專利名稱：斑點(diǎn)叉尾鮰腸套疊二聯(lián)滅活疫苗的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及斑點(diǎn)叉尾鮰疾病預(yù)防用疫苗，具體涉及腸套疊滅活疫苗的制備方法與免疫方法。
背景技術(shù)：
斑點(diǎn)叉尾鮰{Ictaclurus punctatus)隸屬It形目，鮰科魚類,又稱溝餘、河餘。其原產(chǎn)地為美國(guó)密西西比河，是一種大型淡水性魚類，最大個(gè)體可達(dá)35kg以上。該魚具有食性雜、抗病力強(qiáng)、適應(yīng)性廣、生長(zhǎng)快、肉質(zhì)細(xì)嫩、營(yíng)養(yǎng)豐富、經(jīng)濟(jì)價(jià)值高等特點(diǎn)。斑點(diǎn)叉尾鮰含肉率為56. 14%，其中粗脂肪占2. 99%，粗蛋白占16. 31%，其肌肉干物質(zhì)中氨基酸含量為 79. 17%，其中鮮味氨基酸(谷氨酸、天冬氨基酸、甘氨酸、丙氨酸)占總氨基酸的6. 36%，具有滋補(bǔ)和催乳功能，深受消費(fèi)者歡迎。斑點(diǎn)叉尾鮰于八十年代引入我國(guó)，在湖北、湖南、四川、重慶、貴州等30多個(gè)省市形成了較大規(guī)模的養(yǎng)殖。近年來，隨著網(wǎng)箱養(yǎng)殖的規(guī)模擴(kuò)大和養(yǎng)殖密度加大，一些地區(qū)養(yǎng)殖環(huán)境惡化，斑點(diǎn)叉尾鮰病害日趨嚴(yán)重，暴發(fā)性死亡時(shí)有發(fā)生，給養(yǎng)殖戶造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失。斑點(diǎn)叉尾鮰腸套疊是近年來發(fā)現(xiàn)的發(fā)病頻率較高的急性傳染性疾病。這種傳染性疾病具有發(fā)病突然，來勢(shì)兇猛，傳染快，呈流行性等特點(diǎn)。目前這種疾病在我國(guó)相當(dāng)嚴(yán)重。多年來，這種疾病的防治主要依賴抗菌藥物，但隨著社會(huì)的發(fā)展，這將受到越來越嚴(yán)厲的限制，因此疫苗的開發(fā)與使用已成為必然趨勢(shì)。實(shí)際上，在過去的10-20年間，接種疫苗預(yù)防養(yǎng)殖魚類傳染性疾病已經(jīng)取得巨大成功。如A. salmonicida、Virbrio sp. , Yersinia sp.等多種疫苗已商業(yè)化。而且不久的將來，巴斯德菌病(Pasteurellosis)和鏈球菌病(Streptococcosis)也有望通過免疫預(yù)防得到控制。Ahydrophila感染的免疫預(yù)防雖也取得不同程度的成功，在基因工程改良的弱毒疫苗、亞單位疫苗等方面有所突破，但試驗(yàn)中的疫苗，以單價(jià)苗居多，多聯(lián)疫苗少見。鑒于斑點(diǎn)叉尾鮰腸套疊可能因多種細(xì)菌感染所致，所以研制斑點(diǎn)叉尾鮰腸套疊二聯(lián)或多聯(lián)滅活疫苗非常必要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供預(yù)防斑點(diǎn)叉尾鮰腸套疊的暴發(fā)和傳播的疫苗，提供一種斑點(diǎn)叉尾鮰腸套疊的二聯(lián)滅活疫苗的制備方法。利用從病魚體內(nèi)分離的毒力強(qiáng)的嗜水氣單胞菌和嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌制成的滅活疫苗，對(duì)斑點(diǎn)叉尾腸套疊起到有效的保護(hù)作用，能有效緩解斑點(diǎn)叉尾鮰的抗藥性和提高斑點(diǎn)叉尾鮰的產(chǎn)量。嗜水氣單胞菌廣泛分布于自然界的各種水體，是多種水生動(dòng)物的原發(fā)性致病菌，為條件致病菌，是典型的人-獸-魚共患病病原菌。該菌是弧菌科氣單胞菌屬，為革蘭氏陰性短桿菌，極端單鞭毛，沒有芽胞和莢膜，剛從病灶上分離的病原菌常兩個(gè)相連。在普通瓊脂平板培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)形成的菌落園形、邊緣光滑、中央凸起、肉色、灰白色或略帶淡桃紅色有光澤，發(fā)育良好。嗜水氣單胞菌可以產(chǎn)生毒性很強(qiáng)的外毒素，如溶血素、組織毒素、壞死毒素、腸毒素和蛋白酶等。在具有典型出血性腸套疊癥狀的斑點(diǎn)叉尾鮰腸道中可以分離得到致病性強(qiáng)的嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌和嗜水氣單胞菌，用于制備滅活疫苗。該菌的分離、鑒定等方法前人已有研究。斑點(diǎn)叉尾鮰腸套疊二聯(lián)滅活疫苗的免疫方法，主要是采用下述方法
A、疫苗的抗原為嗜水氣單胞菌和嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌兩種病原細(xì)菌，將滅活完全的菌體按等比例混合制成斑點(diǎn)叉尾鮰腸套疊二聯(lián)滅活疫苗；
B、用二聯(lián)疫苗對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰魚體浸泡接種或注射接種免疫。其菌種包括從發(fā)病斑點(diǎn)叉尾鮰體內(nèi)分離出來的嗜水氣單胞菌和嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌。 斑點(diǎn)叉尾鮰腸套疊二聯(lián)滅活疫苗的制備方法，按以下步驟進(jìn)行
(1)將嗜水氣單胞菌和嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌分別接種到無菌TSA上，30±0.5°C培養(yǎng)24小
時(shí)；
(2)分別將步驟(I)培養(yǎng)好的菌體，接種到無菌TSB中，在震蕩搖床中進(jìn)行液體培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為30±0. 5°C，搖床速度280 300r/min，培養(yǎng)時(shí)間為24小時(shí)；
(3)將步驟(2)中培養(yǎng)好的菌體分別在常溫下3500r/min離心30鐘，棄上清液，用無菌的O. 85%的生理鹽水稀釋菌體到IO8或109CFU/ml ；
(4)取出步驟(3)中稀釋得到菌液，加入福爾馬林溶液滅活，使福爾馬林的最終濃度為O. 3% (V/V)，32±0. 5°C下滅活 72 小時(shí)；
(5)根據(jù)斑點(diǎn)叉尾鮰的發(fā)病規(guī)律及程度，將以上兩種滅活菌液以等比例混合制成斑點(diǎn)叉尾鮰腸套疊二聯(lián)滅活疫苗，置4°C冰箱內(nèi)儲(chǔ)藏。斑點(diǎn)叉尾鮰腸套疊二聯(lián)滅活疫苗的制備方法，也可按以下步驟進(jìn)行
(1)在具有典型出血性腸套疊斑點(diǎn)叉尾鮰病魚體內(nèi)分離出嗜水氣單胞菌和嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌，將兩菌分別接種到TSA中，30 ± O. 5°C培養(yǎng)24小時(shí)；
(2)分別將步驟(I)培養(yǎng)好的菌體接種到已經(jīng)高壓滅菌TSB中，在震蕩搖床中進(jìn)行液體培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為30±0. 5°C，搖床速度280 300r/min，培養(yǎng)時(shí)間為24小時(shí)；
(3)將步驟(2)中培養(yǎng)好的菌體分別在常溫下3500r/min離心30鐘，棄上清液。用高壓滅菌的O. 85%的生理鹽水稀釋菌體到IO8或109CFU/ml ；
(4)取出步驟(3)中稀釋得到菌液，加入福爾馬林溶液滅活，使福爾馬林的最終濃度為O. 3% (V/V)，在 32±0· 5°C下滅活 72 小時(shí)；
(5)根據(jù)斑點(diǎn)叉尾鮰的發(fā)病規(guī)律及程度，將以上兩種滅活疫苗以等比例混合制成斑點(diǎn)叉尾鮰腸套疊二聯(lián)滅活疫苗，置4°C冰箱內(nèi)儲(chǔ)藏。斑點(diǎn)叉尾鮰腸套疊二聯(lián)滅活疫苗的免疫方法，可采用浸泡接種或注射接種
A、浸泡接種，取二聯(lián)疫苗于容器中，加入蜂膠佐劑，再加入無菌水，使疫苗稀釋200倍，佐劑的最終濃度為O. lmg/ml，攪勻后將魚投入容器內(nèi)浸泡接種疫苗15 30分鐘；
B、注射接種，將二聯(lián)疫苗用O.85%的無菌生理鹽水稀釋5倍，加入蜂膠佐劑，使其最終濃度為O. 01mg/ml，溶解搖勻后，用注射器向魚體腹腔注射，用量為8 10厘米的魚種O. I O. 3ml/ 尾。為了得到良好的預(yù)防效果，該疫苗具有嗜水氣單胞菌和嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌的滅活菌體，其滅活菌體的濃度為IO7 10lclCFU/ml或IO9 10lclCFU/ml。固體培養(yǎng)基配比蛋白胨IOg,牛肉膏3g, NaCl 5g,蒸懼水1000ml,瓊脂條20g,pH 7· 2 7· 4 ;121°C 滅菌 30min。
肉湯培養(yǎng)基配比蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl 5g，蒸餾水1000ml，pH 7. 2
7.4 ;121°C 滅菌 30min。胰酪胨大豆瓊脂(TSA)配比胰蛋白膝17g，大豆蛋白胨3g，磷酸二氫鉀2. 5g，葡萄糖2. 5g,氯化鈉5g,瓊脂20g,加蒸懼水至1000ml,調(diào)pH值至7. 3,121°C滅菌30min。胰酪胨大豆肉湯(TSB)配比胰蛋白膝17g，大豆蛋白胨3g，磷酸二氫鉀2.5g，葡萄糖2. 5g,氯化鈉5g,加蒸懼水至1000ml,調(diào)pH值至7. 3,121°C滅菌30min。蜂膠佐劑稱取14g蜂膠，剪碎并硯成粉末，放入棕色廣口瓶中，溶于4倍量95%乙醇中；置25°C水浴24h，其間不斷攪拌；取出后5000r/ min離心lOmin，吸上清液即為蜂膠乙醇浸液；過濾去雜質(zhì)，用PBS緩沖液(pH7. 2,0. lmol/ L)將所配制的蜂膠稀釋為30mg/ml，4°C避光保存待用。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I :菌種的分離
(O從具有典型出血性腸套疊癥狀的斑點(diǎn)叉尾鮰中分離出致病菌嗜水氣單胞菌a、采取發(fā)病或?yàn)l死斑點(diǎn)叉尾鮰的肝、脾、腎，劃線接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)24h，挑取單個(gè)菌落獲純培養(yǎng)物后，轉(zhuǎn)接于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上保存，供鑒定用。普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上典型菌落為圓形，無色或淺黃色，半透明，表面光滑，濕潤(rùn)，邊緣整齊，無水溶性色素。b、取上述斜面上純培養(yǎng)菌，制成涂片標(biāo)本，經(jīng)革蘭氏染色鏡檢細(xì)菌形態(tài)。普通光學(xué)顯微鏡鏡檢結(jié)果為革蘭氏陰性短小桿菌，菌體兩端鈍圓或平直，多數(shù)單個(gè)排列，少數(shù)2個(gè)排列，無莢膜，無芽孢。再分別接種于血瓊脂平板上，28°C培養(yǎng)24h，可見血營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上細(xì)菌生長(zhǎng)旺盛，典型菌落中I. 5 2. 0mm，菌落圓形、濕潤(rùn)、光滑、無色、透明，呈露水珠樣，邊緣整齊，菌落周圍有透明溶血環(huán)，呈明顯的β溶血。C、選取分離菌株接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，28°C培養(yǎng)18 24h，用法國(guó)梅里埃產(chǎn)API細(xì)菌鑒定條進(jìn)行生化鑒定(見表I)。表I分離嗜水氣單胞菌菌株生化試驗(yàn)鑒定結(jié)果
項(xiàng)目I結(jié)果I項(xiàng)目I結(jié)果I項(xiàng)目I結(jié)果
甲基紅 +_VP反應(yīng)_+_檸檬酸鹽_+_
硫化氫試驗(yàn) +_水解脲素-_精氨酸雙水解酶 +_
明膠水解 +_海藻糖_+_賴氨酸脫羧酶 +_
乳糖_+_麥芽糖_+_P-甘露醇_+_
P-山梨醇 -_水楊苷_+_酒石酸_-_
氧化酶 ^ 梓檬酸-甘油+
運(yùn)動(dòng)性—+ ~爾廢鹽還原 ^~ D-木糖^~
π引哚試驗(yàn) I+ Id-葡萄糖產(chǎn)氣 I+ Id-葡萄糖產(chǎn)酸 I+ —
注“+”表示為陽性表示為陰性。d、先進(jìn)行16SrRNA基因序列測(cè)定,然后通過經(jīng)比對(duì)，同源性為99%。e、根據(jù)細(xì)菌形態(tài)、培養(yǎng)及理化特性測(cè)定的結(jié)果，并結(jié)合16SrRNA基因序列測(cè)定的結(jié)果，判定供試菌種為嗜水氣單胞菌。(2)從具有典型出血性腸套疊癥狀的斑點(diǎn)叉尾鮰中分離出致病菌嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌
a、無菌采取發(fā)病或?yàn)l死斑點(diǎn)叉尾鮰的腸、肝、脾、腎，劃線接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)24h，挑取單個(gè)菌落獲純培養(yǎng)物后，轉(zhuǎn)接于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上保存，供鑒定用。普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上典型脂菌落呈灰白色，圓形，表面光滑，邊緣整齊的半透明菌落。b、取上述斜面上純培養(yǎng)菌，制成涂片標(biāo)本，經(jīng)革蘭氏染色鏡檢細(xì)菌形態(tài)。普通光學(xué)顯微鏡鏡檢結(jié)果為革蘭氏陰性，菌體直或稍彎，單個(gè)或成對(duì)存在，為無莢膜，無芽孢，極生多鞭毛的G_桿菌。再分別接種于血瓊脂平板上，28°C培養(yǎng)24h，出現(xiàn)明顯的溶血環(huán)，且溶血環(huán) 呈草綠色。C、選取分離菌株接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，28°C培養(yǎng)18 24h，用法國(guó)梅里埃產(chǎn)API細(xì)菌鑒定條進(jìn)行生化鑒定(見表2)。表2分離嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌菌株生化試驗(yàn)鑒定結(jié)果
權(quán)利要求
1.斑點(diǎn)叉尾鮰腸套疊二聯(lián)滅活疫苗制備方法，其特征在于 A、疫苗的抗原為嗜水氣單胞菌和嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌兩種病原細(xì)菌，將滅活完全的菌體按等比例混合制成斑點(diǎn)叉尾鮰腸套疊二聯(lián)滅活疫苗； B、用二聯(lián)疫苗對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰魚體浸泡接種或注射接種免疫。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的斑點(diǎn)叉尾鮰腸套疊二聯(lián)滅活疫苗制備方法，其特征在于所述菌種包括從發(fā)病斑點(diǎn)叉尾鮰體內(nèi)分離出來的嗜水氣單胞菌和嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的斑點(diǎn)叉尾鮰腸套疊二聯(lián)滅活疫苗制備方法，其特征在于其制備方法按以下步驟進(jìn)行 (1)將嗜水氣單胞菌和嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌分別接種到TSA，30±0.5°C培養(yǎng)24小時(shí)； (2)分別將步驟(I)培養(yǎng)好的菌體，接種到無菌TSB中，在震蕩搖床中進(jìn)行液體培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為30±0. 5°C，搖床速度28(T300r/min，培養(yǎng)時(shí)間為24小時(shí)； (3)將步驟(2)中培養(yǎng)好的菌體分別在常溫下3500r/min離心30鐘，棄上清液，用無菌的O. 85%的生理鹽水稀釋菌體到IO8或109CFU/ml ； (4)取出步驟(3)中稀釋得到菌液，加入福爾馬林溶液滅活，使福爾馬林的最終濃度為O. 3% (V/V), 32±0· 5°C下滅活 72 小時(shí)； (5)根據(jù)斑點(diǎn)叉尾鮰的發(fā)病規(guī)律及程度，將以上兩種滅活菌液以等比例混合制成斑點(diǎn)叉尾鮰腸套疊二聯(lián)滅活疫苗，置4°C冰箱內(nèi)儲(chǔ)藏。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的斑點(diǎn)叉尾鮰腸套疊二聯(lián)滅活疫苗制備方法，其特征在于按以下步驟進(jìn)行 (1)在具有典型出血性腸套疊斑點(diǎn)叉尾鮰病魚體內(nèi)分離出嗜水氣單胞菌和嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌，將兩菌分別接種到無菌TSA上，30±0. 5°C培養(yǎng)24小時(shí)； (2)分別將步驟(I)培養(yǎng)好的菌體，接種到無菌TSB中，在震蕩搖床中進(jìn)行液體培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為30±0. 5°C，搖床速度280 300r/min，培養(yǎng)時(shí)間為24小時(shí)； (3)將步驟(2)中培養(yǎng)好的菌體分別在常溫下3500r/min離心30鐘，棄上清液，用經(jīng)無菌的O. 85%的生理鹽水稀釋菌體到IO8或109CFU/ml ； (4)取出步驟(3)中稀釋得到菌液，加入福爾馬林溶液滅活，使福爾馬林的最終濃度為O. 3% (V/V), 32±0· 5°C下滅活 72 小時(shí)； (5)根據(jù)斑點(diǎn)叉尾鮰的發(fā)病規(guī)律及程度，將以上兩種滅活菌液以等比例混合制成斑點(diǎn)叉尾鮰腸套疊二聯(lián)滅活疫苗，置4°C冰箱內(nèi)儲(chǔ)藏。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的斑點(diǎn)叉尾鮰腸套疊二聯(lián)滅活疫苗，其特征在于所述的浸泡接種或注射接種為 A、浸泡接種，取二聯(lián)疫苗于容器中，加入蜂膠佐劑，再加入無菌水，使疫苗稀釋200倍，佐劑的最終濃度為O. lmg/ml，攪勻后將魚投入容器內(nèi)浸泡接種疫苗15 30分鐘； B、注射接種，將二聯(lián)疫苗用O.85%的無菌生理鹽水稀釋5倍，加入蜂膠佐劑，使其最終濃度為O. 01mg/ml，溶解搖勻后，用注射器向魚體腹腔注射，用量為8 10厘米的魚種O. I O. 3ml/ 尾。
6.斑點(diǎn)叉尾鮰腸套疊的免疫方法，其特征在于將滅活完全的嗜水氣單胞菌和嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌兩種病原細(xì)菌菌體按等比例混合制成斑點(diǎn)叉尾鮰腸套疊二聯(lián)滅活疫苗的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明從具有典型出血性腸套疊癥狀的斑點(diǎn)叉尾鮰上分離純化得到致病菌嗜水氣單胞菌和嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌。兩株病原菌通過菌體活化，液體擴(kuò)大培養(yǎng)，然后進(jìn)行滅活處理，等比例混合得到二聯(lián)滅活疫苗。該發(fā)明制備的二聯(lián)滅活疫苗制備工藝簡(jiǎn)單，成本低，能工廠化生產(chǎn)，且其免疫保護(hù)率能達(dá)到70%。該疫苗可通過浸泡或者腹腔注射接種斑點(diǎn)叉尾鮰，能有效預(yù)防斑點(diǎn)叉尾鮰腸套疊的暴發(fā)，且不污染水域環(huán)境，可在斑點(diǎn)叉尾鮰養(yǎng)殖中使用。
文檔編號(hào)A61K39/116GK102641498SQ201210143659
公開日2012年8月22日 申請(qǐng)日期2012年5月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月10日
發(fā)明者何艷林, 劉小燕, 戴振炎, 李權(quán)生, 王榮華 申請(qǐng)人:安化縣移民開發(fā)局, 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)