專利名稱：一種新型的人源化抗cd22抗體的制作方法
技術領域：
:本發明涉及一種新型的人源化抗⑶22抗體，屬于生物工程技術領域。
背景技術：
:非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin lymphoma, NHL)是一組起源于淋巴結和其他淋巴組織的惡性腫瘤,是淋巴瘤的一大類型(除霍奇金淋巴瘤以外)。主要臨床表現可歸納如下:1、淺表淋巴結腫大或形成結節腫塊；2、體內深部淋巴結腫塊；3、結外淋巴組織的增生和腫塊；4、全身癥狀，包括發熱、盜汗、乏力和體重減輕。在美國該病是增長第二快的癌癥，以每年新增約55，000例的速度增加。近年來，我國惡性淋巴瘤發病率上升加快，已進入十大高發腫瘤行列，我國NHL的發病率從上個世紀的2/10萬已快速上升至7/10萬。系統性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus, SLE)是一種彌漫性、全身性自身免疫病，主要累及皮膚粘膜、骨骼肌肉、腎臟及中樞神經系統，同時還可以累及肺、心臟、血液等多個器官和系統，有多種臨床表現；血清中可以檢測到自身抗體和免疫學異常。全球SLE患病率為48/10萬-117/10萬，發病率達1.5/10萬-7.6/10萬；多發生于20 40歲的育齡女性，男女發病率之比約為1: 7 1: 10，其高患病率、高病死率嚴重威脅著各國人群的身心健康。過去幾十年里，非霍奇金淋巴瘤和系統性紅斑狼瘡的主要治療方法為放療和化療，然而單克隆抗體藥物的開發為我們提供了新的治療方案，可以使病人有效避免對放療化療的依賴和毒副作用。美國FDA批準抗⑶20抗體美羅華(Rituximab)上市是一個歷史性的里程碑。盡管美羅華對NHL有效且毒性可以控制，但不是所有的病人都對它有治療反應，其實每一個有治療反應的病人最后部會復發，然而美羅華鼓勵研究者們去尋找新的靶點(路萍萍等，中國實驗而液學雜志，2006 ；14(6):1258-1261)，這些靶點的表達方式和生理特點與CD20不同 ，但是可能比美羅華更有效或能夠治療美羅華無效的B細胞淋巴瘤病人。⑶22抗原是眾多淋巴細胞表面靶點中的一個，大約60-80%的B細胞惡性腫瘤表達CD22，由此使其成為被動免疫療法的潛在靶標(Cesano，A.，Gayko, U.(2003) Semin.0ncol.30:253-257)。⑶22抗原，又稱唾液酸結合的免疫球蛋白樣凝集素2 (SIGLEC2)，是一種B細胞的II型跨膜糖蛋白，存在α，β兩種不同的亞型，分子量約為140KD左右。⑶22的胞外區由7個免疫球蛋白結構域組成，其N端結構域為V-免疫球蛋白結構域，負責與a 2，6Sia配體相結合；從功能角度講也是免疫球蛋白超家族的一員，限制性表達于成熟B細胞和大多數B細胞NHL的表面，與B細胞的發展、分化和功能有著密切的關系。⑶22分子的生物學功能是通過調節信號傳導通路，配體結合結構域，對B細胞信號傳導的抑制性調節，直接參與B細胞向骨髓的歸巢等方面來達到抗瘤效果。其特點為減弱免疫源性和加強效應因子的相互作用。經過近20年的艱苦努力，抗⑶22抗體治療NHL已經取得了很大的進展。
目前,處于臨床研究階段的以⑶22抗原為祀點的抗體藥物有:Immunomedics公司
的人源化抗體-依帕珠單抗(Epratuzumab);惠氏的Inotuzumab ozogamicin是與化學
毒素偶聯的人源化單抗；NIH的BL22是在鼠抗體的基礎上融合了 PE38的免疫毒素；以及深圳龍瑞藥業的SM03嵌合抗體等。Epratuzumab是人源化單克隆抗體LL2的IgGl類，直接祀向0)22抗原，能通過CD 2 2介導胞漿內相應蛋白磷酸化，促進Ra j i細胞系凋亡，抑制其分化，從而達到治療Burkitt' s淋巴瘤的目的。Inotuzumab Ozogamicin(CMC-544)是一種抗體革巴向化療劑，由人源化抗⑶22抗體共價連接腫瘤抗生素calicheamicin(烯二炔類高效抗腫瘤抗生素)組成，是一種強效細胞毒性劑，可有效對抗CD22B細胞性非霍奇金淋巴瘤，主要不良反應為可逆性血小板減少。BL22 (RFB4 (dsFv)-PE38)是重組免疫毒素。BL22為RFB4通過半胱氨酸殘基的二硫鍵與可變區重鏈的連接物，再與PE38融合成為RFB4(dsFv)-PE38。BL22是第一個在嘌呤同系物抑制的毛細胞白血病(hairy cell leukemia，HCL)病人中產生高完全反應率的免疫毒素。Kreitman等研究HCL病人的臨床I期實驗證明BL22是可以耐受和高度有效的。雖然HCL對BL22產生完全反應，但BL22對⑶22抗原表達低的病人療效較低。研究者希望在補體決定區(CDR)發生突變以增加抗體親和能力和療效，但沒有成功。SM03嵌合抗體是分別克隆鼠抗人CD22單抗輕/重鏈可變區基因VL/VH，構建重組SM03嵌合抗體。SM03嵌合抗體特異于B細胞CD22抗原，對惡性淋巴瘤細胞具有生長抑制效應，為惡性B細胞淋巴瘤的臨床治療和應用奠定了基礎
發明內容
:本發明在現有技術的基礎上，研制出一種新型的人源化抗CD22單抗。以鼠源RFB4為親本抗體，采用CDR移植技術對其進行人源化，將親本抗體的CDR區移植到人IgGl中，并應用計算機大分子模擬技術對 人源化后的CD22抗體的蛋白結構模型進行分析，最終確定進行突變的6個氨基酸位點，如序列中斜體字部分所示，通過合成兼并性引物的方法，構建包含64種多態性的人源化抗體hRFB4噬菌體抗體庫。對該噬菌體抗體庫進行展示并篩選出5種親和力較高的抗體DNA序列，并根據核苷酸序列翻譯得到相應的氨基酸序列。通過序列分析比較發現這5個人源化hRFB4抗體的基因序列分別在4個不同的氨基酸位點存在差異，但是它們都可以與CD22抗原結合，表現出較高的抗體親和力，具有相似的生物學功能。將5個人源化的⑶22抗體——hRFB4,分別命名為YQ22-1至YQ22-5，五個抗體的重鏈可變區的氨基酸序列均為SEQ ID NO:1，輕鏈可變區的氨基酸序列分別如SEQ ID NO:2，3，4，5，6所示，具體如下:YQ22-1:vh:evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfs ^ydmsI'
WVRQAPGKGLEffVS IyISSGGGTTYYPDTVKGI RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR
JhSC^Iygssygvlf^1 Wgqgtlytyss [seq id no:i]Vl:DIQMTQSPSSLSASVGDRVTINC ![RasqdiSNYLNI WYQQKPGKAPKLLIY @|TSILHS|<GVPSRFSGSGSGTDFSLTISSLQPEDFATYFC jQQGNTLPWlI FGQGT [SEQ ID NO:2]
權利要求
1.一種特異性結合人CD22的單克隆抗體，由可變區和恒定區構成，可變區包含鼠源的CDR和人源的框架區，其特征在于，所述抗體的重鏈可變區如SEQ ID NO:1組成，所述抗體的輕鏈可變區分別由SEQ ID NO:2，3，4，5，6組成。
2.根據權利要求1所述的單克隆抗體，其特征在于，所述抗體的恒定區為人IgGl、IgG2、IgG3或IgG4的任意一種。
3.根據權利要求2所述的單克隆抗體，其特征在于，所述抗體的恒定區為人IgGl。
4.根據權利要求1-3所述的單克隆抗體，其特征在于，所述的抗體是CDR移植的人源化抗體。
5.多核苷酸序列，其編碼如權利要求1-3中任一項所述的單克隆抗體。
6.—種表達載體,所述載體包含權利要求5所述的多核苷酸序列，所述的載體是PCDNA3.1。
7.—種宿主細胞，所述的宿主細胞經由權利要求6所述的載體轉染而來。
8.一種制備權利要求1_3、4所述單克隆抗體的制備方法，所述方法包括:使用編碼所述單克隆抗體的DNA表達載體轉染宿主細胞，獲得含有所述抗體的細胞培養上清液，并經Protien A柱純化制備目的蛋白。
9.權利要求1_3、4中任一項的單克隆抗體用于制備治療由表達CD22的細胞介導的疾病中的用途。
10.根據權利要求9所述的單克隆抗體的用途，所述的疾病是惡性淋巴瘤和自身免疫性疾病，具體指非霍奇金淋巴瘤和系統性紅斑狼瘡。
全文摘要
本發明涉及生物工程領域，更具體的涉及一種新型的人源化抗CD22抗體。本發明以鼠源抗體RFB4為親本抗體，采用CDR移植技術進行人源化，人源化后的新抗體hRFB4具有與親本抗體相近的親和力，同時保持了親本抗體與CD22抗原的結合能力，以及抗體引起的抗原抗體復合物的細胞內化活性。與親本抗體比較，人源化hRFB4抗體中人源蛋白序列比例達到90％以上，大大降低了免疫原性，避免了HAMA反應的發生。
文檔編號A61P37/02GK103214578SQ20131017000
公開日2013年7月24日 申請日期2013年5月10日 優先權日2013年5月10日
發明者尹琪, 王康, 郭晶晶, 高震, 孟艷敏, 劉志剛 申請人:北京東方百泰生物科技有限公司