(旋轉蒸發器)。用預涂布硅膠60 F-254的Merck玻璃板進行薄層色譜處理，并用碘液將斑點可視化。所有的質譜由Macromolecular Resources Colorado State University，CO測定，并以級數m/z(相對強度)報道。由Galbraith Laboratories，Inc.，Knoxville，TN進行元素分析和熔點測定。實施例1-10指圖2所示的路線。
實施例18-甲氧基-1-(甲基磺酰基)氧-3，6-二氧雜辛烷(9)在冰浴上冷卻在無水二氯甲烷(50mL)中的非多分散的三乙二醇一甲基醚分子(4.00mL，4.19g，25.5mmol)和三乙基胺(4.26mL，3.09g，30.6mmol)的溶液，并將其放置在氮氣氛下。從添加漏斗滴加在無水二氯甲烷(20mL)中的甲基磺酰氯(2.37mL，3.51g，30.6mmol)的溶液。在完成氯化物加入后10分鐘，從冰浴中移出反應混合物，并使其達到室溫。將混合物再攪拌1小時，此時TLC(CHCl3和15％MeOH作為洗脫劑)表明未殘留三乙二醇一甲基醚。
用另外75mL二氯甲烷稀釋反應混合物，并用飽和NaHCO3、水和鹽水連續洗滌。用Na2SO4干燥有機物，過濾并真空濃縮得到非多分散的化合物9的混合物，為一種橙清的油(5.31g，86％)。
實施例2乙二醇一甲基醚(10)(m＝4，5，6)在N2氣氛下往在無水DMF(25.7mL)中的非多分散的化合物11(35.7mmol)的攪拌溶液分部分加入在礦物油中的60％NaH的分散體，并將混合物于室溫下攪拌1小時。往此鹽12中一次性加入在無水DMF(4ml)中的非多分散的甲磺酸酯9(23.36)的溶液，并將混合物于室溫下攪拌3.5小時。通過TLC(12％CH3OH-CHCl3)監測反應的進行。反應混合物用等量的1N HCl稀釋，用乙酸乙酯(2×20ml)萃取并棄去。萃取水溶液并加工得到非多分散的聚合物10(82-84％產率)。
實施例33，6，9，12，15，18，21-七氧雜二十二醇(10)(m＝4)油；Rf0.46(甲醇∶氯仿＝3∶22)；MS m/z計算值C15H32O8340.21(M++1)，實測值341.2。
實施例43，6，9，12，15，18，21，24-八氧雜二十五醇(10)(m＝5)油；Rf0.43(甲醇∶氯仿＝6∶10)；MS m/z計算值C17H36O9384.24(M++1)，實測值385.3。
實施例53，6，9，12，15，18，21，24，27-九氧雜二十八醇(10)(m＝6)油；Rf0.42(甲醇∶氯仿＝6∶10)；MS m/z計算值C19H40O10428.26(M++1)，實測值429.3。
實施例620-甲氧基-1-(甲基磺酰基)氧-3，6，9，12，15，18-六氧雜二十烷(14)由醇13(m＝4)和關于9所述的甲基磺酰氯以定量產率得到非多分散的化合物14，為一種油；Rf0.4(乙酸乙酯∶乙腈＝1∶5)；MS m/z計算值C17H37O10433.21(M++1)，實測值433.469。
實施例7乙二醇一甲基醚(15)(m＝3，4，5)使用以上關于化合物10所述的方法由二醇制備非多分散的化合15。
實施例83，6，9，12，15，18，21，24，27，30-十氧雜二十一醇(15)(m＝3)油；Rf0.41(甲醇∶氯仿＝6∶10)；MS m/z計算值C21H44O11472.29(M++1)，實測值472.29。
實施例93，6，9，12，15，18，21，24，27，30，33-十一氧雜四二十三烷醇(15)(m＝4)油；Rf0.41(甲醇∶氯仿＝6∶10)；MS m/z計算值C23H48O12516.31(M++1)，實測值516.31。
實施例103，6，9，12，15，18，21，24，27，30，33，36-十二氧雜七二十三烷醇(15)(m＝5)油；Rf0.41(甲醇∶氯仿＝6∶10)；MS m/z計算值C25H52O13560.67(M++1)，實測值560.67。
實施例11-18指圖3所示的路線。
實施例11六乙二醇一芐基醚(16)將通過把3.99g(100mmol)NaOH溶于水而制備的氫氧化鈉水溶液緩慢加到非多分散的六乙二醇(28.175g，25mL，100mmol)。加入芐基氯(3.9g，30.8mmol，3.54ml)，并將反應混合物攪拌在100℃下加熱18小時。然后將反應混合物冷卻，用鹽水(250ml)稀釋，并用二氯甲烷(200ml×2)萃取。用鹽水將合并的有機層洗滌一次，用Na2SO4干燥，過濾并真空濃縮到一種深褐色的油。通過快速色譜法(硅膠，梯度洗脫乙酸乙酯至9/1乙酸乙酯/甲醇)純化粗產物混合物得到8.099g(70％)非多分散的16，為一種黃色的油。
實施例126-甲基磺酰氧基己酸乙酯(17)在冰浴中冷卻在無水二氯甲烷(75ml)中的非多分散的6-羥基己酸乙酯(50.76mL，50.41g，227mmol)的溶液，并將其置于氮氣氛下。加入三乙基胺(34.43mL，24.99g，247mmol)。由添加漏斗滴加在無水二氯甲烷(75ml)中的甲基磺酰氯(19.15mL，28.3g，247mmol)的溶液。將混合物攪拌3.5小時，并使其在冰浴熔化時緩慢地到達室溫。用硅膠過濾混合物，連續地用水、飽和NaHCO3、水和鹽水冼滌濾液。用Na2SO4干燥有機物，過濾并真空濃縮至一種淺黃色的油。最后通過快速色譜法(硅膠，1/1己烷/乙酸乙酯)純化粗產物得到非多分散的產物(46.13g，85％)，為一種澄清的無色油。FAB MSm/z239(M+H)，193(M-C2H5O)。
實施例136-12-[2-(2-12-[2-(2-芐氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-己酸乙酯(18)將氫化鈉(3.225g或60％油懸浮液，80.6mmol)懸浮在80ml無水甲苯，放置在氮氣氛下并在冰浴中冷卻。將在80ml無水甲苯中的非多分散的醇16(27.3g，73.3mmol)的溶液加到NaH懸浮液。將混合物于0℃下攪拌30分鐘，使其冷卻至室溫，并再攪拌5小時，在此期望混合物變為澄清的褐色溶液。將在80ml無水甲苯中的非多分散的甲磺酸酯17(19.21g，80.6mmol)加到NaH/醇混合物，并將合并的溶液于室溫下攪拌3天。用50ml甲醇終止反應混合物的反應，用堿性氧化鋁過濾。將濾液真空濃縮，并用快速色譜法(硅膠，梯度洗脫3/1乙酸乙酯/己烷至乙酸乙酯)純化得到非多分散的產物，為一種淺黃色油(16.52g，44％)。FAB MSm/e 515(M+H)。
實施例146-{2-[2-(2-{2-[2-(2-羥基乙氧基)乙氧基]乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-己酸乙酯(19)將非多分散的芐基醚18(1.03g，2.0mmol)溶于25ml乙醇。往此溶液加入270mg 10％Pd/C，將混合物置于氫氣氛下并攪拌4小時，此時TLC表明原料完全消失。用C鹽545過濾反應混合物以除去催化劑，并將濾液真空濃縮得到非多分散的標題化合物，為一種澄清的油(0.67g，79％)。FAB MSm/e 425(M+H)，447(M+Na)。
實施例156-{2-[2-(2-{2-[2-(2-甲基磺酰基乙氧基)乙氧基]乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-己酸乙酯(20)將非多分散的醇19(0.835g，1.97mmol)溶于3.5ml無水二氯甲烷并將其放置在氮氣氛下。加入三乙基胺(0.301mL，0.219g，2.16mmol)，并在冰浴中冷凍混合物。2分鐘后，加入甲烷磺酰氯(0.16mL，0.248g，2.16mmol)。將混合物于0℃下攪拌15分鐘，然后在室溫下攪拌2小時。用硅膠過濾反應混合物以除去三乙基氯化銨，并連續地用水、飽和NaHCO3、水和鹽水洗滌濾液。用Na2SO4干燥有機物，過濾并真空濃縮。用柱色譜法(硅膠，9/1乙酸乙酯/甲醇)純化殘余物得到非多分散的化合物，為一種澄清的油(0.819g，83％)。FAB MSm/e 503(M+H)。
實施例166-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-己酸乙酯(21)在N2氣氛下將NaH(88mg 60％在油中懸浮液，2.2mmol)懸浮在無水甲苯(3ml)中，并冷卻至0℃。加入已通過與甲苯共沸蒸餾而干燥的非多分散的二乙二醇一甲基醚(0.26mL，0.26g，2.2mmol)。將反應混合物緩慢加熱至室溫，并攪拌4小時，在此期間混濁的灰色懸浮液變為澄清的黃色，然后變成褐色。加入在2.5ml無水甲苯中的甲磺酸酯20(0.50g，1.0mmol)。
室溫下攪拌過夜后，加入2ml甲醇終止反應，用硅膠過濾所得的溶液。將濾液真空濃縮，FAB MSm/e 499(M+H)，521(M+Na)。再通過制備色譜法(硅膠，19/3氯仿/甲醇)進行純化得到非多分散的產物，為一種澄清的黃色油(0.302g 57％)。FAB MSm/z 527(M+H)，549(M+Na)。
實施例176-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-己酸(22)將非多分散的酯21(0.25g，0.46mmol)在0.71ml 1N NaOH中攪拌18小時。18小時后，將混合物真空濃縮以除去醇，并將殘余物溶于另10ml水。用2N HCl將水溶液酸化至pH 2，并將產物萃取至二氯甲烷(30ml×2)。然后用鹽水(25ml×2)洗滌合并的有機物，用Na2SO4干燥，過濾并真空濃縮得到非多分散的標題化合物，為一種黃色的油(0.147g，62％)。FAB MSm/z 499(M+H)，521(M+Na)。
實施例186-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-己酸2，5-二氧代-吡咯烷-1-基酯(23)
將非多分散的酸22(0.209g，0.42mmol)溶于4ml無水二氯甲烷，并在N2氣氛下將其加到包含NHS(N-羥基琥珀酰亞胺)(57.8mg，0.502mmol)和EDC(1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽)(98.0mg，0.502mmol)的無水燒瓶。將溶液于室溫下攪拌過夜，用硅膠過濾以除去過量的試劑，并在EDC中形成脲。將濾液真空濃縮得到非多分散的產物，為一種深黃色油(O.235g，94％)。FAB MSm/e 596(M+H)，618(M+Na)。
實施例19-24指圖4所示的路線。
實施例19三乙二醇一甲基醚的甲磺酸酯(24)往在冰浴中冷卻至0℃的CH2Cl2(100mL)的溶液加入非多分散的三乙二醇一甲基醚(25g，0.15mol)。然后加入三乙基胺(29.5mL，0.22mol)，并將溶液在0℃下攪拌15分鐘，隨后滴加甲基磺酰氯(13.8mL，0.18mol，溶于20mLCH2Cl2)。將反應混合物于0℃下攪拌30分鐘，將其加熱至室溫，然后攪拌2小時。用C鹽(用CH2Cl2，～200mL洗滌)過濾粗反應混合物，然后用H2O(300mL)、5％NaHCO3(300mL)、H2O(300mL)、飽和NaCl(300mL)洗滌，用MgSO4干燥，并蒸發至干。然后將油于真空管中放置2小時以確保干燥，并得到非多分散的標題化合物，為一種黃色的油(29.15g，80％產率)。
實施例20七乙二醇一甲基醚(25)往在THF(1L)中的非多分散的四乙二醇(51.5g，0.27mol)的溶液加入叔丁醇鉀(14.8g，0.13mol，少部分～30分鐘)。然后將反應混合物攪拌1小時，隨后滴加溶于THF(90mL)的24(29.15g，0.12mol)，并將反應混合物攪拌過夜。用C鹽(用CH2Cl2，～200mL洗滌)過濾粗反應混合物并蒸發至干。然后將油溶于HCl(250mL，1N)，并用乙酸乙酯(250mL)洗滌以除去過量的24。可能需要附加的乙酸乙酯(125mL)洗滌以除去殘余的24。重復地用CH2Cl2(125mL體積)洗滌含水相直至已從含水相中除去大部分的25。第一萃取物包含24、25和雙偶合的副產物，并應該用HCl(125mL，1N)反萃取。合并有機層，并蒸發至干。然后將所得的油溶于CH2Cl2(100mL)，并重復地用H2O(50mL體積)洗滌直至除去25。合并含水餾分，總體積500mL，并加入NaCl直至溶液變混濁，然后用CH2Cl2(2×500mL)洗滌。合并有機層，用MgSO4干燥，并蒸發至干得到非多分散的標題化合物，為一種油(16.9g，41％產率)。期望重復純化方法中的一個或多個步驟以確保高純度。
實施例218-溴辛酸酯(26)往在乙醇(100mL)中的8-溴辛酸(5.0g，22mmol)的溶液加入H2SO4(0.36mL，7.5mmol)，將反應物加熱回流，并攪拌3小時。將粗反應混合物冷卻至室溫，并用H2O(100mL)、飽和NaHCO3(2×100mL)、H2O(100mL)、無水MgSO4洗滌，并蒸發至干得到一種澄清的油(5.5g，98％產率)。
實施例22合成MPEG7-C8酯(27)往在醚(90mL)中的非多分散的化合物25(3.0g，8.8mmol)的溶液加入叔丁醇鉀(1.2g，9.6mmol)，并將反應混合物攪拌1小時。然后滴加溶于醚(10mL)的非多分散的化合物26(2.4g，9.6mmol)，并將反應混合物攪拌過夜。用C鹽(用CH2Cl2，～200mL洗滌)將粗反應混合物過濾并蒸發至干。將所得的油溶于乙酸乙酯并用H2O(2×200mL)洗滌，用MgSO4干燥，并蒸發至干。進行柱色譜處理(硅膠，乙酸乙酯至乙酸乙酯/甲醇，10∶1)，并得到非多分散的標題化合物，為一種澄清的油(0.843g，19％產率)。
實施例23MPEG7-C8酸(28)往非多分散的化合物27(0.70g，1.4mmol)的油中加入1N NaOH(2.0mL)，并將反應混合物攪拌4小時。將粗反應混合物濃縮，酸化(pH～2)，用NaCl飽和并用CH2Cl2(2×50mL)洗滌。合并有機層，用飽和NaCl洗滌，用MgSO4干燥，并蒸發至干得到非多分散的標題化合物，為一種澄清的油(0.35g，53％產率)。
實施例24活化MPEG7-C8酸(29)將非多分散的mPEG7-C8-酸28(0.31g，0.64mmol)溶于3ml無水二氯甲烷，然后加入在無水二氯甲烷中的N-羥基琥珀酰亞胺(0.079g，0.69mmol)和EDCI-HCl(135.6mg，0.71mmol)的溶液。將反應物攪拌數小時，然后用1N HCl、水洗滌，用MgSO4干燥，過濾并濃縮。通過柱色譜法純化粗產物，濃縮得到非多分散的標題化合物，為一種澄清的油，并真空干燥。
實施例25-29指圖5所示的路線。
實施例2510-羥基癸酸酯(30)往在乙醇(100mL)中的非多分散的10-羥基癸酸(5.0g，26.5mmol)的溶液加入H2SO4(0.43mL，8.8mmol)，將反應物加熱回流并攪拌3小時。將粗反應混合物冷卻至室溫，并用H2O(100mL)、飽和NaHCO3(2×100mL)、H2O(100mL)洗滌，用MgSO4干燥，并蒸發至干得到非多分散的標題化合物，為一種澄清的油(6.9g，98％產率)。
實施例2610-羥基癸酸酯的甲磺酸酯(31)往CH2Cl2的溶液(27mL)加入非多分散的10-羥基癸酸酯30(5.6g，26mmol)，并在冰浴中冷卻至0℃。然后加入三乙基胺(5mL，37mmol)，并將反應混合物于0℃下攪拌15分鐘。然后加入溶于CH2Cl2(3mL)的甲基磺酰氯(2.7mL，24mmol)，并將混合物于0℃下攪拌30分鐘，除去冰浴，并將反應物于室溫下再攪拌2小時。用C鹽(用CH2Cl2，80mL洗滌)過濾粗反應混合物，并用H2O(100mL)、5％NaHCO3(2×100mL)、H2O(100mL)、飽和NaCl(100mL)洗滌，用MgSO4干燥，并蒸發至干得到非多分散的標題化合物，為一種微黃色的油(7.42g，97％產率)。
實施例27MPEG7-C10酯(32)
往在四氫呋喃(100mL)中的非多分散的七乙二醇一甲基醚25(2.5g，7.3mmol)的溶液加入氫化鈉(0.194g，8.1mmol)，并將反應混合物攪拌1小時。滴加溶于四氫呋喃(10mL)的非多分散的10-羥基癸酸酯31(2.4g，8.1mmol)的甲磺酸酯，并將反應混合物攪拌過夜。用C鹽(用CH2Cl2，～200mL洗滌)過濾反應混合物，并蒸發至干。將得到的油溶于乙酸乙酯，并用H2O(2×200mL)洗滌，用MgSO4干燥，蒸發至干，色譜處理(硅膠，乙酸乙酯/甲醇，10∶1)，色譜處理(硅膠，乙酸乙酯)得到非多分散的標題化合物，為一種澄清的油(0.570g，15％產率)。
實施例28MPEG7-C10酸(33)往非多分散的mPEG7-C10酯32(0.570g，1.1mmol)的油中加入1NNaOH(1.6mL)，并將反應混合物攪拌過夜。將粗反應混合物濃縮，酸化(pH～2)，用NaCl飽和，并用CH2Cl2(2×50mL)洗滌。合并有機層，用飽和NaCl(2×50mL)洗滌，用MgSO4干燥，并蒸發至干得到非多分散的標題化合物，為一種澄清的油(0.340g，62％產率)。
實施例29活化MPEG7-C10酸(34)使用類似于以上在實施例24中所述的方法將非多分散的酸33活化。
實施例30和31指圖6所示的路線。
實施例30合成C18(PEG6)寡聚體(36)將非多分散的硬脂酰氯35(0.7g，2.31mmol)緩慢加到在苯中的PEG6(5g，17.7mmol)和吡啶(0.97g，12.4mmol)的混合物。將反應混合物攪拌數小時(～5)。反應后使用乙酸乙酯/甲醇作為顯色溶劑進行TLC處理。然后用水洗滌反應混合物，用MgSO4干燥，濃縮并真空干燥。通過FABMS分析純化的非多分散的化合物36m/e 549/M+H。
實施例31活化C18(PEG6)寡聚體在以下兩步中完成非多散的C18(PEG6)寡聚體的活化1)將非多分散的硬脂酰基-PEG6 36(0.8g，1.46mmol)溶于甲苯，并將其加到光氣溶液(10mL，20％，在甲苯中)，用冰浴進行冷卻。將反應混合物于0℃下攪拌1小時，然后于室溫下攪拌3小時。隨后蒸餾掉光氣和甲苯，并用P2O5將殘余的非多分散的硬脂酰基PEG6氯甲酸酯37干燥過夜。
2)往在無水二氯甲烷中的非多分散的硬脂酰基PEG6氯甲酸酯36(0.78g，1.27mmol)和TEA(128mg，1.27mmol)的溶液加入在二氯甲烷中的N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)溶液。將反應混合物攪拌16小時，然后用水洗滌，用MgSO4干燥，過濾，濃縮并真空干燥得到非多分散的活化的C18(PEG6)寡聚體38。
實施例32-37指圖7所示的路線。
實施例32四乙二醇一芐基醚(39)往非多分散的四乙二醇(19.4g，0.10mol)的油加入NaOH溶液(4.0g，在4.0mL中)，并將反應物攪拌15分鐘。然后加入芐基氯(3.54mL，30.8mmol)，并將反應混合物加熱至100℃，并攪拌過夜。將反應混合物冷卻至室溫，用飽和NaCl(250mL)稀釋，并用CH2Cl2(2×200mL)洗滌。合并有機層，用飽和NaCl洗滌，用MgSO4干燥，并進行色譜處理(硅膠，乙酸乙酯)得到非多分散的標題化合物，為一種黃色的油(6.21g，71％產率)。
實施例33四乙二醇一芐基醚的甲磺酸酯(40)往CH2Cl2的溶液(20mL)加入非多分散的四乙二醇一芐基醚39(6.21g，22mmol)，并在冰浴中冷卻至0℃。然后加入三乙基胺(3.2mL，24mmol)，并將反應混合物于0℃下攪拌15分鐘。然后加入溶于CH2Cl2(2mL)的甲基磺酰氯(1.7mL，24mmol)，并將反應混合物于0℃下攪拌30分鐘，除去冰浴，并將反應物于室溫下再攪拌2小時。用C鹽(用CH2Cl2，80mL洗滌)過濾粗反應混合物，用H2O(100mL)、5％NaHCO3(2×100mL)、H2O(100mL)、飽和NaCl(100mL)洗滌濾液，并用MgSO4干燥。用含有活性碳(10g)的襯墊色譜處理所得的黃色的油得到非多分散的標題化合物，為一種澄清的油(7.10g，89％產率)。
實施例34八乙二醇一芐基醚(41)往含有氫化鈉(0.43g，18mmol)的四氫呋喃(140mL)的溶液滴加在四氫呋喃(10mL)中的非多分散的四乙二醇(3.5g，18mmol)的溶液，并將反應混合物攪拌1小時。然后滴加溶于四氫呋喃(10mL)的非多分散的四乙二醇一芐基醚的甲磺酸酯40(6.0g，16.5mmol)，將反應混合物攪拌過夜。用C鹽(用CH2Cl2，250mL洗滌)過濾粗反應混合物，用C鹽(用CH2Cl2，250mL洗滌)過濾粗反應產物，并用H2O洗滌濾液，用MgSO4干燥，并蒸發至干。對所得的油進行色譜處理(硅膠，乙酸乙酯/甲醇，10∶1)和色譜處理(硅膠，氯仿/甲醇，25∶1)得到非多分散的標題化合物，為一種澄清的油(2.62g，34％產率)。
實施例35合成硬脂酸酯PEG8-芐基(43)往非多分散的八乙二醇一芐基醚41(0.998g，2.07mmol)和吡啶(163.9mg，2.07mmol)的攪拌和冷卻的溶液中加入在苯中的非多分散的硬脂酰氯42(627.7mg，2.07mmol)。將反應混合物攪拌過夜(18小時)。第二天用水洗滌反應混合物，用MgSO4干燥，濃縮并真空干燥。然后用快速硅膠柱色譜處理粗產物，使用10％甲醇/90％氯仿為洗脫劑。合并含有產物的餾分，濃縮并真空干燥得到非多分散的標題化合物。
實施例36硬脂酸酯-PEG8-芐基的水解往非多分散的硬脂酸酯-PEG8-Bzl43(0.854g，1.138mmol)的甲醇溶液加入Pd/C(10％)(鈀，10％wt，擔載在活性碳上)。將反應混合物在氫氣氛下攪拌過夜(18小時)。然后將溶液過濾，濃縮并通過快速柱色譜法使用10％甲醇/90％氯仿進行純化，收集Rf＝0.6的餾分，濃縮并干燥得以非多分散的酸44。
實施例37活化C18(PEG8)寡聚體如關于以上實施例31中的硬脂酸酯-PEG6所述對非多分散的硬脂酸酯-PEG8寡聚體進行兩步活化得到非多分散的活化的C18(PEG8)寡聚體45。
實施例38合成活化的三乙二醇一甲基寡聚體以下的描述指圖8所示的路線。在N2氣氛下將含有20％的光氣(100mL，大約18.7g，189mmol光氣)的甲苯溶液冷卻至0℃。將非多分散的mTEG(三乙二醇，一甲基醚，7.8g，47.5mmol)溶于25mL無水乙酸乙酯，并將其加到冷卻的光氣溶液。將混合物于0℃下攪拌1小時，然后將其加熱至室溫，并再攪拌2.5小時。通過真空蒸餾法除去殘余的光氣、乙酸乙酯和甲苯，以留下非多分散的mTEG氯甲酸酯46，為一種澄清的油殘余物。
將非多分散的殘余物46溶于加入TEA(三乙基胺，6.62mL，47.5mmol)和NHS(N-羥基琥珀酰亞胺，5.8g，50.4mmol)的50mL無水二氯甲烷。將混合物于室溫和無水氣壓下攪拌20小時，在此期間出現大量白色沉淀。將混合物過濾除去沉淀，并真空濃縮。在二氯甲烷中加工所得的油47，并用冷的去離子洗滌二次，用1N HCl洗滌二次，并用鹽水洗滌一次。用MgSO4干燥有機物，過濾并濃縮得到非多分散的標題化合物，為一種澄清的淺黃色油。如果需要的話，還可以通過快速硅膠色譜法，使用EtOAc作為洗脫劑純化NHS酯。
實施例39合成活化的棕櫚酸酯-TEG寡聚體以下的描述指圖9所示的路線。將非多分散的棕櫚酸酐(5g；10mmol)溶于無水THF(20mL)，并在室溫下攪拌。往攪拌的溶液加入3mol過量的吡啶，然后加入非多分散的三乙二醇(1.4mL)。將反應混合物攪拌1小時(用TLC監測反應的進行；乙酸乙酯-氯仿；3∶7)。
在反應結束時，除去THF，將產物與10％H2SO4酸混合，并用乙酸乙酯(3×30mL)萃取。連續地用水、鹽水洗滌合并的萃取物，用MgSO4干燥，并蒸發得到非多分散的產物48。
將在DMF(～10mL)中的N，N′-二琥珀酰亞胺基碳酸酯(3mmol)的溶液加到在10mL無水DMF中的非多分散的產物48(1mmol)的溶液，同時進行攪拌。將氫化鈉(3mmol)緩慢地加到反應混合物。將反應混合物攪拌數小時(例如5小時)。加入二乙醚以沉淀活化的寡聚體。此過程重復3次，并在最后干燥產物。
實施例40用活化的六乙二醇一甲基寡聚體合成人生長激素-寡聚體偶聯物以下的描述指圖10所示的路線。與以上實施例38中的非多分散的三乙二醇類似地制備非多分散的活化的六乙二醇一甲基醚。在N2氣氛下和在冰/鹽水浴中冷卻在甲苯中的20％光氣的溶液(35mL，6.66g，67.4mmol光氣)。將非多分散的六乙二醇50(1.85mL，2.0g，6.74mmol)溶于5mL無水EtOAc，并通過注射器加到光氣溶液。將反應混合物在冰浴中保持攪拌1小時，移出并再在室溫下攪拌2.5小時。通過真空蒸餾除去光氣、EtOAc和甲苯，余下非多分散的化合物51，為一種澄清的油殘余物。
將非多分散的殘余物51溶于20mL無水二氯甲烷，并放置在無水惰性氣氛下。加入三乙基胺(0.94mL，0.68g，6.7mmol)，然后加入NHS(N-羥基琥珀酰亞胺，0.82g，7.1mmol)，并將反應混合物在室溫下攪拌18小時。用硅膠將混合物過濾以除去白色沉淀物，并真空濃縮。將殘余物回收于二氯甲烷，用冷水洗滌二次，用1N HCl洗滌一次并用鹽水洗滌一次。有機物用Na2SO4干燥，過濾并濃縮。通過快速色譜法(硅膠，EtOAc)完成最終的純化得到UV活性非多分散的NHS酯52。
將根據購自Serono of Randolph，Massachusetts的商品名為SaizenTM的人生長激素(生長激素(rDNA來源)用于注射)溶于DMSO，以使hGH濃度為0.58mmol。加入TEA(278當量)并將溶液攪拌大約10分鐘。加入2當量、5當量或30當量來自在無水THF中的0.2M活化的寡聚體的溶液的非多分散的活化的六乙二醇52。將反應物于室溫下攪拌45分鐘至1小時。用在600μl 0.1％在水中的TFA終止各反應混合物的等分試樣的反應。在圖14中顯示2個聚合物當量和5個聚合物當量的反應混合物與未偶聯的hGH的HPLC的比較。圖15顯示30個聚合物當量反應的HPLC分析。
通過分析HPLC，采用反相C18柱和水/乙腈梯度純化進行質譜分析的偶聯物的樣品。收集來自2當量反應混合物的全部峰，濃縮并用MALDI質譜分析。這種材料的質譜表明一偶聯、二偶聯、三偶聯和四偶聯的hGH和某些殘余的未反應的hGH的質譜(圖16)。如圖17所示，根據極性初步純化5當量的反應混合物。濃縮的餾分的MALDI質譜(圖18、圖19和圖20)表明蛋白質的偶聯水平隨保留時間而增大。餾分E的電噴霧質譜，圖21得到的結果與六偶聯的hGH的存在相符。收集來自30個聚合物當量的反應混合物的全部峰并濃縮。電噴霧質譜色析，圖22顯示十或更高偶聯的物質。
類似的方法用于將hGH與實施例18、24、29、31或37的活化的寡聚體偶聯。
實施例41用活化的棕櫚酸酯-TEG寡聚體合成人生長激素-寡聚體偶聯物使用來自實施例39的活化的聚合物進行類似于以上在實施例41中所述的方法。通過HPLC檢查偶聯的進行，將20μL偶聯反應混合物置于小瓶，并用100μL的0.1％ TFA-水-IPA(1∶1)稀釋。結果如圖23所示。2小時后，通過加入0.1％TFA-水而終止反應。通過制備HPLC純化偶聯產物。
實施例42用活化的TEG寡聚體合成人生長激素-寡聚體偶聯物將1當量購自Serono of Randolph，Massachusetts的商品名為SaizenTM的人生長激素(hGH)(生長激素(rDNA origin)，用于注射)溶于DMSO(1mg/125μL)，并在室溫下攪拌2-4分鐘。加入2當量的TEA，然后加入2當量的溶于THF的實施例39的活化的寡聚體。2小時后，通過加入0.1％TFA-水終止反應。通過圖24所示的制備HHPLC純化偶聯產物。
用5當量的TEA和5當量的實施例39的活化的寡聚體進行類似的操作。如圖25所示通過制備HPLC法，使用C18柱純化偶聯產物。流動相和洗脫時間如下
將收集的餾分凍干成白色粉末。該化合物的質譜如圖26和27所示。
使用9當量的TEA和9當量的實施例39的活化的寡聚體行類似的操作。如圖28所示，通過制備HPLC法，使用C18柱純化偶聯產物。
實施例43測定人生長激素的混合物-寡聚體偶聯物的分散系數如下測定人生長激素的混合物-寡聚體偶聯物的分散系數。例如，如以上實施例40所述，提供人生長激素的混合物-寡聚體偶聯物。通過HPLC純化第一混合物樣品以分離(separate和isolate)樣品中的不同的人生長激素寡聚體偶聯物。假定每種分離的餾分包含完全單分散的偶聯物的混合物，則“n”等于收集的餾分數。所述混合物可以包括一種或多種偶聯物，包括一、二、三、四、五、六、七、八和/或九偶聯物。每種分離的混合物的餾分通過質譜法分析測定餾分的質量，從而根據偶聯的程度將每種分離的餾分分類，并得到樣品中的每個偶聯物的變量“Mw”的值。
第二混合物樣品通過HPLC法分析得到HPLC跡線。假定偶聯并沒導致摩爾吸光度的改變，則由對應于特定偶聯物的HPLC的峰之下的面積得到混合物中特定偶聯物的重量百分數，為HPLC跡線的所有峰之下的總面積的百分數。收集樣品并凍干以確定樣品的無水克重量。將樣品的克重量乘以樣品每個組分的重量百分數來確定樣品中每個偶聯物的克重量。通過以下方法確定特定偶聯物(ith偶聯物)的變量“Ni”將樣品中特定偶聯物的克重量除去特定偶聯物的質量并將此商值乘以Avagadro數(6.02205×1023mole-1)，以上確定的Mi，得到樣品中特定的偶聯物的分子數量，Ni。然后利用驛每個偶聯物所測得的n、Mi和對每個偶聯物所測得的Ni計算分散系數。
實施例44如下進行試驗細胞培養如前述，在293細胞(人腎胚胎細胞系)中產物表達全長人GHR的穩定的克隆，指定為293GHR。
轉錄試驗用所報道的包含融合到最小的TK啟動子上的Stat5結合元件(LHRE)和螢蟲素酶的構建體在293 GHR細胞中進行這些試驗。將β-半乳糖苷酶表達載體作為轉染對照進行共同轉染，并校正螢蟲素酶的β-半乳糖苷酶活性值。在轉染后16小時，將細胞轉染至不含血清的培養基，并用GH或激動劑處理6小時。螢蟲素酶活性報道為在特定的實驗中由GH的允許在重復的實驗之間進行比較的最大活性的百分數。由GH刺激的最大活性是GH刺激的倍數誘導，即將校對的細胞刺激的GH的螢蟲素酶值除以校對的未刺激的細胞的螢蟲素酶值。試驗的結果如圖29和30所示，其中Genotropin為人生長激素(標準品，不是本發明的部分)，GH-002為2當量mTEG偶聯物，GH-003為5當量mTEG偶聯物，GH-004為5當量mTEG偶聯物，Prot hGH為人生長激素(標準品，不是本發明的部分)，而hGH-TEG為9當量mTEG偶聯物。
在本說明書中已公開了本發明的典型的優選實施方案。雖然使用了具體的術語，但它們僅在一般和描述的含義上使用，且其目的不在于限定以下權利要求所述的本發明的保護范圍。
權利要求
1.一種偶聯物的混合物，所述每個偶聯物包含與含有聚亞烷基二醇部分的寡聚體偶合的生長激素藥物，該混合物具有標準偏差小于大約22道爾頓的分子量分布。
2.根據權利要求1的混合物，其中所述分子量分布的標準偏差小于大約14道爾頓。
3.根據權利要求1的混合物，其中所述分子量分布的標準偏差小于大約11道爾頓。
4.根據權利要求1的混合物，其中所述聚亞烷基二醇部分具有至少2、3或4個聚亞烷基二醇亞基。
5.根據權利要求1的混合物，其中所述聚亞烷基二醇部分具有至少5或6個聚亞烷基二醇亞基。
6.根據權利要求1的混合物，其中所述聚亞烷基二醇部分具有至少7個聚亞烷基二醇亞基。
7.根據權利要求6的混合物，其中所述聚亞烷基二醇部分為聚丙二醇部分。
8.根據權利要求7的混合物，其中所述聚丙二醇是均一的。
9.根據權利要求1的混合物，其中所述生長激素藥物為人生長激素。
10.根據權利要求9的混合物，其中所述寡聚體與人生長激素的氨基官能團共價偶合。
11.根據權利要求10的混合物，其中所述氨基官能團為選自以下的人生長激素的氨基酸殘基Phe1、Lys38、Lys41、Lys70、Lys115、Lys140、Lys145、Lys158、Lys168和Lys172。
12.根據權利要求9的混合物，其中所述偶聯物包含多數寡聚體。
13.根據權利要求1的混合物，其中所述聚亞烷基二醇部分為聚丙二醇部分。
14.根據權利要求13的混合物，其中所述聚丙二醇部分為均一的。
15.根據權利要求1的混合物，其中所述寡聚體由均一的聚丙二醇部分組成，且其中所述偶聯物各自是兩親平衡的，因而每個偶聯物溶于水并能夠穿透生物膜。
16.根據權利要求1的混合物，其中所述生長激素藥物與寡聚體共價偶合。
17.根據權利要求16的混合物，其中所述生長激素藥物與寡聚體通過可水解的鍵共價偶合。
18.根據權利要求1的混合物，其中所述生長激素藥物與聚亞烷基二醇部分共價偶合。
19.根據權利要求18的混合物，其中所述寡聚體還包含與聚亞烷基二醇部分共價偶合的親脂部分。
20.根據權利要求1的混合物，其中所述寡聚體還包含親脂部分。
21.根據權利要求20的混合物，其中所述生長激素藥物與親脂部分共價偶合。
22.根據權利要求1的混合物，其中所述偶聯物包含多數寡聚體。
23.根據權利要求22的混合物，其中所述多數寡聚體中的每一個寡聚體相同。
24.根據權利要求1的混合物，其中所述寡聚體包含通過不可水解的鍵與生長激素藥物共價偶合的第一聚亞烷基二醇部分和通過可水解的鍵與第一聚亞烷基二醇部分共價偶合的第二聚亞烷基二醇部分。
25.根據權利要求24的混合物，其中所述寡聚體還包含與第二聚亞烷基二醇部分共價偶合的親脂部分。
26.根據權利要求1的混合物，其中所述偶聯物各自為兩親平衡的，因而每個偶聯物溶于水并能夠穿透生物膜。
27.一種藥物組合物，所述組合物包含根據權利要求1的混合物；和藥學上可接受的載體。
28.一種治療需要這種治療的受試者的生長激素缺乏的方法，該包括給患者施用有效量的偶聯物的混合物以治療生長激素缺乏，該偶聯物各自包含與含有聚亞烷基二醇部分的寡聚體偶合的生長激素藥物，該混合物具有標準偏差小于大約22道爾頓的分子量分布。
29.一種加速動物生長速率的方法，該方法包括給動物施用足以加速動物生長速率的數量的偶聯物的混合物，該偶聯物各自包含與含有聚亞烷基二醇部分的寡聚體偶合的生長激素藥物，該混合物具有標準偏差小于大約22道爾頓的分子量分布。
30.一種基本上單分散的偶聯物的混合物，每個偶聯物包含與含有聚亞烷基二醇部分的寡聚體偶合的生長激素藥物。
31.根據權利要求30的混合物，其中該聚亞烷基二醇部分具有至少2、3或4個聚亞烷基二醇亞基。
32.根據權利要求30的混合物，其中該聚亞烷基二醇部分具有至少5或6個聚亞烷基二醇亞基。
33.根據權利要求30的混合物，其中該聚亞烷基二醇部分具有至少7個聚亞烷基二醇亞基。
34.根據權利要求30的混合物，其中所述混合物中至少大約96％、97％、98％或99％的偶聯物具有相同的分子量。
35.根據權利要求30的混合物，其中所述混合物為單分散的混合物。
36.根據權利要求30的混合物，其中所述混合物為基本上完全單分散的混合物。
37.根據權利要求30的混合物，其中所述混合物中至少大約96％、97％、98％或99％的偶聯物具有相同的分子量并具有相同的分子結構。
38.根據權利要求30的混合物，其中所述混合物為完全單分散的混合物。
39.根據權利要求30的混合物，其中所述聚亞烷基二醇部分為均一的聚丙烯部分。
40.一種基本上單分散的偶聯物的混合物，每個偶聯物包含與寡聚體共價偶合的人生長激素，所述寡聚體包含均一的具有至少7個聚丙二醇亞基的聚丙二醇部分。
41.根據權利要求40的混合物，其中所述寡聚體由均一的具有至少7個聚丙二醇亞基的聚丙二醇部分組成，且其中每個偶聯物是兩親平衡的，因而每個偶聯物溶于水并能夠穿透生物膜。
42.一種偶聯物的混合物，所述的每個偶聯物包含與具有聚亞烷基二醇部分的聚合物偶合的生長激素藥物，其中述混合物的分散系數(DC)大于10,000，其中DC=(Σi=1nNiMi)2Σi=1nNiMi2Σi=1nNi-(Σi=1nNiMi)2]]>其中n為樣品中不同分子的數量；Ni為樣品中ith分子的數量；和Mi為ith分子的質量。
43.根據權利要求42的混合物，其中所述分散系數大于100,000。
44.根據權利要求42的混合物，其中所述分散系數大于500,000。
45.根據權利要求42的混合物，其中所述生長激素藥物為人生長激素。
46.根據權利要求42的混合物，其中所述聚亞烷基二醇部分為聚丙二醇部分。
47.根據權利要求42的混合物，其中所述聚丙二醇部分是均一的。
48.根據權利要求42的混合物，其中所述聚亞烷基二醇部分具有至少7個聚亞烷基二醇亞基。
49.一種偶聯物的混合物，其中每個偶聯物包含與寡聚體偶合的生長激素藥物；和具有相同數量的聚亞烷基二醇亞基。
50.根據權利要求49的混合物，其中所述生長激素藥物為人生長激素。
51.根據權利要求49的混合物，其中所述聚亞烷基二醇部分為聚丙二醇部分。
52.根據權利要求51的混合物，其中所述聚丙二醇部分是均一的。
53.根據權利要求49的混合物，其中所述聚亞烷基二醇部分具有至少7個聚亞烷基二醇亞基。
54.一種偶聯物的混合物，其中每個偶聯物具有相同的分子量并具有下式生長激素藥物 其中B為鍵合部分；L為接頭部分；G、G′和G″為獨立選擇的間隔部分；R為親脂部分而R′為聚亞烷基二醇部分，或者R′為親脂部分而R為聚亞烷基二醇部分；T為末端部分；h、i、j、k、m和n獨立地為0或1，附帶條件是當R為聚亞烷基二醇部分時，m為1；當R′為聚亞烷基二醇部分時，n為1；和p為1至生長激素藥物上親核殘基數的整數。
55.根據權利要求54的混合物，其中所述聚亞烷基二醇基團為聚丙二醇部分。
56.根據權利要求55的混合物，其中所述聚丙二醇基團是均一的。
57.根據權利要求54的混合物，其中i、j、k和n為0；R為均一的聚丙二醇；和所述偶聯物各自是兩親平衡的，因而每個偶聯物溶于水并能夠穿透生物膜。
58.根據權利要求54的混合物，其中R為具有至少7個聚亞烷基二醇亞基的聚亞烷基二醇部分。
59.一種用于合成基本上單分散的偶聯物的混合物的方法，每個偶聯物包含與含有聚乙二醇部分的寡聚體偶合的生長激素藥物，該方法包括使基本上單分散的包含具有式I的結構的化合物的混合物與基本上單分散的包含具有式II的結構的化合物的混合物在足以得到基本上單分散的包含具有式III的結構的聚合物的條件下反應，R1(OC2H4)m-O-X+(I)其中R1為H或親脂部分；m為1-25；而X+為陽離子，R2(OC2H4)n-OMs (II)其中R2為H或親脂部分；而n為1-25，R2(OC2H4)m+n-OR′ (III)將基本上單分散的包含式III的聚合物的混合物活化得到基本上單分散的能夠與生長激素藥物反應的活化的聚合物的混合物；和使所述基本上單分散的活化的聚合物的混合物與基本上單分散的生長激素藥物的混合物在足以得到基本上單分散的偶聯物的混合物的條件下反應，所述偶聯物各自包含與寡聚體偶合的生長激素藥物，所述寡聚體包含具有m+n個亞基的聚乙二醇部分。
60.根據權利要求59的方法，其中R2為脂肪酸部分或脂肪酸部分的酯。
61.根據權利要求60的方法，其中所述脂肪酸部分或脂肪酸部分的酯包含長度至少為5個碳原子的烷基部分。
62.根據權利要求59的方法，其中R1為甲基。
63.根據權利要求59的方法，所述方法還包括使基本上單分散的包含具有式V的結構的化合物的混合物與甲基磺酰鹵化物在足以得到基本上單分散的包含具有式II的結構的化合物的混合物反應，R2(OC2H4)n-OH(V)R2(OC2H4)n-Oms (II)。
64.根據權利要求63的方法，所述方法還包括使基本上單分散的包含具有式VI的結構的化合物的混合物與基本上單分散的包含具有式VII的結構的化合物的混合物在足以得到基本上單分散的包含具有式VIII的結構的化合物的混合物的條件下反應R2-OMs (VI)其中R2為親脂部分；R3(OC2H4)m-O-X2+(VII)其中R3為芐基、三苯甲基或THP，而X2+為陽離子；R3(OC2H4)m-OR2(VIII)；和使基本上單分散的包含具有式VIII的結構的化合物的混合物在足以得到基本上單分散的包含具有式V的結構的化合物的混合物的條件下反應R2(OC2H4)m-OH (V)。
65.根據權利要求59的方法，所述方法還包括使基本上單分散的包含具有式IV的結構的化合物的混合物在足以得到基本上單分散的包含具有式I的結構的化合物的混合物的條件下反應R1(OC2H4)n-OH (IV)R1(OC2H4)n-O-X+(I)。
66.根據權利要求59的方法，其中所述基本上單分散的混合物的活化包括使基本上單分散的式III的聚合物的混合物與N-羥基琥珀酰亞胺反應得到能夠與生長激素藥物反應的活化的聚合物。
67.根據權利要求59的方法，其中所述生長激素藥物為人生長激素，且其中所述基本上單分散的活化的聚合物的混合物與基本上單分散的人生長激素的混合物的反應包括使基本上單分散的活化的聚合物的混合物與選自Phe1、Lys38、Lys41、Lys70、Lys115、Lys140、Lys145、Lys158、Lys168、Lys172及其組合的人生長激素的氨基酸殘基的氨基官能團反應得到基本上單分散的偶聯物的混合物，所述偶聯物各自包含與一個或多個寡聚體偶合的人生長激素，所述寡聚體包含具有m+n個亞基的聚乙二醇部分。
全文摘要
本發明公開了一種偶聯物的混合物，其中所述混合物中每個偶聯物包含與含有聚亞烷基二醇部分的寡聚體偶合的生長激素藥物。
文檔編號A61K38/00GK1538852SQ02815301
公開日2004年10月20日 申請日期2002年6月4日 優先權日2001年6月4日
發明者N·N·埃克烏里貝, N N 埃克烏里貝, C·H·普里斯, 普里斯, A·M·安薩里, 安薩里, A·L·奧登保, 奧登保 申請人:諾貝克斯公司