專利名稱：一種復合高分子納米顆粒及制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及的是一種復合高分子材料的納米顆粒，作為口服藥物的緩釋載體，以滿足解決各種難于用于口服途徑的藥物的包裹、運輸和緩釋的運用。
背景技術：
大部分藥物是通過口服和注射進入人體的，與注射途徑相比較，口服途徑更加安全，省時有效。但因胃部酸性環境、胃腸道蛋白水解酶的降解作用和胃腸黏膜的多重作用因素，一些藥物特別是酸敏性藥物和蛋白類藥物在達到腸道之前已經被胃酸和胃蛋白酶基本破壞，導致藥物最終的吸收能力極差，生物利用度低。此外，蛋白類藥物的半衰期也很短，通常只有幾分鐘。所以，將上述藥物包裹在其他的組分中可以避免藥物吸收能力差，利用度低的問題。所以尋找并制備出可用于負載口服藥物的載體或緩釋載體顯得尤為重要。目前，已經用于負載口服藥物的載體主要有:⑴微球⑵微囊⑶無機納米顆粒高分子納米顆粒(5)脂質體(6)乳劑和和(7)凝膠劑。多年的研究表明，上述的口服藥物的載體各有利弊，在運用中也暴露出很多問題，如:微球的粒徑過大，難以快速釋放內部包裹的藥物；微囊和脂質體容易在消化系統的運輸過程中破裂，導致藥物的損失，其制備工藝較復雜；大部分無機納米顆粒自身不能降解，卻能透過腸道上皮細胞進入血液循環系統，導致肝臟、腎臟等臟器的無機納米顆粒積累，具有潛在的安全隱患；乳劑和凝膠劑也存在運輸過程中破裂，導致藥物的損失的缺陷，同時部分組成(如聚氧乙烯蓖麻油)使用過量后可導致人體內組織胺大量釋放，引起過敏反應。目前，高分子制備的口服用的納米顆粒的研究較少，主要存在的原因在于:(I)成分單一，由于高分子納米顆粒的成分為一種或兩種材料，其載體的藥物釋放的控制難以有效掌握，如聚乳酸(PLA)納米顆粒。(2)腸道細胞吞噬率低，大部分高分子納米顆粒的腸道細胞吞噬率均較低。(3)表面活性劑殘留，如果高分子納米顆粒制備過程中使用表面活性劑，必然導致表面活性劑的殘留，如油酸鈉等。所以急需一種能克服上述問題的復合型高分子材料的納米顆粒，作為口服藥物的緩釋載體，以滿足解決各種難于用于口服途徑的藥物的包裹、運輸和緩釋的運用。

發明內容
本發明涉及的是一種復合高分子納米顆粒，用于口服藥物的潛在載體，以滿足解決各種難于用于口服途徑的藥物載體的運用。本發明提供一種復合高分子納米顆粒，其特征在于，所述納米顆粒的粒徑為50-2000nm，包含聚羥基丁酸(PHB)、乳酸- 乙醇酸共聚物(PLGA)、聚羥基丁酸己酸(PHBHHx)三種組分，其中聚羥基丁酸為10% _25%，乳酸-乙醇酸共聚物為占10% -25%，聚羥基丁酸己酸為50% -80%。所述的復合高分子納米顆粒的藥物包封率大于70%。
所述的復合高分子納米顆粒可以被Caco2腸道上皮細胞所吞噬。所述的復合高分子納米顆粒生物相容性好，其細胞存活率大于80%。本發明提供一種復合高分子納米顆粒的制備方法，其特征在于包括以下步驟:(I)聚乙烯醇溶解于水，作為水相；(2)乳酸-乙醇酸共聚物\聚羥基丁酸\聚羥基丁酸己酸溶解于氯仿中，作為油相；(3)水相和油相混合并進行乳化處理形成初乳；(4)初乳倒入旋轉蒸發儀中，除去有機溶劑；(5)經過離心或過濾處理得到除去聚乙烯醇的用于口服藥物載體的復合高分子納米顆粒懸浮液。所述有機溶劑為二氯甲烷、三氯甲烷中的一種及其組合。

所述水相中聚乙烯醇的含量為10g_30g/1000ml。所述乳化處理為勻漿機處理，或超聲機處理。所述水相和油相的體積比為10: I 30: I。所述納米顆粒進行初步的粒徑分離通過靜置、調節離心速度和離心時間及過濾來實現；其中靜置時間為0.5-48小時，離心速度為6000-120000轉每秒，離心時間為10-25分鐘。本發明提供一種復合高分子納米顆粒作為口服藥物載體的應用。以紅色染料羅丹明異硫氰為藥物模型，添加入反應體系中。并用于人直腸細胞Caco2的吞噬實驗。三種材料混合后，被上皮細胞吞噬的能力最佳，這為上述的復合材料納米顆粒作為口服藥物載體最重要的提供依據。該納米顆粒沒有其他雜質和有機溶劑的殘留。工藝制備十分簡單，成分較低，有利于工業化大規模生產。


圖1為本發明中IOOOnm級納米顆粒的掃描電子顯微鏡圖片。圖2為本發明中400nm級納米顆粒的掃描電子顯微鏡圖片。圖3為本發明中納米顆粒被Caco2細胞圖示的激光共聚焦顯微鏡圖片。I為被細胞吞噬后的負載了羅丹明異硫氰的納米顆粒，2為被染料標記的細胞。
具體實施例方式PLGA\PHB\PHBHHx 材料的純化。將PLGA、PHB和PHBHHx是三種材料分別按照1:1: 8，1:1: 5和1:1: 2的質量比混合后，稱取2g混合材料溶解于80ml的三氯甲烷中，40-60°C加熱至完全溶解，用布氏漏斗抽濾除去不溶于三氯甲烷的雜質。將上述有機溶劑緩慢導入2000ml的無水乙醇中。輕度攪拌，靜置24-72小時。用布氏漏斗除去大部分無水乙醇，冷凍干燥機處理最終除去殘余的無水乙醇。即可得到純化后的PLGA\PHB\PHBHHx材料。實施例1:
粒徑為IOOOnm級納米顆粒的制備。具體步驟如下:(I)將Ig的聚乙烯醇溶解于IOOOml的水中，作為水相(W)；(2)將Ig的PLGA\PHB\PHBHHx溶解于20ml的氯仿中作為油相(O)；(3)將水相和油相按10:1的比例混合，并勻漿機6000轉每分鐘攪拌2分鐘形成初乳(W1/0):(4)將初乳倒入旋轉蒸發儀中，除去有機溶劑；(5) 7000轉每分鐘離心處理10分鐘，上清為分離殘余的聚乙烯醇溶液，納米顆粒集中在沉淀中；(6)將沉淀用超純水懸浮，再次離心洗去多余的聚乙烯醇溶液；(7)重復步驟5)和步驟6)的操作4次，靜置2小時，大于IOOOnm的顆粒將沉淀與底部，保留上清懸浮液；(8)繼續靜置48小時，小于IOOOnm的納米顆粒將懸浮于上清中，保留沉淀即為粒徑為IOOOnm納米顆粒。利用掃描電子顯微鏡和粒徑儀檢測所制備的納米顆粒的粒徑大小和分布，數據見表1，掃描電子顯微鏡圖見圖1。實施例2:粒徑為400-10000nm級納米顆`粒的制備。具體步驟如下:(I)將1.5g的聚乙烯醇溶解于IOOOml的水中，作為水相；(2)將Ig的PLGA\PHB\PHBHHx溶解于20ml的氯仿中作為油相；(3)將水相和油相按照15: I的比例混合，并勻漿機24000轉每分鐘攪拌2分鐘形成初乳；(4)將初乳倒入旋轉蒸發儀中，除去有機溶劑；(5) 10000轉每分鐘離心處理10分鐘，上清為分離殘余的聚乙烯醇溶液，納米顆粒集中在沉淀中；(6)將沉淀用超純水懸浮，再次離心洗去多余的聚乙烯醇溶液；(7)重復步驟5)和步驟6)的操作4次，靜置2小時，大于IOOOnm的顆粒將沉淀與底部，保留上清懸浮液；(8) 10000轉每分鐘離心處理10分鐘，大于IOOOnm的納米顆粒將沉淀，小于IOOOnm的納米顆粒將懸浮于上清中。利用掃描電子顯微鏡和粒徑儀檢測所制備的納米顆粒的粒徑大小和分布，數據見表I。實施例3:粒徑小于400nm級納米顆粒的制備。具體步驟如下:(I)將2g的聚乙烯醇溶解于IOOOml的水中，作為水相；(2)將Ig的PLGA\PHB\PHBHHx溶解于20ml的氯仿中作為油相；(3)將水相和油相按照20:1的比例混合，并超聲機240瓦的功率處理10分鐘形成初乳；(4)將初乳倒入旋轉蒸發儀中，除去有機溶劑；(5) 11000轉每分鐘離心處理10分鐘，上清為分離殘余的聚乙烯醇溶液，納米顆粒集中在沉淀中；(6)將沉淀用超純水懸浮，再次離心洗去多余的聚乙烯醇溶液；(7)重復步驟5)和步驟6)的操作4次，靜置2小時，大于IOOOnm的顆粒將沉淀與底部，保留上清懸浮液；(8) 11000轉每分鐘離心處理15分鐘,大于800nm的納米顆粒將沉淀,小于800nm
的納米顆粒將懸浮于上清中。(9)利用PALLs 450nm的過濾頭(PALL，美國)過濾上述上清液，最終得到的過濾液即為小于400nm納米顆粒。利用掃描電子顯微鏡和粒徑儀檢測所制備的納米顆粒的粒徑大小和分布，數據見表1，掃描電子顯微鏡圖見圖2。實施例4:粒徑為IOOOnm級負載了突光染料羅丹明異硫氰的納米顆粒的制備。具體步驟與實施例2的步驟類似，具體如下:(I)將Ig的聚乙烯醇溶解于IOOOml的水中，作為水相；(2)將Ig的PLGA\PHB\PHBHHx和20mg的羅丹明異硫氰溶解于20ml的氯仿中作為油相；(3)將水相和油 相按照20:1的比例混合，并勻漿機6000轉每分鐘攪拌2分鐘形成初乳；(4)將初乳倒入旋轉蒸發儀中，除去有機溶劑；(5)7000轉每分鐘離心處理10分鐘，上清為分離殘余的含有大量羅丹明異硫氰的聚乙烯醇溶液，納米顆粒集中在沉淀中；(6)將沉淀用超純水懸浮，再次離心洗去多余的聚乙烯醇溶液；(7)重復步驟5)和步驟6)的操作4次，靜置2小時，大于IOOOnm的顆粒將沉淀與底部，保留上清懸浮液；(8)繼續靜置48小時，小于IOOOnm的納米顆粒將懸浮于上清中，保留沉淀即為粒徑為IOOOnm納米顆粒。利用掃描電子顯微鏡和粒徑儀檢測所制備的納米顆粒的粒徑大小和分布，數據見表I。將步驟5)中所述的含有大量羅丹明異硫氰的聚乙烯醇溶液進行分光光度計檢測，確定沒有包封的羅丹明異硫氰含量，并計算成樣品的包封率。包封率的計算公式見下:包封率(％ )=(總羅丹明異硫氰含量-沒有包封的羅丹明異硫氰含量)/總羅丹明異硫氰含量包封率結果見表2。實施例5:粒徑為400-1000nm級負載了突光染料羅丹明異硫氰的納米顆粒的制備。具體步驟與實施例2的步驟類似，具體如下:(I)將1.5g的聚乙烯醇溶解于IOOOml的水中，作為水相；(2)將Ig的PLGA\PHB\PHBHHx和20mg的羅丹明異硫氰溶解于20ml的氯仿中作為油相；
(3)將水相和油相按照20: I的比例混合，并勻漿機24000轉每分鐘攪拌2分鐘形成初乳；(4)將初乳倒入旋轉蒸發儀中，除去有機溶劑；(5) 10000轉每分鐘離心處理10分鐘，上清為分離殘余的聚乙烯醇溶液，納米顆粒集中在沉淀中；(6)將沉淀用超純水懸浮，再次離心洗去多余的聚乙烯醇溶液；(7)重復步驟5)和步驟6)的操作4次，靜置2小時，大于IOOOnm的顆粒將沉淀與底部，保留上清懸浮液；(8) 10000轉每分鐘離心處理10分鐘，大于IOOOnm的納米顆粒將沉淀，小于IOOOnm的納米顆粒將懸浮于上清中。利用掃描電子顯微鏡和粒徑儀檢測所制備的納米顆粒的粒徑大小和分布，數據見表I。將步驟5)中所述的含有大量羅丹明異硫氰的聚乙烯醇溶液進行分光光度計檢測，確定沒有包封的羅丹明異硫氰含量，并計算成樣品的包封率。包封率的計算公式見下:包封率(％ )=(總羅丹明異硫氰含量-沒有包封的羅丹明異硫氰含量)/總羅丹明異硫氰含量包封率結果見表2。實施例6: 粒徑為400-1000nm級負載了突光染料羅丹明異硫氰的納米顆粒的制備。(I)將2g的聚乙烯醇溶解于IOOOml的水中，作為水相；(2)將Ig的PLGA\PHB\PHBHHx和20mg的羅丹明異硫氰溶解于20ml的氯仿中作為油相；(3)將水相和油相按照20: I的比例混合，并超聲機240W的功率處理10分鐘形成初乳；(4)將初乳倒入旋轉蒸發儀中，除去有機溶劑；(5) 11000轉每分鐘離心處理10分鐘，上清為分離殘余的聚乙烯醇溶液，納米顆粒集中在沉淀中；(6)將沉淀用超純水懸浮，再次離心洗去多余的聚乙烯醇溶液；(7)重復步驟5)和步驟6)的操作4次，靜置2小時，大于IOOOnm的顆粒將沉淀與底部，保留上清懸浮液；(8) 11000轉每分鐘離心處理15分鐘,大于800nm的納米顆粒將沉淀,小于800nm
的納米顆粒將懸浮于上清中。(9)利用MLLs 450nm的過濾頭(PALL，美國)過濾上述上清液，最終得到的過濾液即為小于400nm納米顆粒。利用掃描電子顯微鏡和粒徑儀檢測所制備的納米顆粒的粒徑大小和分布，數據見表I。將步驟5)中所述的含有大量羅丹明異硫氰的聚乙烯醇溶液進行分光光度計檢測，確定沒有包封的羅丹明異硫氰含量，并計算成樣品的包封率。包封率的計算公式見下:包封率)=(總羅丹明異硫氰含量-沒有包封的羅丹明異硫氰含量)
/總羅丹明異硫氰含量包封率結果見表2。納米顆粒的Caco2細胞吞噬實驗:分解將實施例4-6中所制備的負載了熒光染料羅丹明異硫氰的納米顆粒精確稱量后分散在DMEM細胞培養基中，配置成不同濃度的顆粒懸浮液。用人直腸上皮細胞Caco2作為試驗用的細胞株。分別接種10萬個細胞于48孔板中，待細胞生長完全覆蓋細胞培養板后，依次加入不同的上述顆粒懸浮液Iml。分別培養I小時、4小時、8小時、12小時、16小時、20小時和24小時后，移去原先的DMEM細胞培養基(Gibc o，美國)，再用磷酸緩沖溶液洗3次取出沒有吞噬的納米顆粒，再加入含有綠色熒光染料FDA的DMEM細胞培養基染色5分鐘。用激光共聚焦顯微鏡觀察沒400個細胞中，含有紅色顆粒的細胞的數量并計算出所占總細胞的比率為納米顆粒吞噬率(個/400個細胞)，數據見表3和圖3。通過納米顆粒吞曬率可以發現,顆粒粒徑越小的納米顆粒,越容易被Caco2細胞所吞噬。納米顆粒的細胞毒性實驗:分解將實施例1-3中所制備的沒有負載了熒光染料羅丹明異硫氰的納米顆粒精確稱量后分散在DMEM細胞培養基中，配置成不同濃度的顆粒懸浮液。分別用人直腸上皮細胞Caco2和小鼠成纖維細胞L929作為試驗用的細胞株。分別接種I萬個細胞于96孔板中，待細胞生長24小時后，依次加入不同的上述顆粒懸浮液100 μ I。分別培養24后，利用細胞活性試劑盒進行細胞活性檢測，450nm的波長下收集吸光值，并計算細胞存活率，公式如下:細胞存活率)=樣品的吸光值/對照的吸光值*100%數據見表4和表5。通過納米顆粒吞噬率可以發現，用PLGA\PHB\PHBHHx制備的納米顆粒的生物相容性均較好。表1.所制備的不同級別的納米顆粒的粒徑大小
權利要求
1.一種復合高分子納米顆粒，其特征在于，所述納米顆粒的粒徑為50-2000nm,包含聚羥基丁酸(PHB)、乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)、聚羥基丁酸己酸(PHBHHx)三種組分，其中聚羥基丁酸為10% _25%，乳酸-乙醇酸共聚物為占10% -25%，聚羥基丁酸己酸為50% -80%。
2.根據權利要求1所述一種復合高分子納米顆粒，其特征在于，所述的復合高分子納米顆粒的藥物包封率大于70%。
3.根據權利要求1，或2所述一種復合高分子納米顆粒的制備方法，其特征在于包括以下步驟: (1)聚乙烯醇溶解于水，作為水相； (2)乳酸-乙醇酸共聚物\聚羥基丁酸\聚羥基丁酸己酸溶解于氯仿中，作為油相； (3)水相和油相混合并進行乳化處理形成初乳； (4)初乳倒入旋轉蒸發儀中，除去有機溶劑； (5)經過離心或過濾處理得到除去聚乙烯醇的用于口服藥物載體的復合高分子納米顆粒懸浮液。
4.根據權利要求5所述一種復合高分子納米顆粒的制備方法，其特征在于，所述有機溶劑為二氯甲烷、三氯甲烷中的一種及其組合。
5.根據權利要求5所述一種復合高分子納米顆粒的制備方法，其特征在于，所述水相中聚乙烯醇的含量為10g-30g/1000ml。
6.根據權利要求5所述一種復合高分子納米顆粒的制備方法，其特征在于，所述乳化處理為勻漿機處理，或超聲機處理。
7.根據權利要求5所述一種復合高分子納米顆粒的制備方法，其特征在于，所述水相和油相的體積比為10: I 30:1。
8.根據權利要求5所述一種復合高分子納米顆粒的制備方法，其特征在于，所述納米顆粒進行初步的粒徑分離通過靜置、調節離心速度和離心時間及過濾來實現；其中靜置時間為0.5-48小時，離心速度為6000-120000轉每秒，離心時間為10-25分鐘。
9.根據權利要求1，或2所述一種復合高分子納米顆粒作為口服藥物載體的應用。
全文摘要
本發明涉及一種復合高分子納米顆粒，作為口服藥物載體，以滿足解決各種難于用于口服途徑的藥物載體的運用。該復合高分子納米顆粒，其特征在于，所述納米顆粒的粒徑為50-2000nm，包含聚羥基丁酸(PHB)、乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)、聚羥基丁酸己酸(PHBHHx)三種組分，其中聚羥基丁酸為10％-25％，乳酸-乙醇酸共聚物為占10％-25％，聚羥基丁酸己酸為50％-80％。本發明還涉及一種復合高分子納米顆粒得制備方法。該納米顆粒沒有其他雜質和有機溶劑的殘留。工藝制備十分簡單，成分較低，有利于工業化大規模生產。
文檔編號A61K47/34GK103169975SQ20111043663
公開日2013年6月26日 申請日期2011年12月22日 優先權日2011年12月22日
發明者魏岱旭, 閆志強, 鐘建, 何丹農 申請人:上海納米技術及應用國家工程研究中心有限公司