專利名稱：一種調經活血片的制備方法及應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及中藥制劑技術領域，具體涉及一種調經活血片的制備方法及應用。
背景技術：
調經活血片記載于衛生部標準WS3-B-0614-91，由木香20g、川芎20g、醋制延胡索 20g、當歸60g、熟地黃40g、赤芍40g、紅花30g、烏藥30g、白術30g、丹參60g、制香附60g、甘草水制吳茱萸10g、澤蘭60g、雞血藤60g、菟絲子80g作為原料藥制成，能調經活血，行氣止痛。用于月經不調，行經腹痛。
現有技術中，尚未有調經活血片在提取制備方面采用超臨界和微波技術的報道， 而采用打粉和水煎煮的方法，工藝粗糙、落后，雜質多，導致患者用量過大，不方便服用，嚴重影響了本品在臨床上應用。發明內容
發明目的為了解決上述問題，本發明的目的在于提供一種調經活血片的制備方法。
本發明的另一個目的在于提供一種調經活血片在制備抑制小鼠肥大細胞癌P815 細胞增殖藥物中的應用。
技術方案本發明的目的是通過如下的方案實現的
一種調經活血片的制備方法，由木香20g、川芎20g、醋制延胡索20g、當歸60g、熟地黃40g、赤芍40g、紅花30g、烏藥30g、白術30g、丹參60g、制香附60g、甘草水制吳茱萸 10g、澤蘭60g、雞血藤60g、菟絲子80g作為原料藥制成，所述的方法由下列步驟組成取 木香、川芎、醋制延胡索、當歸、紅花，加入到C02超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4-6%，萃取壓力15-30MPa，溫度30_50°C，CO2流量l_3ml/g生藥·π η，萃取時間150-180min，得超臨界萃取物，備用；取其余中藥，粉碎，加入2L的70%乙醇，投入微波萃取裝置中進行微波萃取，萃取功率400-600W，萃取2次，每次4-8分鐘，合并萃取液，濃縮，加到DlOl大孔吸附樹脂柱上，50%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，備用；將上述超臨界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成600片，每片重O. 5g。
上述一種調經活血片的制備方法，所述CO2超臨界萃取夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%。
上述一種調經活血片的制備方法，所述微波萃取功率500W，每次萃取6分鐘。
上述一種調經活血片的制備方法，所述CO2超臨界萃取的萃取壓力20MPa，溫度 40°C, CO2 流量 2ml/g 生藥· min,萃取時間 160min。
上述調經活血片在制備抑制小鼠肥大細胞癌P815細胞增殖藥物中的應用。
現有技術中，調經活血片每片O. 5g，每次5片，一日3次，采用本發明制備成的調經活血片每片O. 5g，每次僅需3片，一日服用3次，在具有更多活性成分的條件下大大減少了服用量。此結論可以通過下述試驗證明。
試驗一、不同方法制備的調經活血片中阿魏酸含量的比較
1、儀器及試藥本發明調經活血片按實施例3方法制備，使用620g原料藥，經提取制成600片，每片重O. 5g。原調經活血片，按部頒標準方法制備，使用620g原料藥，經提取制成600片，每片重O. 5g。Agilentl200高效液相色譜儀；METTLERAE240電子分析天平；阿魏酸對照品(中國藥品生物制品檢定所)。
2、方法
色譜條件與系統適用性試驗用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；甲醇-水-磷酸(40 60 :0. 2)為流動相；檢測波長為280nm。理論板數按阿魏酸峰計算，應不低于3000。
對照品溶液的制備精密稱取在60°C減壓干燥4小時的阿魏酸對照品適量，加甲醇制成每Iml含18 μ g的溶液，即得。
供試品溶液的制備取本發明調經活血片和原調經活血片，研細，混勻，取lg，精密稱定，精密加入70%乙醇20ml，密塞，超聲處理10分鐘，離心，取上清液，即得。
測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各20 μ 1，注入液相色譜儀，測定， 即得。
3、結果
結果表明，本發明調經活血片中阿魏酸的含量為1.38mg/片；而原調經活血片中阿魏酸的含量為O. 29mg/片，在服用量減少的情況下，阿魏酸含量有很大提高。
上述研究表明，采用本發明制備的調經活血片，有效成分含量高于部頒標準法制備的調經活血片。
具體實施方式
以下通過實施例形式，對本發明的上述內容再作進一步的詳細說明，但不應將此理解為本發明上述主題的范圍僅限于以下的實例，凡基于本發明上述內容所實現的技術均屬于本發明的范圍。
實施例1
取木香20g、川芎20g、醋制延胡索20g、當歸60g、熟地黃40g、赤芍40g、紅花30g、 烏藥30g、白術30g、丹參60g、制香附60g、甘草水制吳茱萸10g、澤蘭60g、雞血藤60g、英絲子80g，將木香、川芎、醋制延胡索、當歸、紅花，加入到C02超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4%，萃取壓力15MPa，溫度30°C，C02流量lml/g生藥·π η，萃取時間150min，得超臨界萃取物，備用；取其余中藥，粉碎，加入2L的70%乙醇， 投入微波萃取裝置中進行微波萃取，萃取功率400W，萃取2次，每次4分鐘，合并萃取液，濃縮，加到DlOl大孔吸附樹脂柱上，50%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇， 濃縮并干燥，得微波提取物，備用；將上述超臨界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70% 乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成600片，每片重O. 5g。
經檢測，成品中阿魏酸的含量為1. 4Img/片。
實施例2
取木香20g、川芎20g、醋制延胡索20g、當歸60g、熟地黃40g、赤芍40g、紅花30g、 烏藥30g、白術30g、丹參60g、制香附60g、甘草水制吳茱萸10g、澤蘭60g、雞血藤60g、英絲子80g，將木香、川芎、醋制延胡索、當歸、紅花，加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為6%，萃取壓力30MPa，溫度50°C，C02流量3ml/g生藥·π η，萃取時間180min，得超臨界萃取物，備用；取其余中藥，粉碎，加入2L的70%乙醇， 投入微波萃取裝置中進行微波萃取，萃取功率600W，萃取2次，每次8分鐘，合并萃取液，濃縮，加到DlOl大孔吸附樹脂柱上，50%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇， 濃縮并干燥，得微波提取物，備用；將上述超臨界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70% 乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成600片，每片重O. 5g。
經檢測，成品中阿魏酸的含量為1. 45mg/片。
實施例3
取木香20g、川芎20g、醋制延胡索20g、當歸60g、熟地黃40g、赤芍40g、紅花30g、 烏藥30g、白術30g、丹參60g、制香附60g、甘草水制吳茱萸10g、澤蘭60g、雞血藤60g、英絲子80g，將木香、川芎、醋制延胡索、當歸、紅花，加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%，萃取壓力20MPa，溫度40°C，C02流量2ml/g生藥·π η，萃取時間160min，得超臨界萃取物，備用；取其余中藥，粉碎，加入2L的70%乙醇， 投入微波萃取裝置中進行微波萃取，萃取功率500W，萃取2次，每次6分鐘，合并萃取液，濃縮，加到DlOl大孔吸附樹脂柱上，50%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇， 濃縮并干燥，得微波提取物，備用；將上述超臨界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70% 乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成600片，每片重0.5g。
經檢測，成品中阿魏酸的含量為1. 38mg/片。
實施例4 :調經活血片抑制P815細胞增殖的實驗研究資料
I實驗材料
1.1實驗用細胞株
小鼠肥大細胞癌P815細胞，南京正寬醫藥科技有限公司實驗室細胞庫， DMEM+10%FBS常規培養。
1. 2實驗藥物
研究藥物本發明調經活血片按實施例3方法制備。
藥液儲液稱取IOOmg調經活血片，溶于5ml無水乙醇中，O. 2μηι濾器過濾， 500 μ Idoff管分裝，-20°C存儲，同時O. 2 μ m濾器過濾無水乙醇以備對照組之用。
1. 3實驗試劑
DMEM (GIBC0 公司 Cat. No. 12100_061Lot. No. 758137);胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司Lot. No. 100419)；NaHC03 (上海久億化學試劑有限公司Cat. No. 11810_033Lot. No. 1088387)；Trypsin (AMRESC0 公司批號2010/04)；EDTA (AMRESC0 公司批號:2009/10); Penicillin G Sodium Salt(AMRESC0公司批號2010242)；Streptomycin SulfateCAMRESCO 公司批號2010382);無水乙醇(南京化學試劑有限公司批號080310182);MTT(Biosharp批號:0793) ;PBS (實驗室自配)；
1. 4實驗器材
萊卡倒置顯微鏡(德國Leica型號DM1L);可見-紫外光微孔板檢測儀(美國MD 公司型號SPECTRAMAX190) ；C02培養箱(FORMA型號3111);超凈臺(蘇凈集團安泰公司制造型號SW-CJ-ZFD);純水儀(美國Spring公司型號S/N020579);精密移液器(法國吉爾森公司型號P2);電子天平(德國賽多利斯有限公司型號BT323S);全自動高壓滅菌鍋 (日本SANK)公司型號MLS-3020);臺式電熱鼓風干燥箱(上海精密實驗設備公司型號 DHG9123A);冰箱(西門子公司型號KG18V21TI);液氮罐(CBS型號:2001);低速離心機(上海安亭科學儀器廠型號ΚΑ-1000) ;0. 2μπι濾器(MILLIP0RE型號SLGP033RB) ;10cm培養皿(NEST公司)、96孔培養板(NEST公司)；細胞計數板；離心管、移液管、Tips若干。
2實驗方法
1)P815細胞用DMEM+10%FBS于37°C、5%C02進行常規培養(IOcm培養皿)，當細胞生長至對數期時，收集細胞，棄去培養液，PBS輕洗3遍，加入3ml0. 25%胰蛋白酶-O. 049ffiDTA，37°C消化2min后，向其中加入5ml完全培養基中和反應，吹打細胞后將其轉入離心管中，IOOOrpm離心5min，調整細胞懸液濃度3X 104個/ml。
2)將細胞種入96孔培養板中，每孔加入細胞懸液180 μ I,培養板放入細胞培養箱中(37 °C，5%C02 )常規培養。
3)根據細胞生長情況，一般長至50%_70%，加入調經活血片溶液，繼續培養24h。
4) 24h 后加入 20 μ I MTT 溶液(5mg/ml，即 O. 5%MTT)，繼續培養 4h。
5) 4h后扣板法倒去上清，用吸水紙輕輕拍干，每孔加入200 μ I 二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩lOmin，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀490nm處測量各孔的吸光值。 6)同時設置本底(不加細胞，只加培養液)，對照孔(細胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養液、MTT、二甲基亞砜)，每組設定6個復孔。
7)結果以藥物對細胞的抑制率表示
細胞增值抑制率(％)=(對照孔OD值-給藥孔OD值)/對照孔OD值X 100%。實驗重復3次。
3統計處理
采用Microsoft Excel2003軟件中的相關分析和Student t檢驗，數據以 mean+ S. D.表不。
4實驗結果
MTT法實驗后統計結果顯示，與對照組比較，當劑量達到5mg/ml時，對P815細胞增殖抑制有差異(P〈0. 05)，劑量在10mg/ml時該差異具有顯著性(P〈0. 01)，當劑量達到 15-20mg/ml時有極顯著性差異(Ρ〈0· 001)。
表I調經活血片對Ρ815細胞增殖抑制影響研究_(Χ土SD)
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注與對照組比較，*Ρ〈0·01 ;**Ρ〈0· 001
5實驗結論
調經活 血片可以抑制P815細胞增殖，減少P815細胞的細胞生長數目，該作用呈劑量依賴性。
權利要求
1.一種調經活血片的制備方法，由木香20g、川芎20g、醋制延胡索20g、當歸60g、熟地黃40g、赤芍40g、紅花30g、烏藥30g、白術30g、丹參60g、制香附60g、甘草水制吳茱萸 10g、澤蘭60g、雞血藤60g、菟絲子80g作為原料藥制成，其特征在于所述的方法由下列步驟組成取木香、川芎、醋制延胡索、當歸、紅花，加入到CO2超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為4-6%，萃取壓力15-30MPa，溫度30_50°C，CO2流量 l-3ml/g生藥·π η，萃取時間150_180min，得超臨界萃取物，備用；取其余中藥，粉碎，加入 2L的70%乙醇，投入微波萃取裝置中進行微波萃取，萃取功率400-600W，萃取2次，每次4_8 分鐘，合并萃取液，濃縮，加到DlOl大孔吸附樹脂柱上，50%乙醇洗脫，收集5倍量柱體積洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮并干燥，得微波提取物，備用；將上述超臨界萃取物和微波提取物混合，加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成600片，每片重O. 5g。
2.根據權利要求1所述一種調經活血片的制備方法，其特征在于所述CO2超臨界萃取夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%。
3.根據權利要求1所述一種調經活血片的制備方法，其特征在于所述微波萃取功率 500W,每次萃取6分鐘。
4.根據權利要求1所述一種調經活血片的制備方法，其特征在于所述CO2超臨界萃取的萃取壓力20MPa,溫度40°C, CO2流量2ml/g生藥· min,萃取時間160min。
5.根據權利要求1所述一種調經活血片在制備抑制小鼠肥大細胞癌P815細胞增殖藥物中的應用。
全文摘要
本發明提供一種調經活血片的制備方法，由木香20g、川芎20g、醋制延胡索20g、當歸60g、熟地黃40g、赤芍40g、紅花30g、烏藥30g、白術30g、丹參60g、制香附60g、甘草水制吳茱萸10g、澤蘭60g、雞血藤60g、菟絲子80g作為原料藥制成，采用超臨界萃取和微波萃取制備而成，使得阿魏酸含量有很大提高，本發明還提供了調經活血片在制備抑制小鼠肥大細胞癌P815細胞增殖藥物中的應用。
文檔編號A61P35/00GK102988667SQ20121038826
公開日2013年3月27日 申請日期2012年10月15日 優先權日2012年10月15日
發明者不公告發明人 申請人:李正梅