專利名稱：減毒的革蘭氏陰性細菌的制作方法
技術領域：
本發明涉及活的減毒革蘭氏陰性細菌。減毒的革蘭氏陰性細菌可用于免疫原性組合物或疫苗組合物中，如用于預防細菌感染，以及用于研究，因為減毒菌株為研究人員和可能的接觸者(如動物、人)提供了較高的安全性。因此，本發明涉及包含本發明革蘭氏陰性細菌如活的減毒革蘭氏陰性細菌的免疫原性或疫苗組合物。組合物中的細菌也可以是滅活的；但是活的減毒革蘭氏陰性細菌可能是有利的。因此，本發明還涉及用于制備和/或配制這些組合物的方法；如在合適的培養基上/中培養或培育或繁殖細菌，收獲細菌，任選滅活細菌，并與合適的獸醫學或制藥學可接受載體、賦形劑、稀釋劑、或介質(vehicle)和/或佐劑和/或穩定劑混合；或者，將細菌與合適的獸醫學或制藥學可接受載體、賦形劑、稀釋劑、或介質和/或佐劑和/或穩定劑混合。由此，本發明還涉及細菌在配制這些組合物中的用途。減毒細菌還可作為表達或復制載體，如用于對減毒細菌而言異源的核酸分子的復制和/或表達，所述核酸分子如編碼病原體的免疫原、抗原、或表位的核酸分子，病原體的例子是減毒細菌以外的病原體。減毒細菌作為載體的用途也為操作減毒細菌的研究人員或技術人員和可能的接觸者(如動物、人)提供了較高的安全性。因此，本發明還涉及用于制備這些載體的方法，如轉化細菌使得細菌包含且任選表達異源核酸分子。本發明還涉及這些載體的用途；如用于生成對細菌而言異源的基因產物，如多肽，諸如免疫原、表位、或抗原的方法，包括培養、培育、或繁殖經轉化而包含并在適于表達的條件下表達編碼該基因產物的異源核酸分子的細菌，且任選收獲或分離或分開基因產物；或者，由經轉化而表達它的細菌收獲或分離或分開基因產物；或者，用于引發針對基因產物和/或細菌的免疫學應答或免疫原性應答或者針對衍生或獲得基因產物的病原體和/或該細菌的保護性免疫應答的方法，包括對受試者施用經轉化而表達基因產物的細菌，所述受試者如動物，諸如易受病原體和/或細菌感染的動物，例如牛或火雞；或者，用于制備免疫原性、免疫學、或疫苗組合物的方法，包括將載體或經轉化細菌與制藥學或獸醫學可接受載體、稀釋劑、介質、或賦形劑和/或佐劑和/或穩定劑混合。
本發明還涉及用于細菌減毒的靶標，如編碼細菌減毒靶標的突變型核苷酸序列或基因，以及用于確立細菌減毒靶標多肽的方法和生成減毒細菌的方法。減毒的靶標可以用作免疫原性化合物，如用在免疫原性組合物或疫苗組合物中，或者用于生成免疫原性或疫苗組合物中所使用的表位。由此，本發明涉及減毒靶標在制備組合物中的用途，如與制藥學或獸醫學可接受載體、稀釋劑、賦形劑、或介質和/或佐劑和/或穩定劑混合。本發明還涉及用于在受試者，如動物，諸如易受革蘭氏陰性細菌諸如巴斯德氏菌感染的動物，如火雞或牛中誘發免疫學或免疫原性或保護性免疫應答的方法，包括對動物施用本發明的疫苗或免疫原性組合物。本發明甚至還涉及這些減毒細菌的制備，如革蘭氏陰性細菌，諸如巴斯德氏菌；例如，包括將ー種或多種轉座元件導入細菌，井分離包含在目標物種中不引起死亡的(且因而是減毒的)轉座元件的細菌。任選的是，還可以鑒定細菌中的突變，從而能夠獲得生成減毒細菌的候選方法。本發明甚至還涉及用于生成減毒細菌的這些候選方法。因為已經鑒定或表征了突變，所以可以通過除了將ー種或多種轉座元件導入細菌以外的技術將突變導入細菌，諸如 通過同源重組，如導致細菌基因組的一部分發生至少ー個添加(插入)或缺失(還設想了兩個或多個添加和/或缺失)或替代(諸如至少ー個核苷酸被另ー種核苷酸替代)的同源重組。因此，本發明涉及用于生成包含已知或先前鑒定的修飾或突變(如本文鑒定的修飾或突變)的減毒細菌的方法，包括將缺失或插入或替代導入細菌基因組，通過重組是有利的，并任選鑒定和/或分離包含修飾或突變的細菌。由此，本發明還涉及革蘭氏陰性細菌突變體，其中所述細菌在如下核苷酸序列中具有至少ー個突變，由所述核苷酸序列編碼的多肽與由選自下組的核苷酸序列編碼的氨基酸序列具有等于或大于70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%的同一性=SEQID NO :2、6、9、12、16、19、22、25、28、31、34、37、40、43、46、49、52、55、58、61、64、67、70、75、78、81、84、87、90、和93所示核苷酸序列；所述突變導致細菌的毒カ減弱。而且，本發明還涉及本文所述這種細菌的用途、組合物、和方法。
背景技術：
已經公認，活的減毒微生物可以作為高度有效的疫苗；與由不進行復制的免疫原產生的免疫應答相比，由這種疫苗引發的免疫應答常常強度更大且時間更長。對此的ー種解釋是活的減毒菌株在宿主中建立了受限感染并模擬天然感染的早期階段。另外，與殺死的或滅活的制劑不同，活的疫苗能夠誘發由細胞介導的有力應答，這可能與它們在抗原呈遞細胞諸如巨曬細胞中的復制能力有關。在動物和人類中使用活的減毒疫苗已經有很長的歷史，特別是使用化學誘變技木。然而，憑借經驗減毒的疫苗能夠恢復毒力。結合關于細菌發病機理的日益増加的知識，現代分子生物學技術鑒定了涉及微生物在體內生長和存活的數種基因。這為減毒提供了新的靶基因，而且提出了這樣的概念，即可以通過將限定的非恢復突變導入已知涉及毒力的選定基因而將未來的疫苗菌株“合理地”減毒，參閱例如 TO-A-00/61724、TO-A-00/68216、和 EP-A-0889120。盡管已經在實驗室中生成了許多減毒菌株，然而只有少數有資格作為潛在疫苗候選者用于動物。這可能是部分由于需要平衡疫苗的免疫原性與微生物恢復活性和致病性的可能性。顯然，為減毒選擇適當基因(這將生成合適的疫苗候選者)并不簡單，而且難以預測。許多因素可能影響減毒突變體作為疫苗的可接受性，因此需要努力研究以鑒定并選擇合適的減毒基因。只是在體外進行了許多減毒實驗，而且它們的結果不能外推至體內，特別是關于由此生成的突變體對接種動物的殘余致病性。參考Kachlany SC、Planet PJ、Bhattacharjee MK、Kollia E、DeSalle R、Fine DH、Figurski DH, Nonspecific adherence by Actmobacillus actinomycetemcomitansrequires genes widespread in bacteria and archaea(伴放線放線桿菌的非特異粘附需要細菌和古細菌中普遍存在的基因)，J BacteriolJOOO年11月，182 (21) :6169_6176。Fuller TE、Martin S、Teel JF、Alaniz GR、Kennedy MJ、Lowery DE, Identification of ActinobaciIIus pleuropneumoniae virulence genes usingsignature-tagged mutagenesis in a swine infection model (豬感染候型中使用標志-標記誘變對大葉性肺炎放線桿菌毒力基因的鑒定)，Microb Pathog, 2000年7月，29(1) :39-51。Fuller TE、 Kennedy MJ^ Lowery DE, Identification of Pasteurellamultocida virulence genes in septicemic mouse model using signature-taggedmutagenesis (白血病小鼠模型中使用標志-標記誘變對多殺巴斯德氏菌毒力基因的鑒定)，Microb Pathog, 2000 年 7 月，29 (I) :25_38。Kehrenberg C、Werckenthin Scnwarz S，Tn5706，a transposon-_Like elementfrom Pasteurella multociaa mediating tetracycline resistance (Tn5706，來自多殺巴斯德氏菌的介導四環素抗性的轉座子樣元件)，Antimicrob Agents Chemother，1998年8月，42(8) :2116-2118。DeAngelis PL, Transposon Tn916insertional mutagenesis of Pasteurellamultocida and direct sequencing of disruption site (多殺巴斯德氏菌的轉座子Tn916插入誘變和破壞位點的直接測序)，Microb &讓(^，1998&年4月，24(4) :203_209。DeAngelis PL、Jing W、Drake RR^Achyuthan AM，Identification and molecularcloning of a unique hyaluronan synthase from Pasteurella multocida (來自多殺巴斯德氏菌的獨特透明質酸合酶的鑒定和分子克隆)，J Biol Chem，1998b年4月3日，273(14) :8454-8458。Lee MD^HenK AD，TnlOinsertional mutagenesis in Pasteurella multocida(多殺巴斯德氏菌中的TnlO插入誘變)，Vet Microbiol，1996年5月，50 (1-2) :143_148。Choi KH、Maheswaran SK、Choi CS，Colorimetric assay using XTT forassessing virulence of avian Pasteurella multocida strains (使用)(TT 的 t 匕色 7則定法用于評估鳥類多殺巴斯德氏菌菌株的毒力)，Vet Micix)bi0l，1995年7月，45(2-3)191-200。Nnalue NA， Tn7inserts in both orientations at a single chromosomallocation and apparently forms cointegrates in Pasteurellamultocida(Tn7在多殺巴斯德氏菌中以兩個方向插入單一染色體位置且顯然形成共合體)，Mol Microbiol，1990年I 月，4(1) :107-117。Stocker，美國專利號 4，550，081,4, 837，151,5, 210，035、和 5，643，771。Highlander，美國專利號6，180, 1120Kachlany涉及Tad基因。Kachlany中的突變型Tad基因與減韋無關。在Kachlany中沒有對動物進行測試，而且本發明沒有選擇Tad基因。Fuller的論文涉及本發明沒有選擇的序列。Kehrenberg不涉及減毒突變體或者特征標記誘變或STM技術；而是,Kehrenberg涉及轉座子的定向插入(相同插入元件的使用)。DeAngelis 1998a只提供了 STM技術的一般描述，而且本質上沒有提供突變體。DeAngelis 1998b涉及使用STM技術將轉座子插入 HA生物合成基因座(Genbank編號AF036004)。該序列是PM70的序列Pm0775的同源物。本發明沒有選擇編碼Pm0775的序列。Lee關注STM技術對TnlO轉座子的使用；Lee未能公開或提議對動物的任何測試或者對減毒突變體的任何研究；而是，Lee只涉及營養缺陷型突變體。盡管Choi引用了多殺巴斯德氏菌轉座子插入突變體，而且該突變體可能還沒有誘發死亡，然而Choi不含關于轉座子插入位置的細節，因此不能說是可重復的。類似的，Nnalue未能教導或提議本發明。Stocker的專利涉及aroA基因中TnlO轉座子的插入。本發明沒有選擇aroA基因。Highlander關注滅活白細胞毒素的IktC基因中Tnl545轉座子的插入。本發明沒有選擇IktC基因。因此，真正認為本領域尚未教導或建議本發明。此外，期望鑒定涉及減毒的基因或核酸序列，并在此基礎上開發減毒細菌，以及減毒疫苗或免疫原性組合物，諸如具有高度免疫原性并展示優越安全特性和有限副作用或沒有副作用的那些組合物。發明概述本發明提供了在編碼第一多肽的第一核苷酸序列中具有突變并導致細菌的毒力減弱的革蘭氏陰性細菌突變體，其中第一多肽具有氨基酸序列；第二多肽具有由SEQ ID NO :2、6、9、12、16、19、22、25、28、31、34、37、40、43、46、49、52、55、58、61、64、67、70、75、78、81、84、87、90、或93所示核苷酸序列編碼的氨基酸序列；且第一多肽的氨基酸序列與第二多肽的氨基酸序列相同，或者第一多肽的氨基酸序列與第二多肽的氨基酸序列具有等于或大于70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或 99% 的同一性。細菌突變體可以是巴斯德氏菌科(Pasteurellaceae)，如細菌可以是多殺巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)、溶血巴斯德氏菌(Pasteurella haemolytica)、鴨痕巴斯德氏菌(Pasteurella an atipestifer)、或大葉性肺炎放線桿菌(Actinobacilluspleuropneumoniae),有利的是多殺巴斯德氏菌。突變可以是第一核苷酸序列中的缺失、插入、或核酸替代，諸如整個第一核苷酸序列的缺失；或者在SEQ ID NO :2的第180-181位核苷酸或第182-183位核苷酸或第190-191位核苷酸、SEQ ID NO 6的第77-78位核苷酸或第1026-1027位核苷酸或第1027-1028位核苷酸、SEQ ID NO 9的第416-417位核苷酸、SEQ ID NO 12的第389-390位核苷酸、SEQ IDNO 16的第381-382位核苷酸、SEQ ID NO 19的第219-220位核苷酸、SEQ ID NO 22的第1353-1354 位核苷酸、SEQID NO :25 的第 136-137 位核苷酸、SEQ ID NO :28 的第 384-385 位核苷酸、SEQ ID NO 31的第222-223位核苷酸或第225-226位核苷酸、SEQ ID NO 34的第217-218 位核苷酸、SEQ ID NO :37 的第 1411-1412 位核苷酸、SEQ ID NO 40 的第 943-944位核苷酸、SEQ ID NO 43的第855-856位核苷酸、SEQ ID NO 46的第369-370位核苷酸、SEQID NO 49 的第 111-112 位核苷酸、SEQ ID NO 52 的第 443-444 位核苷酸、SEQ ID NO 55的第4-5位核苷酸、SEQ ID NO 61的第573-574位核苷酸、SEQ ID NO 64的第875-876位核苷酸、SEQ ID NO :70的第218-219位核苷酸、SEQ ID NO :75的第1072-1087位核苷酸、SEQ ID NO 78 的第 64-65 位核苷酸、SEQ ID NO 81 的第 282-283 位核苷酸、SEQ ID NO 84的第1431-1432位核苷酸、SEQ ID NO 87的第974-975位核苷酸、SEQ ID NO 90的第802-803位核苷酸、SEQID NO 92的第850-851位核苷酸之間的插入；或緊挨著SEQ ID NO 58的第I位核苷酸的上游的插入；或緊挨著SEQ ID NO 67的第I位核苷酸的上游的插入。突變體可以包含異源核酸序列，諸如編碼來自致病性病毒、寄生蟲或細菌的免疫原、治療性蛋白質、變應原、生長因子或細胞因子的異源核酸序列。本發明還提供了包含依照本發明的突變體以及制藥學或獸醫學可接受稀釋劑、載 體、介質、或賦形劑的免疫原性組合物或疫苗，而且任選還包含佐劑。本發明還提供了具有氨基酸序列的分離的第一多肽，其中第二多肽具有由SEQ ID NO :2、6、9、12、16、19、22、25、28、31、34、37、40、43、46、49、52、55、58、61、64、67、70、75、78、81、84、87、90、或93所示核苷酸序列編碼的氨基酸序列；且第一多肽的氨基酸序列與第二多肽的氨基酸序列相同，或者第一多肽的氨基酸序列與第二多肽的氨基酸序列具有等于或大于70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或 99% 的同一性。本發明設想了包含第一種分離多肽以及制藥學或獸醫學可接受稀釋劑、載體、介質、或賦形劑和任選的佐劑的免疫原性或疫苗組合物。另外，本發明設想了包含對第一種分離多肽特異的抗體的抗體制劑。本發明還包括用于檢測革蘭氏陰性細菌感染的診斷方法，包括在樣品中檢測第一種分離多肽或對所述第一種分離多肽特異的抗體。本發明還涉及被動免疫方法,包括施用抗體制劑。本發明還提供了具有SEQ ID NO :2、6、9、12、16、19、22、25、28、31、34、37、40、43、
46、49、52、55、58、61、64、67、70、75、78、81、84、87、90、或 93 或者 SEQ ID NO :1、4、5、8、11、
14、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48、51、54、57、60、63、66、69、72、73、77、80、83、
86、89、92、95、96、或97所示序列的分離核酸分子，以及用于檢測革蘭氏陰性細菌的PCR引物，該引物包含具有 SEQ ID NO :2、6、9、12、16、19、22、25、28、31、34、37、40、43、46、49、52、55、58、61、64、67、70、75、78、81、84、87、90、或 93 或者 SEQ ID NO :1、4、5、8、11、14、15、18、
21、24、27、30、33、36、39、42、45、48、51、54、57、60、63、66、69、72、73、77、80、83、86、89、92、
95、96、或97所示核苷酸序列中至少10個連續核苷酸的序列的分離核酸分子。探針或引物可以是至少8個、優選至少10個、更優選至少12、13、14、或15個、諸如至少20個、如至少23或25個、例如至少27或30個核苷酸的任何片段，它們對于期望擴增的序列而言是獨特的或者位于期望擴增的序列中且最不保守，如在革蘭氏陰性細菌之中或在革蘭氏陰性細菌特定科或種之中，諸如在巴斯德氏菌之中，或者在多殺巴斯德氏菌、溶血巴斯德氏菌、鴨瘟巴斯德氏菌、或大葉性肺炎放線桿菌之中，有利的是多殺巴斯德氏菌之中是保守的。對于PCR或雜交引物或探針以及它們的最佳長度，還可以參考Kajimura等人，GATA, 7 (4) =71-79,1990。術語“免疫原性組合物”和“免疫學組合物”和“免疫原性或免疫學組合物”覆蓋引發針對目標病原體的免疫應答的任何組合物；例如在施用或注射到動物(諸如鳥類如火雞或牛如母牛)體內后引發針對目標病原體(如多殺巴斯德氏菌)的免疫應答。術語“疫苗組合物”和“疫苗”覆蓋誘發針對目標病原體的保護性免疫應答或提供針對病原體的有效保護的任何組合物；例如在施用或注射到動物(諸如鳥類如火雞或牛如母牛)體內后引發針對目標病原體的保護性免疫應答或提供針對病原體(如多殺巴斯德氏菌)的有效保護。病原體的亞單位，如由病原體分離的抗原或免疫原或表位，病原體如細菌，諸如革蘭氏陰性細菌，例如多殺巴斯德氏菌；和亞單位組合物包含或基本上由分離自病原體的ー種或多種抗原、免疫原、或表位組成，病原體如細菌，諸如革蘭氏陰性細菌，例如多殺巴斯德氏菌。注意，在本公開書中，特別是在權利要求中，術語諸如“包含”、“含有”、“包括”等可以具有美國專利法中賦予它的含義；如它可以指“包括”等；而且術語諸如“基本上由...組成”具有美國專利法中賦予它的含義，如它容許未明確敘述的成分，但排除在現有技術中找 到的或影響本發明的基本或新穎特征的成分。下文發明詳述公開或明顯教導了這些和其它實施方案。發明詳述本發明提供了在微生物(諸如細菌，例如革蘭氏陰性細菌，如多殺巴斯德氏菌)減毒中涉及的核苷酸序列和基因、由該核苷酸序列編碼的產物(如蛋白質、抗原、免疫原、表位)、用于生成這些核苷酸序列、產物、微生物的方法及其用途，諸如用于制備疫苗或免疫原性組合物，或用于引發免疫學或免疫應答，或作為載體，如作為表達載體(例如體外或體內表達載體)。導入微生物核苷酸序列和基因的突變產生了新的且非顯而易見的減毒突變體。這些突變體可用于生成具有高度免疫原性的活的減毒免疫原性組合物或活的減毒疫苗。這些突變體還可作為載體，用于表達產物的體外表達，以及用于核苷酸序列的擴增或復制(如DNA復制)，和用于體內表達產物。突變的鑒定提供了新的且非顯而易見的核苷酸序列和基因，以及由所述核苷酸序列和基因編碼的新的且非顯而易見的基因產物。這些基因產物提供了抗原、免疫原、和表位，而且作為分離的基因產物是有用的。這些分離的基因產物及其表位還可用于生成抗體，后者可用于診斷應用。能夠提供或產生表位、抗原、或免疫原的這些基因產物還可用于免疫原性或免疫學組合物和疫苗。一方面，本發明提供了在核苷酸序列或基因中包含減毒突變的細菌，其中突變修飾、降低、或消除由基因編碼的多肽或蛋白質的表達和/或生物學活性，導致細菌的毒カ減弱。突變并非必須位于編碼序列或基因內才能破壞它的功能從而導致減毒。突變也可以位于參與基因表達調控的核苷酸序列中，例如位于調控轉錄起始、翻譯、和轉錄終止的區域中。由此，還包括啟動子和核糖體結合區(這些調控元件通常位于編碼序列或基因起始密碼子上游大約60至250個氨基酸；Doree SM等人，J Bacteriol, 2001,183 (6)1983-1989 ；Pandher K 等人，Infect Imm,1998,66(12) :5613-5619 ;Chung JY 等人，FEMSMicrobiol Letters, 1998，166 :289-296)、轉錄終止子(終止子通常位于編碼序列或基因終止密碼子下游大約50個核苷酸內；Ward CK等人，Infect Imm, 1998,66 (7) :3326-3336)。在操縱子中，這些調控區可能位于基因或編碼序列上游更遠處。基因間區域中的突變也可能導致減毒。與編碼序列或基因有關的這些調控序列內的突變修飾、抑制、或消除由此基因編碼的多肽或蛋白質的表達和/或生物學活性，導致細菌的毒カ減弱，因而這些突變與本發明所述的基因或編碼序列內的突變是相當的。減毒降低或消除了細菌的致病性以及臨床癥狀或損傷的嚴重性，減慢了細菌的生長速度，并防止細菌引起死亡。 本發明涉及微生物，諸如細菌，如革蘭氏陰性細菌，諸如巴斯德氏菌科的細菌，例如多殺巴斯德氏菌、溶血巴斯德氏菌、鴨瘟巴斯德氏菌、和大葉性肺炎放線桿菌。有利的是，細菌是多殺巴斯德氏菌。多殺巴斯德氏菌是革蘭氏陰性細菌，是多種生產動物疾病的起因，而且是人類機會性病原體。它是嚴重巴斯德氏菌病，諸如馴養和野生鳥類的禽霍亂、牛出血性敗血病、和豬萎縮性鼻炎(Hunt ML等人，Vet Microbiol, 2000, 72 (1-2) :3-25)的病原因子。可以根據被膜抗原將分離菌在血清學上分成血清組(A、B、D、E、和F)，或者根據菌體LPS抗原分成16種血清型。使用特征標記誘變(Signature Tagged Mutagenesis, STM)已經鑒定了參與細菌減毒的潛在核苷酸序列。本文引用的文件中討論了該方法，還可參閱W0-A-96/17951。STM涉及將獨特的、特征標記的轉座子插入微生物基因組。在插入座位，基因組核苷酸序列被破壞。在本發明中，對由此生成的突變(及由此攜帯突變的突變體)分析了減毒情況。通過對轉座子側翼DNA區域的PCR擴增(聚合酶鏈式反應)、克隆、和測序，測定了每個減毒突變體破壞區(如基因或編碼序列或開放讀碼框(ORF))的序列。在本發明的一個實施方案中，修改W0-A-96/17951中描述的STM法使之在多殺巴斯德氏菌中發揮作用。需要注意的是，這些改動包括使用TnlO轉座子而非Tn5，并使用不含亮氨酸的CDM培養基進行選擇而非鏈霉素抗性選擇。實施例列出了更多細節。由通過STM法鑒定的潛在基因進ー步選擇參與減毒的基因或核苷酸序列的根據是動物在接種細菌突變體后沒有死亡。對于獸醫學應用，本發明的ー個有利方面包括在目標動物而非動物模型中直接進行實驗選擇。該方法能夠更加準確地選擇細菌突變體的適當突變。對于多殺巴斯德氏菌，實驗是直接在火雞中進行的，即多殺巴斯德氏菌的天然目標宿主之一。給火雞肌肉內接種足夠量的特征標記的多殺巴斯德氏菌突變體集合(如每只動物0. 5ml, IO7CFU)。認為在接種后一定時間沒有被再次分離到的突變體是潛在減毒的。將沒有被再次分離到的突變體與集合中再次分離的那些通過特征標簽的PCR擴增和分析區分開來。然后通過肌肉內途徑將每ー種潛在減毒突變體注射到火雞體內(如每只動物0.5ml，IO4CFU)。記錄接種后7天內每天的火雞死亡率。認為不引起死亡的突變體是減毒的。
在多殺巴斯德氏菌菌株P-1059中進行了該特定方法，并獲得了許多減毒突變體。其中5個已經于2003年4月I日保藏于法國巴黎巴斯德研究院的CNCM(國立微生物保藏中心)。4G11突變體可以在編號CNCMI-2999下獲得。5D5突變體可以在編號CNCM 1-3000下獲得。9C8突變體可以在編號CNCM 1-3001下獲得。9H4突變體可以在編號CNCM 1-3002下獲得。13E1突變體可以在編號CNCM 1-3003下獲得。轉座子插入座位側翼的核苷酸序列命名為SEQ ID NO :1、4、5、8、11、14、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48、51、54、57、60、63、66、69、72、73、77、80、83、86、89、92、95、
96、和 97。 轉座子緊挨著序列1、8、11、14、15、27、33、42、54、57、66、72、73、77、80、95、和 97 的5'末端以及序列 4、5、18、21、24、30、36、39、45、48、51、60、63、69、83、86、89、和 96 的 3'末
端插入多殺巴斯德氏菌菌株P-1059。對于突變體9H4，轉座子插入序列SEQ IDNO :92的第850-851位核苷酸之間。本發明的ー個具體方面是在包含選自下組的序列的基因或ORF和/或其調控區中具有減毒突變的多殺巴斯德氏菌菌株P-1059減毒突變體SEQ ID NO :1、4、5、8、11、14、15、
18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48、51、54、57、60、63、66、69、72、73、77、80、83、86、89、92、95、96、和 97。本發明的其它具體實施方案包括依照本發明的減毒突變體，諸如本文提及的依照布達佩斯條約的條款保藏于CNCM的減毒突變體。例如，可以通過轉座子插入或定向誘變(缺失、插入、替代)來獲得P-1059減毒突變體。可以在這些核苷酸序列或基因及其互補序列中進行減毒突變。還可以在所述基因或核苷酸序列調控區包含的核苷酸序列中進行減毒突變。上述序列或其部分(諸如它們的至少10、15、或20個核苷酸，例如它們的至少10個連續核苷酸、或它們的至少15個連續核苷酸、且更有利的是它們的至少20個連續核苷酸，直至序列全長)可以作為PCR引物用于檢測并選擇轉座子插入突變體。PCR可以包括ー對引物，例如一條對轉座子特異，另一條對待突變基因或核苷酸序列特異。根據PCR擴增產物的預期大小，該方法能夠擴增和/或檢測PCR片段。關于生物體(如革蘭氏陰性細菌，諸如巴斯德氏菌，如多殺巴斯德氏菌，例如多殺巴斯德氏菌菌株PM70或P-1059 (如參見下文))中相應基因或ORF和/或其調控區的知識；例如相應基因或ORF和/或其調控區的大小，可用于設計PCR引物，用于篩選擴增得到的PCR片段，和用于檢測具有正確大小的PCR片段，從而能夠選擇突變體。可以在EMBL 數據庫和 May BJ 等人，Proc Natl Acad Sci USA, 2001,98 (6)3460-3465中得到多殺巴斯德氏菌菌株PM70的完整基因組。使用序列SEQ ID N0:l、4、5、
8、11、14、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48、51、54、57、60、63、66、69、72、73、77、80、83、86、89、92、95、96、和97進行的Blast能夠在PM70基因組上定位同源序列，然后確定PM70中的對應基因或ORF。將多殺巴斯德氏菌菌株PM70中的這些核苷酸序列命名為SEQ IDNO :2、6、9、12、16、19、22、25、28、31、34、37、40、43、46、49、52、55、58、61、64、67、70、75、78、81、84、87、和 90。對于P-1059菌株的突變體9H4，在PM70中沒有找到同源序列。已經將該P-10590RF 測序并命名為 SEQ ID NO :93。
本發明的另ー個方面是在包含選自下組的核苷酸序列的基因或ORF和/或其調控區中具有至少ー個減毒突變的菌株PM70減毒突變體SEQ ID NO :2、6、9、12、16、19、22、25、28、31、34、37、40、43、46、49、52、55、58、61、64、67、70、75、78、81、84、87、和 90。可以在這些核苷酸序列或基因及其互補序列中進行減毒突變。還可以在所述基因調控區包含的核苷酸序列中進行減毒突變。例如，可以通過轉座子插入或定向誘變(缺失、插入、替代)來獲得減毒突變體。術語“互補”在本文中指雙鏈基因組中另一條鏈的核苷酸序列，因而覆蓋作為有義鏈的互補鏈的反義鏈，反之亦然。術語“核苷酸”也涵蓋脫氧核糖核苷酸(由此構成的脫氧核糖核酸或DNA)、核糖核苷酸(由此構成的核糖核酸或RNA)、和信使核糖核苷酸(mRNA)。更一般的說，可以將減毒突變導入細菌的基因組，細菌諸如革蘭氏陰性細菌，例如巴斯德氏菌科的細菌，如多殺巴斯德氏菌、溶血巴斯德氏菌、鴨瘟巴斯德氏菌、和大葉性肺炎放線桿菌，有利的是細菌，在多殺巴斯德氏菌多種菌株之任一(如P-1059菌株、PM70菌株)的基因組中，在至少ー種編碼氨基酸序列的核苷酸序列中發生突變，由所述核苷酸序列編碼的氨基酸序列與由 SEQ ID NO :2、6、9、12、16、19、22、25、28、31、34、37、40、43、46、49、52、55、58、61、64、67、70、75、78、81、84、87、90、和93所示核苷酸序列編碼的氨基酸序列之一具有至少大約70%同一』丨生、至少大約75%同一』丨生、至少大約80%同一』丨生、至少大約85%同一性、至少大約90%同一性、且有利的是至少大約95、96、97、98、或99%或更多同一性。可以在這些核苷酸序列或基因及其互補序列中進行減毒突變。還可以在所述基因調控區包含的核苷酸序列中進行減毒突變。例如，可以通過轉座子插入或定向誘變(缺失、插入、替代)來獲得減毒突變體。得到的減毒突變體是本發明的實施方案。具體實施方案是P-1059減毒突變體。可以通過NCBI (國家生物技術信息中心)成對blast和blosum62矩陣使用標準參數(即，注意可以在“國家生物技術信息中心”(NCBI，貝塞斯達，馬里蘭州，美國)服務器上以及 Altschul 等人，J Mol Biol，1990，215 :403-410 中獲得的 BLAST 或 BLASTX 算法；由此，該文件通過術語“blast”來談及使用該算法或BLAST或BLASTX和BL0SUM62矩陣)來確定兩種氨基酸序列之間的同一性百分比。動詞“編碼”在用于本文時并非意味著將核苷酸序列限于實際的編碼序列，而是同樣涵蓋包括并非編碼序列的其調控序列在內的完整基因。還可以使用可以在NCBI獲得的Myers 和Miller (Optimal Alignments in LinearSpace (線性空間的最佳比對)，CABI0S，4 :11-17,1988，收入本文作為參考)的“比對”程序以及可以通過因特網在諸如NCBI等網站獲得的相同或其它程序來測定序列同源性或同一性諸如核苷酸序列同源性。或者或另外，術語“同源性”或“同一性”，例如在用于核苷酸或氨基酸序列時，可以指兩種序列之間同源性的定量測量。可以如下計算序列同源性百分比(If-Ndif)女100/Nref,其中Ndif指兩種序列在比對時不同殘基的總數，而Nref指序列之一的殘基數目。由此，DNA序列AGTCAGTC與序列AATCAATC將具有75%的序列同一性(Nref = 8 ；Ndif = 2)。或者或另外，“同源性”或“同一性”在用于序列時可以指兩種序列中核苷酸或氨基酸相同的位置數目除以較短序列的核苷酸或氨基酸數目，其中兩種序列的比對可以依照Wilbur 和 Lipman 算法(Wilbur 和 Lipman，1983，PNAS USA, 80 :726，收入本文作為參考)確定，例如使用窗ロ大小20個核苷酸，字長4個核苷酸，且缺ロ補償4，而且可以使用商品化程序(如Intelligenetics Suite, Intelligenetics公司，加利福尼亞州)方便地進行包括比對在內的對序列數據的電腦輔助分析和解釋。當說到RNA序列與DNA序列相似或具有一定程度的同一性或同源性時，認為DNA序列中的胸苷⑴與RNA序列中的尿苷⑶是相同的。由于認為DNA序列中的胸苷⑴與RNA序列中的尿苷(U)是相同的，因此RNA序列屬于本發明的范圍之內，而且可以由DNA序列衍生。有利的是,可以使用可以在NCBI獲得的BlastP程序(Altschul等人,Nucl AcidsRes, 25 :3389-3402，收入本文作為參考)以及可以通過因特網在諸如NCBI等網站獲得的相同或其它程序來測定序列同一性或同源性諸如氨基酸序列同一性或同源性。下列文件(每ー份都收入本文作為參考)提供了比較諸如兩種蛋白質的氨基酸 殘基等序列的相對同一性或同源性的算法，而且另外/或者就前述而言，這些文獻中的教導可用于測定同源性或同一性百分比Needleman SB和Wunsch CD, A general methodapplicable to the search lor similarities in tne amino acid sequences of twoproteins (可用于搜索兩種蛋白質氨基酸序列相似性的一般方法)，J Mol Biol,48 444-453,1970 ；Smith TF 和 Waterman MS, Comparison of Biosequences (生物序列的比較)，Advances in Applied Mathematics, 2 :482-489,1981 ;Smith TF、Waterman MS、和Sadler JR, Statistical characterization of nucleic acid sequence functionaldomains (核酸序列功能結構域的統計學鑒定),Nucleic Acids Res, 11 :2205-2220,1983 ；Feng DF 和 Dolittle RF, Progressive sequence alignment as a prerequisiteto correct phylogenetic trees (漸進式序列比對作為糾正系統樹的先決條件)，J ofMolec Evol,25 :351-360,1987 ；Higgins DG 和 Sharp PM, Fast and sensitive multiplesequence alignment on a microcomputer即微型計算機上的快速且靈敏的多序列比對，CABI0S, 5 :151-153,1989 ；Thompson JD、Higgins DG^PGibson TJ, Cluster W improvingthe sensitivity oi progressive multiple sequence alignment through sequenceweighing, positions-specific gap penalties and weight matrix choice 即しlusterW :通過序列加權、位置特異缺ロ補償、和加權矩陣選項來改進漸進式多序列比對的靈敏度，Nucleic Acids Res, 22 :4673-480,1994 ;以及，Devereux J> Haeberlie P、和 Smithies 0，A comprehensive set of sequence analysis program for tne VAX 即用于 VAX 的序夕IJ分析程序綜合組，Nucl Acids Res, 12 :387_395，1984。而且，熟練技術人員無需過度實驗就能夠考慮用于測定同源性百分比的許多其它程序或參考文獻。本發明涉及編碼具有相同生物學功能的多肽或蛋白質的核苷酸序列或基因中的突變。可以通過活性位點的保守性來分析或鑒定或測定或檢查功能相似性。這可以通過NCBI DART研究(Domain Architecture Retrieval Tool即結構域結構檢索工具)來進行。本發明由此提供了包含本文所述減毒突變的本文所述減毒細菌突變體。減毒的革蘭氏陰性細菌突變體包含一個突變，其中至少ー種特定基因或核酸序列的全部或部分如本文所述發生突變。特定基因或核酸序列包括包含序列SEQ ID NO :2、6、
9、12、16、19、22、25、28、31、34、37、40、43、46、49、52、55、58、61、64、67、70、75、78、81、84、87、90、或 93 或者與它們同源(如 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或 99%同源)的那些基因或核酸序列或其調控區。有利的是，特定基因或核酸序列包括包含序列SEQ ID NO :2、6、9、12、25、31、37、40、43、46、70、75、78、81、84、87、90、或 93 或者與它們同源
的那些基因或核酸序列或其調控區。更有利的是，特定基因或核酸序列包括包含SEQ IDNO :6、12、25、31、37、40、46、70、75、84、87、90、或93或者與它們同源的那些基因或核酸序列或其調控區。甚至更有利的是，特定基因或核酸序列包括包含SEQ ID NO :37、40、75、90、或93或其同源核苷酸序列或者與它們同源的那些基因或核酸序列。優選的是，突變體是巴斯德氏菌，諸如多殺巴斯德氏菌，例如P-1059或PM70。可以使用任何已知技術將突變導入微生物，諸如例如重組DNA技術，以將詳細鑒定的突變導入選定的基因或核酸序列(定向誘變)。這種突變可以是同源或異源核酸序列的插入，缺失、取代，如用另ー種核苷酸取代至少ー個核苷酸，或其組合。在一個實施方案中，突變是缺失突變，其中部分核酸序列或基因的缺失、有利的是整個核酸序列或基因的缺失引起基因或核酸序列的破壞。核酸的缺失避免了致病性的恢復。在另ー個實施方案中，突變是本文如實施例中所述轉座子插入座位的對應座位中的插入。對于P-1059菌株而言，有利的是，這些座位緊挨著序列 1、8、11、14、15、27、33、42、54、57、66、72、73、77、80、95、和97 的 5'末端和緊挨著序列 4、5、18、21、24、30、36、39、45、48、51、60、63、69、83、86、89、和 96 的3'末端。在PM70菌株中，這些座位位于SEQ ID NO 2的第180-181位或第182-183位或第 190-191 位、SEQ ID NO 6 的第 77-78 位或第 1026-1027 位或第 1027-1028 位、SEQ IDNO 9 的第 416-417 位、SEQ ID NO 12 的第 389-390 位、SEQID NO 16 的第 38ト382 位、SEQID NO 19 的第 219-220 位、SEQ IDNO 22 的第 1353-1354 位、SEQ ID NO 25 的第 136-137位、SEQ IDNO 28 的第 384-385 位、SEQ ID NO 31 的第 222-223 位或第 225-226 位、SEQ IDNO :34 的第 217-218 位、SEQ ID NO :37 的第 1411-1412 位、SEQ ID NO :40 的第 943-944位、SEQ ID NO 43 的第 855-856 位、SEQ ID NO 46 的第 369-370 位、SEQ ID NO 49 的第111-112 位、SEQ ID NO 52 的第 443-444 位、SEQ ID NO 55 的第 4-5 位、SEQID NO 61 的第 573-574 位、SEQ ID NO 64 的第 875-876 位、SEQ IDNO 70 的第 218-219 位、SEQ ID NO 75 的第 1072-1087 位、SEQ IDNO :78 的第 64-65 位、SEQ ID NO :81 的第 282-283 位、SEQID NO 84 的第 1431-1432 位、SEQ ID NO 87 的第 974-975 位、SEQ ID NO 90 的第 802-803位、或SEQ ID NO 92的第850-851位核苷酸之間；或者緊挨著SEQ ID NO 58的第I位核苷酸的上游；或者緊挨著SEQ IDNO :67的第I位核苷酸的上游。在另外的革蘭氏陰性細菌中，諸如巴斯德氏菌科成員，如多殺巴斯德氏菌、溶血巴斯德氏菌、鴨瘟巴斯德氏菌、和大葉性肺炎放線桿菌，這些座位位于編碼本文所定義的具有其同一性百分比的同源氨基酸序列的核苷酸序列中的(關于PM70所述)相似氨基酸對之間。由此，突變體可以是革蘭氏陰性細菌，而且有利的是巴斯德氏菌，諸如多殺巴斯德氏菌、溶血巴斯德氏菌、鴨瘟巴斯德氏菌、和大葉性肺炎放線桿菌，例如多殺巴斯德氏菌，諸如P-1059或PM70。根據定義，缺失突變體包含至少ー個依照本發明的核苷酸序列的缺失或本發明核苷酸序列中的缺失。這些缺失突變體包括全部或部分的特定基因序列或特定核苷酸序列得到缺失的那些突變體。一方面，突變導致占基因或特定核苷酸序列至少大約10%、至少大約20%、至少大約30%、至少大約40%、至少大約50%、至少大約60%、至少大約70%、至少大約80 %、至少大約90 %、至少大約95 %、至少大約98 %、或至少大約99 %的至少ー個核酸的缺失。優選的是，整個基因或特定核苷酸序列得到缺失。突變體可以包含超過ー個突變，它們可能導致累加或協同程度的減毒，而且可能導致對減毒回復的更好預防。這些多重突變可以聯合已知具有減毒特性的核苷酸序列或基因，諸如aro基因，例如 aroA (Homchampa P 等人，Veterinary Microbiology, 1994,42 35~44)的突變，以及依照本發明的核苷酸序列或基因中的突變。在一個實施方案中，突變體包含至少ー個突變，其中對于每ー個突變而言，特定基因或核酸序列的全部或部分如本文所述發生突變。這些特定基因或核酸序列包括那些包含序列 SEQ ID NO :2、6、9、12、16、19、22、25、28、31、34、37、40、43、46、49、52、55、58、61、64、67、70、75、78、81、84、87、90、或93或者與它們同源的基因或核酸序列或其調控區。由此，本發明設想了上述序列的兩個或更多發生了突變(如本文所述的缺失)的突變體。有利的是，突變體中下列序列或者包含下列序列或與它們同源的序列或其調控區的兩個或更多發生了突變(如本文所述的缺失)SEQ ID NO :2、6、9、12、25、31、37、40、43、46、70、75、78、81、84、
87、90、或93。更有利的是，發生突變的特定基因或核酸序列(如發生突變的兩個或更多基 因或核酸序列)包括那些包含SEQ ID NO :6、12、25、31、37、40、46、70、75、84、87、90、或93或者與它們同源的基因或核酸序列或其調控區。突變體可以是革蘭氏陰性細菌，而且有利的是，突變體是巴斯德氏菌，諸如多殺巴斯德氏菌，例如P-1059或PM70。有利的是，本發明設想了下列序列或其調控區的兩種或更多發生突變(如本文所述的缺失)的突變體SEQ ID N0:37、40、75、90、和93或其同源核苷酸序列。各個實施方案包括包含下列序列或者與它們同源的基因或核酸序列或其調控區本身或其中發生缺失的突變體序列SEQ ID NO :37和40 ；SEQ ID NO :37和75 ；SEQ ID NO 37 和 90 ；SEQ ID NO :37 和 93 ；SEQID NO 40 和 75 ；SEQ ID NO :40 和 90 ；SEQ ID NO :40 和93 ;SEQ IDNO :75和90 ;SEQ ID勵75和93;5￡0 ID N0:90和93。突變體可以是革蘭氏陰性細菌，而且有利的是，突變體是巴斯德氏菌，諸如多殺巴斯德氏菌，例如P-1059或PM70。根據本公開書和本領域的知識，將突變導入特定基因組區域的方法對于熟練技術人員而言是已知和顯而易見的。例如，將待突變的整個基因或序列或片段克隆到載體中，并進行修飾以消除其表達和/或其生物學活性。將載體導入細菌，例如通過電穿孔(如 Jablonski L 等人，Microbial Pathogenesis, 1992,12 63~68)或接合(Lee MD等人，Vet Microbiol，1996，50 :143-148)。通過遺傳重組將經過修飾的DNA片段重新導入細菌基因組，有利的是通過細菌染色體與載體之間的同源重組。例如，載體可以是Cardenas (Cardenas M 等人，Vet Microbiol, 2001 年 5 月 3 日，80 (I) :53_61)描述的自殺質粒。有利的是，這種載體在(同源重組中所采用的)兩個側翼臂或區域之間額外包含多終止序列(如6個終止密碼子，每個讀碼框ー個)以阻斷任何可能的翻譯。本發明的減毒微生物(如革蘭氏陰性細菌，諸如多殺巴斯德氏菌)還可以包含至少ー種插入其基因組中的同源或異源核酸序列。這可用于在體內或在體外繁殖或復制異源核酸分子和/或表達異源核酸分子。有利的是，異源核酸序列編碼與減毒微生物的天然表達的那些不同的致病病毒、寄生蟲、或細菌媒介的免疫原、抗原、或表位。這種異源序列可以編碼微生物或細菌的另ー種菌株，如另ー種多殺巴斯德氏菌菌株的免疫原、抗原、或表位。免疫原或抗原是能夠誘發針對病原體或病原體分泌抗原的免疫應答的蛋白質或多肽，而且包含ー個或多個表位；而表位是能夠誘發針對病原體或病原體分泌抗原的免疫應答的肽或多肽。
適于這種載體中的這種用途的異源核酸序列對于熟練技術人員而言將是顯而易見的(Fedorova ND 和 Highlander SK, Infect Immun, 1997,65(7) :2593-2598)，而且包括例如那些來自巴斯德氏菌科成員(特別是多殺巴斯德氏菌、溶血巴斯德氏菌、鴨瘟巴斯德氏菌、和大葉性肺炎放線桿菌)或像大腸桿菌、沙門氏菌、和彎曲桿菌等細菌的序列。有利的是，插入異源序列是為了在施用后在宿主中由微生物進行表達，從而形成針對減毒微生物和所述表達免疫原二者的免疫應答。有利的是，一起插入異源序列與容許其表達的調控元件(諸如啟動子)，或者將二者可操作連接，或者使前者位于后者下游。還可以添加可用于蛋白質的尋址和表達的核苷酸序列。因此，可以在表達產物中包含前導或信號序列以便于轉運穿過細胞壁和/或分泌。在一個實施方案中，將同源或異源序列插入為了減毒而選擇的核苷酸序列或基因中；有利的是，將同源或異源序列插入本文所鑒定的轉座子插入座位的對應座位之一。為了改進表達，可以修改密碼子使用以適應使用的細菌載體。 本發明的減毒突變體還可以包含編碼治療性蛋白質、變應原、生長因子、細胞因子、免疫調控物、或免疫刺激物，諸如GM-CSF，例如與目標物種匹配的GM-CSF (例如，若減毒載體是多殺巴斯德氏菌，則對于對牛施用而言，可以由載體表達牛GM-CSF，例如由另ー種異源蛋白質、肽、多肽、抗原、免疫原、或表位的載體進行表達)的核酸序列。依照本發明的另ー個方面，將減毒微生物用于生成活的減毒免疫原性組合物或活的減毒疫苗組合物。依照本發明的ー個有利方面，減毒微生物是依照本發明突變的革蘭氏陰性細菌，諸如巴斯德氏菌，例如多殺巴斯德氏菌，例如P-1059或PM70。有利的是，如本文所述，微生物可以作為重組載體用于動物或人針對由巴斯德氏菌以外的其它因子引起的感染的免疫和/或接種。免疫原性組合物或疫苗組合物包含減毒突變體以及制藥學或獸醫學可接受載體、賦形劑、稀釋劑、或介質和任選的穩定劑和/或佐劑。減毒突變體可以是額外表達對載體而言異源的核酸分子的載體，諸如異源表位、抗原、免疫原、和/或生長因子、細胞因子、免疫調控物、或免疫刺激物。術語“免疫原性組合物”在本文中覆蓋一旦注射到動物或人體內就能夠引發針對靶病原體的免疫應答的任何組合物。術語“疫苗組合物”或“疫苗”在本文中覆蓋一旦注射到動物或人體內就能夠誘發針對靶病原體的保護性免疫應答的任何組合物。制藥學或獸醫學可接受介質(vehicle)可以是水或鹽水，但是它也可以包括例如
細菌培養基。可以將依照本發明的減毒細菌凍干，有利的是與穩定劑一起。可以依照眾所周知的標準凍干流程來進行凍干。制藥學或獸醫學可接受穩定劑可以是碳水化合物(如山梨醇、甘露醇、乳糖、蔗糖、葡萄糖、葡聚糖、海藻糖)、谷氨酸鈉(Tsvetkov T等人，Cryobiology, 1983, 20 (3) :318-323 ;Israeli E 等人，Cryobiology, 1993, 30 (5)519-523)、蛋白質諸如蛋白腺、清蛋白、乳清蛋白、或釀蛋白、含蛋白質物質諸如脫脂奶(Mills CK 等人，Cryobiology，1988，25(2) :148-152 ；ffolff E 等人，Cryobiology，1990，27(5) :569-575)、和緩沖劑(如磷酸鹽緩沖劑、堿金屬磷酸鹽緩沖劑)。佐劑可用于使凍干制劑可溶。
佐劑的實例是基于礦物油和/或植物油和非離子表面活性劑諸如嵌段共聚物、Tween 、Span 的水包油、水包油包水乳濁液。其它合適的佐劑是例如維生素E、皂角苷、和Carbopol 、氫氧化招、或憐酸招(Vaccine Design,The subunit and adjuvantapproach (疫苗設計,亞基和佐劑方法),Pharmaceutical Biotechnology (制藥學生物技術)，第 6 卷，Michael F. Powell 和 Mark J. Newman 編，1995, Plenum 出版社，紐約)。活的減毒細菌可以在含甘油的培養基中保存于-70°C。任選的是，免疫原性組合物或疫苗可以聯合選自滅活或活的形式的其它致病微生物或病毒的ー種或多種免疫原、抗原、或表位。本發明的另ー個方面是依照本發明的核苷酸序列或基因，諸如依照本發明的命名為 SEQ ID NO:2、6、9、12、16、19、22、25、28、31、34、37、40、43、46、49、52、55、58、61、64、67、70、75、78、81、84、87、90、和93的核苷酸序列或基因，而且有利的是命名為SEQ ID NO :1、4、
5、8、11、14、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48、51、54、57、60、63、66、69、72、73、77、80、83、86、89、92、95、96、和 97 的那些。本發明的另ー個方面是依照本發明的核苷酸序列或基因用于表達和產生肽、多肽、或蛋白質或者更一般的說表達產物如免疫原、抗原、或表位的用途。在一個實施方案中，由這些核苷酸序列或基因編碼的多肽或肽或蛋白質可以作為亞單位免疫原或抗原或表位用于免疫原性組合物或疫苗中。表位測定流程，諸如構建重疊肽庫(Hemmer B等人，Immunology Today, 1998,19 (4) :163-168)、Pepscan (Geysen HM 等人，Proc Nat Acad SciUSA，1984，81 (13) :3998-4002 ;GeysenHM 等人，Proc Nat Acad Sci USA, 1985,82 (I)178-182 ；Van der Zee R 等人，Eur J TmmunoI,1989,19(I) 43~47 ；Geysen HM,SoutheastAsian J Trop Med Public Health, 1990，21 (4) :523-533 ; Multipill PeptideSynthesis Kit de Chiron)、和算法(De Groot A 等人，Nature Biotechnology, 1999,17 533-561)可用于實踐本發明，而無需過度實驗。有利的多肽是那些具有SEQ ID NO :3、7、10、13、17、20、23、26、29、32、35、38、41、44、47、50、53、56、59、62、65、68、71、76、79、82、85、88、91、或 94 所示氨基酸序列的多肽或者那些由核苷酸序列 SEQ ID NO :2、6、9、12、16、19、22、25、28、31、34、37、40、43、46、49、52、55、58、61、64、67、70、75、78、81、84、87、90、或93編碼的多肽。也可以有利地使用來自這些多肽
的表位。本發明涵蓋來自另ー種細菌的等同多肽，所述細菌諸如革蘭氏陰性細菌，有利的是巴斯德氏菌科的成員，如多殺巴斯德氏菌、溶血巴斯德氏菌、鴨瘟巴斯德氏菌、和大葉性肺炎放線桿菌，而且更有利的是在多殺巴斯德氏菌多種菌株的任ー種的基因組中，包括其氨基酸序列與 SEQID NO :3、7、10、13、17、20、23、26、29、32、35、38、41、44、47、50、53、56、59、62、65、68、71、76、79、82、85、88、91、或94所示氨基酸序列之一具有至少大約70%、至少大約75%、至少大約80%、至少大約85%、至少大約90%、至少大約95%、和至少大約96、97、98、或99%同一性的等同多肽和/或與以上述序列表示的多肽具有相同生物學功能的多肽。上文已經描述了確定同一性或相同生物學功能的標準。本發明還涵蓋這些多肽的免疫原性片段，其至少具有所述多肽10個氨基酸、至少20個、諸如至少30個、有利的是至少50個、且更有利的是至少70個氨基酸的鏈，如包含多肽的至少10個連續氨基酸、有利的是多肽的至少20個連續氨基酸、諸如多肽的至少30個且更有利的是至少50個連續氨基酸、且甚至更有利的是多肽的至少70個連續氨基酸的多肽片段。當然，片段小于完整多肽。片段可以聯合其它多肽，如在融合多肽中；例如，本發明的多肽或其片段可以是包含另ー個部分(另ー種多肽)，如免疫原性增強部分和/或分泌增強部分，諸如增強免疫原性的脂蛋白部分或者信號或前導序列部分的融合多肽的一部分。因此，本發明設想了多肽、蛋白質、抗原、免疫原、或表位-或是本文中所鑒定的序列或其片段，或是與本發明載體異源的那些序列-作為融合體的表達，如作為融合多肽，如有利地包含免疫原性增強部分諸如脂蛋白部分和/或分泌增強部分諸如信號或前導序列部分的融合多肽的一部分。有利的是，通過體外表達來產生多肽或片段。將依照本發明的核苷酸序列(如SEQ ID NO :2、6、9、12、16、19、22、25、28、31、34、37、40、43、46、49、52、55、58、61、64、67、70、75、78、81、84、87、90、93)或其片段插入載體，可操作地連接調控元件，諸如啟動子、核糖體結合區和終止子、以及起始密碼子和終止密碼子。有利的載體是可用于在細菌即大腸桿菌中進行體外表達的質粒(Mahona F等人，Biochimie, 1994,46 (I) :9-14 ;Watt M等人， Cell Stress Chaperones,1997, 2(3) :180-190 ；Frey J, Res Microbiol,1992,143(3)263-269)。也可以化學合成這些多肽(LuoY 等人，Vaccine，1999，17 (7-8) :821-831)。由此，本發明的ー個方面是包含至少ー種依照本發明的多肽或片段(亞單位免疫原性組合物或疫苗)或至少ー種本文所述體內表達載體(活的重組免疫原性組合物或疫苗)以及制藥學或獸醫學可接受載體、賦形劑、稀釋劑、或介質和任選的佐劑的免疫原性組合物或疫苗。本文在關于活的疫苗時已經描述了這些成分的實例。在另ー個實施方案中，可以將這些核苷酸序列或其片段插入重組載體以產生能夠在宿主中體內表達由這種核苷酸序列或片段編碼的多肽的活的重組免疫原性組合物或疫苗。體內表達載體可以是多核苷酸載體或質粒(EP-A2-1001025 ;Chaudhuri P，Res.Vet. Sci. 2001,70(3) :255-256)、病毒(如腺病毒、痘病毒諸如禽痘(US-A-5，174，993、US-A-5, 505, 941、和 US-A-5, 766，599)或金絲雀痘(US-A-5, 756，103))、或細菌即大腸桿菌或沙門氏菌。本發明的多肽和片段還可用于治療。多肽和片段還可用作抗體-抗原反應中的試劑。因此，本發明的另ー個方面是用于檢測革蘭氏陰性細菌感染的診斷方法和/或試劑盒。試劑盒如ELISA可以包含至少ー種依照本發明的多肽或片段(如至少ー種通過本文序列鑒定的多肽或其本文所討論的片段)。針對本文多肽或片段(通過本文序列鑒定的多肽或其本文所討論的片段)的抗體可用作診斷試劑或用于被動免疫或接種疫苗或治療。被動免疫中抗體的施用量可以與本領域用量相同或相似，使得熟練技術人員根據本領域知識就能夠實踐被動免疫而無需過度實驗。本發明的另ー個方面是包含對依照本發明的多肽或片段特異的抗體的抗體制劑以及使用它的診斷方法。就對多肽特異的抗體而言，意味著該抗體優先結合這種多肽，如抗體結合這種多肽而不結合其它多肽，或者具有可以接受的針對這種多肽的獨特特異性，這樣，使用本領域已知的技術或本文引用的文件中討論的技術(包括Sambrook，見下文)，抗體可用于由樣品分離多肽或檢測多肽在樣品中的存在，且假陽性不超過5%。抗體可以是多克隆的或單克隆的。用于產生抗體的方法對于熟練技術人員而言是眾所周知的。若需要多克隆抗體，則用多肽或片段免疫選定的動物(如小鼠、兔、山羊、馬、等)。由經免疫動物采集血清，并依照已知流程進行處理和可能的純化。參閱如Jurgens等人，JChrom,1985，348 :363_370。通過雜交瘤技術制備單克隆抗體的一般方法學是眾所周知的。可以通過細胞融合產生永生的抗體生成細胞系，也可以通過其它技木，諸如用致癌DNA直接轉化B淋巴細胞，或埃巴病毒轉染。參閱如Liddell JE編，A practical guide to monoclonalantibodies (單克隆抗體實踐指南)，John Wiley and sons, 1991,第 188 頁；de StGrothSJ 等人，J Immunol Methods，1980，35(1-2) :1_21。 依照本發明的核苷酸序列及其片段可以作為探針用于雜交，如在診斷方法中。有利的是使用嚴謹雜交條件。可以參考Sambrook等人，Molecular Cloning, ALaboratory Manual (分子克隆，實驗室指南)，冷泉港實驗室出版社，1989,1. 101-1. 104。嚴謹條件下的雜交指用Ix SSC緩沖液和0. 1% SDS于55°C、有利的是62°C、且更有利的是68°C清洗I小時后仍能觀察到陽性雜交信號，如用0. 2x SSC緩沖液和0. 1% SDST 55で、諸如62で、且有利的是68で清洗I小吋。還可以通過它們在嚴謹雜交條件下的結合能力來表征核苷酸序列。由此，本發明可以設想本文鑒定的核酸序列和在嚴謹雜交條件下與它們結合的核酸分子。依照本發明的核苷酸序列及其片段可以作為引物用于PCR或涉及擴增和/或雜交的類似方法，如用于檢測任何介質，例如組織樣品、生物學流體、水、食品中的革蘭氏陰性細菌。有利的是，使用具有依照本發明的核苷酸序列或基因(如SEQ IDN0:2、6、9、12、
16、19、22、25、28、31、34、37、40、43、46、49、52、55、58、61、64、67、70、75、78、81、84、87、90、93)的至少20個、諸如至少30個、如至少50個、例如至少70個、或更有利的是至少100個
連續核苷酸的核苷酸序列片段。另外,本發明涉及在動物或人中針對或預防細菌感染進行免疫或者針對細菌感染進行保護的方法，所述動物有利的是易受感染的動物，諸如鳥類、兔、牛、和豬，且更有利的是鳥類，諸如雞、火雞、和鴨(包括種畜、肉雞、和蛋雞)。依照這些方法，施用(I)本發明的活的減毒免疫原性組合物或疫苗、或(2)本發明的亞單位免疫原性組合物或疫苗、或(3)本發明的活的重組免疫原性組合物或疫苗、或其聯合。當然，可以與不屬于本發明的其它疫苗或免疫原性組合物一起使用本發明的實施方案，如在致敏-加強過程中，諸如首先施用本發明的疫苗或免疫原性組合物，然后施用不同的疫苗或免疫原性組合物，或順序相反。值得注意的是，可以通過肌肉內(頂)、皮內(ID)、或皮下(SC)注射或者通過鼻內、氣管內、或ロ服施用進行施用。有利的是，通過注射器、無針裝置(像例如Pigjet、Avijet、Dermojet或Bio jector (Bio jet,俄勒岡，美國))、噴霧、飲用水、滴眼液施用依照本發明的免疫原性組合物或疫苗。
活的減毒免疫原性組合物或疫苗的有利施用是in ovo、通過ロ(如飲用水、全身噴霧)、眼(如滴眼液、全身噴霧)、氣管(如噴霧)、皮內、皮下(SC)、或肌肉內(IM)途徑。熟練技術人員根據本公開書和本領域知識無需過度實驗就可以確定并優化活的減毒微生物的數量。一般而言，可以在單個劑量単元中對動物(包括人)施用大約
104-IO9CFU,有利的是大約IO5-IO8CFU,且更有利的是大約106-107CFU。可以在單個劑量単元中通過肌肉內途徑對鳥類動物施用大約IO4-IO7CFU,有利的是大約105-107CFU。單個劑量單元的體積可以在大約0. 2ml與大約0. 5ml之間，而且有利的是大約0.3ml。可以在單個劑量単元中通過ロ、氣管、或眼途徑對鳥類動物施用大約
105-IO8CFU,有利的是大約106-107CFU。對于噴霧施用，根據裝置和微滴大小調整體積，對于大約1000只動物是大約30ml-大約600ml，而且有利的是每只動物大約0. 2ml。對于牛和豬，有利的途徑是頂和SC。可以在單個劑量單元中對動物施用大約 IO4-IO9CFU,有利的是大約105-108CFU。單個劑量單元的體積可以在大約0. 2ml與大約5. Oml之間，而且有利的是在大約0. 5ml與大約2. Oml之間，而且更有利的是大約I. Oml0可以在單個劑量單元中通過頂或SC途徑對兔施用大約IO4-IO8CFU,有利的是大約105-107CFU。單個劑量單元的體積可以在大約0. 2ml與大約0. 5ml之間，而且有利的是大約0. 5ml。還可以在單個劑量単元中通過ID途徑對它們施用大約IO4-IO8CFU,有利的是大約105-107CFU。單個劑量單元的體積可以在大約0. Iml和大約0. 2ml之間。現在將通過下面的非限制性實施例進ー步描述本發明。
實施例實施例I :特征標記的多殺巴斯德氏菌轉座子突變體庫的構建(STM篩選)標記的SMlO Apir pLOF/km轉化子的構建如Hensel等人(Science，1995，269 =400-403)所述生成標簽。選擇包含較好雜交但彼此不交叉雜交的標簽的最初標記pUTminiTn5Km2質粒。發現標記的pUTminiTn5Km2載體中的Mini-Tn5轉座子在數種多殺巴斯德氏菌菌株中不轉座。相反，轉座子mini_TnlO顯示在多殺巴斯德氏菌中發揮功能(Lee等人，Vet Microbiol, 1996, 50 :143-148) 因此，將預先選擇的標簽由pUTminiTn5載體轉移到包含mini_TnlO的質粒pLOF/Km(Herrero等人，J Bacteriology，1990，172 :6557-6567)中。使用在克隆標簽的KpnI位點兩側結合PUTminiTn5Km2載體的引物通過PCR擴增標簽。這些引物包含限制酶SalI的序列。然后用SalI消化PCR產物并克隆到經修飾形式的pL0F/Km載體(其中SalI位點取代了唯一的SfiI克隆位點)的SalI位點中。然后將標記的pL0F/Km質粒轉化到大腸桿菌菌株SMlO A pir (Kmr> thi、thr、leu、tonA、lacY、supE、recA: :RP4_2_Tc: :Mu A pir) (Miller VL等人，J Bacteriol，1988，170 :2575-2583)中。該菌株能夠通過接合動員質粒諸如pLOF/Km進入受體細菌。篩選和反向選擇的方法接合過程需要選擇獲得了質粒pL0F/Km的受體多殺巴斯德氏菌的方法和反向選擇大腸桿菌SMlO A pir供體的方法。在選擇方法中，使用由mini-TnlO轉座子編碼的卡那霉素選擇受體多殺巴斯德氏菌。
最初,對于接合中大腸桿菌供體的反向選擇使用巴斯德氏菌菌株P-1059的自發鏈霉素抗性突變體。然而，似乎該菌株對火雞的毒カ減弱了，因而這里不能使用。多殺巴斯德氏菌菌株能夠在化學確定培養基(CDM) (Hu等人，Infection and Immunity, 1986,804-810)上生長。利用這種化學確定培養基含瓊脂但不含亮氨酸的經修飾形式進行針對大腸桿菌供體的反向選擇。巴斯德氏菌菌株能夠在這種培養基上生長，該培養基的組成列于表I中，而亮氨酸營養缺陷型的大腸桿菌SMlO入pir菌株則不能。表I:
多殺巴斯德氏菌菌株在CDM培養基上的傳代向凍干安瓿瓶中加入200 ill BHI(腦-心浸液)使多殺巴斯德氏菌菌株(USDAP-1059,可以由美國典型培養物保藏中心獲得，編號ATCC15742)復蘇，取一部分懸浮液在BHI瓊脂板上劃線，并于37°C保溫過夜。將該板上的菌落用于接種BHI肉湯培養基，并于37°C振搖培養過夜。加入甘油至終濃度15% v/v，并分裝凍存于-80°C。將這些凍存分裝物之一的樣品在BHI瓊脂板上劃線，并保溫過夜。然后將該BHI板上的菌落在成分如表I所列的CDM瓊脂板上劃線并于37°C保溫3天。將該CDM板上的菌落用于接種BHI肉湯培養基，并于37°C振搖培養過夜。向此培養物中加入甘油至終濃度15% v/v，并分裝凍存于-80°C。將此菌株稱為16084 (CDM)。突變體庫的構建將標記的SMlO A pir pLOF/Km轉化子與多殺巴斯德氏菌菌株16084 (CDM)進行接合。為了將同胞突變體(由于突變體在接合流程過程中復制而產生的、轉座子位于相同位 置的突變體)的分離降至最低，將每ー個標記SMlO A pir轉化子與多殺巴斯德氏菌菌株在至少三份分開的接合中進行接合。在補充50 u g/ml卡那霉素的CDM瓊脂板上選擇巴斯德氏菌轉座子突變體。然后將每ー個標記轉座子的卡那霉素抗性突變體在BHI卡那霉素50 u g/ml瓊脂板上劃線兩次以形成單菌落。然后將單菌落接種到BHI肉湯培養基中，并于37°C振搖培養過夜。然后加入甘油至終濃度15% v/v，并將突變體在分裝管中凍存于-80°C。實施例2 :特征標記的巴斯德氏菌突變體庫中對火雞的毒力減弱的突變體的篩選為了給火雞進行接種要培養多殺巴斯德氏菌突變體的培養物，將20iU實施例I中獲得的突變體的每份甘油原種與200 u I補充50 u g/ml卡那霉素的BHI培養基混合，并置于96孔微量滴定板中。將這些微量滴定板在靜止條件下于37°C保溫大約18小吋。然后將10 u I每種突變體的18小時培養物與200 u I補充50 u g/ml卡那霉素的BHI培養基在新的微量滴定板中混合，并將板于37°C保溫大約4小吋。在生長指數期停止培養，并將100 u I每種突變體的培養物轉移到新的微量滴定板中，并用于測定650nm的光密度(OD)。通過混合剰余的100 ill 4小時培養物而形成接種體或輸入庫。每個輸入庫由48種不同突變體組成。通過FACS(熒光激活細胞分揀)分析測定IOOiU這些合并懸浮液的滴度。然后將Iml合并懸浮液在生理學緩沖液中稀釋以獲得滴度為2xl07cfU/ml的懸浮液。然后給5只一組的三周齡火雞肌肉內接種0. 5ml這種懸浮液(每只動物IO7Cfu)。通過在接種前一天采集的血樣中篩選針對巴斯德氏菌的抗體的存在來確定火雞接種前的血清學狀況。通過離心由輸入庫剰余部分收獲細胞，并由細胞沉淀提取染色體DNA。接種后大約14小時，由5只火雞中的3只采集Iml血樣。將血樣的稀釋系列(KT1至10_7)鋪展到補充5%綿羊血液的Columbia瓊脂板上。將板于37°C保溫24小吋，然后將大約10000個巴斯德氏菌菌落重懸于BHI培養基。然后將稱為輸出庫的這些懸浮液離心，并由細胞沉淀提取染色體DNA。如Hensel等人所述(Science, 1995, 269 :400_403),通過輸入庫和輸出庫DNA樣品中存在的特征標簽(signature tags)的PCR擴增，以及擴增得到的PCR產物與加載了特征標簽編碼DNA的點印跡的雜交，來鑒定輸入庫中存在但未能由火雞再次分離到的巴斯德氏菌突變體。認為這些突變體的毒力潛在減弱了。這種減毒通過篩選火雞中潛在突變體的単一感染不引起死亡進行確認。實施例3 :多殺巴斯德氏菌突變體對火雞的毒カ減弱的確認為了復蘇在實施例2中鑒定為潛在減毒的轉座子突變體或具有在培養中生長的有限能力的突變體，將20 ill甘油原種與200 ill補充50 ii g/ml卡那霉素的BHI培養基在微量滴定板中混合。將這些微量滴定板在靜止條件下于37°C保溫大約18小吋。然后將10 u I每種突變體的這種培養物與200 u I補充50 u g/ml卡那霉素的BHI培養基在新的微量滴定板中混合，并將該板在靜止條件下保溫大約4小時。在生長指數期停止培養，并將100 Ul每種突變體的培養物轉移到新的微量滴定板中，并用于測定650nm的光密度(OD)。然后將每種突變體的培養物在生理學緩沖液中I : 10000稀釋以獲得大約2xl04cfu/ml的濃度。然后給2只五周齡火雞肌肉內接種0. 5ml這種稀釋液(每只動物IO4Cfu)。由接種前一天采集的血樣確定每組火雞中ー些動物的血清學狀況。對火雞監測隨后7天的死亡率。對于測試的突變體，72種突變體在接種的兩只鳥中都未引起死亡。認為這72種突變體的毒カ減弱了。
實施例4 :火雞篩選后鑒定的轉座子插入突變體的表征通過反向PCR或任意引發PCR克隆轉座子插入ー側的側翼DNA，從而鑒定減毒多殺巴斯德氏菌突變體基因組中的轉座子插入位點。通過在BHI卡那霉素50 ii g/ml瓊脂板上劃線，由-80°C甘油原種復蘇這些突變體。然后將單菌落用于接種BHI肉湯培養基，并由此制備染色體DNA。對于反向PCR，用限制性位點為4個堿基對的限制酶消化染色體DNA，諸如Tsp509I、aTaqI、_RsaI。然后在大體積中連接DNA以促進分子內連接。然后使用與轉座子已知序列退火的向外引物由這種連接DNA模板擴增轉座子側翼DNA，諸如StipJ(SEQ IDNO :98，20 聚物)(5' ATC TGA TCC TTC AAC TCA GC 3' )、StipA(SEQ ID NO :99，19 聚物)(5' CGC AGG GCT TTA TTG ATT C 3' )、KTGRI (SEQ IDNO : 100，27 聚物)(5' GCC GAATTC GAT GAA TGT TCC GTT GCG3' ) ,TnlOIRl (SEQ ID N0:101，20聚物)(5' TTT ACC AAAATCATT AGG GG 3')、和TnlOIR4(SEQ ID NO :102,19聚物)(5' GATCAT ATG ACA AGA TGTG 3')。然后將這些反向PCR產物克隆并測序。對于任意引發PCR，將染色體DNA作為模板用于第一輪PCR，其中使用一種與轉座子退火的外向引物諸如StipA和ー種任意引物諸如arbl(SEQ ID NO :103，35聚物)(5' GGCCAC GCG TCG ACT AGT CANNNN NNN NNN GAT AT 3')或 arb6 (SEQ ID NO :104,35 聚物)(5' GGC CAC GCG TCG ACT AGT CAN NNN NNN NNN CAG CC 3')。這第一輪 PCR 的退火溫度最初設得非常低，并在后續循環中升高。然后將這第一輪PCR的一部分產物作為模板用于第二輪PCR。這第二輪PCR利用另ー種向外引物，諸如KTGRI，它與轉座子退火的位置比第ー輪PCR中所使用的引物更接近轉座子的末端。這第二輪PCR中所使用的另ー種引物與第ー輪PCR中所使用的任意引物的5'端已知序列的20個堿基具有相同序列，諸如arb2 (SEQID NO :105,20 聚物)(5' GGC CACGCG TCG ACT AGT AC 3')。然后將這第二輪 PCR 的 PCR產物克隆并測序。然后分析獲得的序列以鑒定可能被轉座子破壞的開放讀碼框(ORF)，并用于捜索目前可以在EMBL數據庫和由明尼蘇達大學(MayBJ等人，Proc Natl Acad Sci USA, 2001,98(6) =3460-3465)測定的多殺巴斯德氏菌菌株PM70基因組序列中獲得的相似序列。
注意，在下列核苷酸序列中，N相當于任何核苷酸(A或C或G或T)。突奪體1G4、3F4、3G12、12D6、和 14C10突變體1G4、3F4、和12D6具有完全相同的轉座子插入位點。轉座子插入位點側翼的DNA序列顯示于SEQ ID NO :1 (775聚物)。轉座子是緊挨著該序列的5'末端插入的。起始密碼子位于序列SEQ ID NO 1的第179-181位。對于突變體3G12，轉座子插入位點側翼的DNA序列顯示于SEQ IDNO :95(101聚物)。轉座子是緊挨著該序列的5'末端插入的。對于突變體14C10，轉座子插入位點側翼的DNA序列顯示于SEQ IDNO :96(220聚物)。轉座子是緊挨著該序列的3'末端插入的。 通過使用由SEQ ID NO :1編碼的60個氨基酸的序列進行的blast，鑒定了 4個其它巴斯德氏菌科的蛋白質和基因。
菌株基因(Genbank編號)蛋白質'(Genbank編號)同'一性％
多殺巴斯德氏菌PhyA ( AF067175 ) PhyA ( AAC67248 ) 60個氨基酸上
_分類群 747 ___100 % _
多殺巴斯德氏菌 PM0773 ( AE006115 ) PhyA ( AAK02857 ) 60個氨基酸上
PM70____98%_
多殺巴斯德氏菌 PhyA ( AF3O2467 ) PhyA ( AAKl7919) 6O個氨基酸上P421898%
多殺巴斯德氏菌 PhyA ( AF302465 ) PhyA ( AAK17907 ) 60個數基酸上P93495 %轉座子在突變體1G4、3F4、和12D6中的定位對應于多殺巴斯德氏菌PM70基因組序列Genbank編號AE006115的第8507-8508位之間。轉座子在突變體3G12中的定位對應于序列AE006115的第8609-8610位之間。轉座子在突變體14C10中的定位對應于序列AE006115的第8517-8518位之間。轉座子破壞了 PM70基因PM0773即PhyA的同源物。PhyA基因預測參與被膜合成。PM0773的核苷酸序列在本文中鑒定為SEQ IDNO :2，而其氨基酸序列鑒定為SEQ ID NO :3。突變體1G8、9D1、和 9D8在突變體1G8中，轉座子是緊挨著序列SEQ ID NO :4(226聚物)的3'末端插入的。該序列具有兩個編碼潛在較長蛋白質的開放讀碼框(+2和-2)。依照本發明的ORF是讀碼框-2。在突變體9D1中，轉座子是緊挨著序列SEQ ID NO :5(87聚物)的3'末端插入的。插入突變體9D8中的轉座子位于序列SEQ ID NO 4的第225位之后。在突變體1G8、9D1、和9D8中，轉座子破壞了 PM70基因PM0871的同源物。轉座子在這些突變體中的定位對應于多殺巴斯德氏菌PM70基因組序列Genbank編號AE006125的第9849-9850位之間(突變體1G8)、第8899-8900位之間(突變體9D1)、或9848-9849位之間(突變體9D8)。PM0871的核苷酸序列在本文中鑒定為SEQ ID NO :6，而其氨基酸序列鑒定為 SEQ ID NO :7。通過使用SEQ ID NO 7進行的blast，鑒定了另ー種巴斯德氏菌科的基因/蛋白質。這是流感嗜血菌HI1586 (Genbank編號U32832和AAC23234)。我們發現在PM0871與HI1586之間在507個氨基酸上具有72%同一性。突變體2F2轉座子插入位點側翼的DNA序列顯示于SEQ ID NO :8(78聚物)。轉座子是緊挨著該序列的5'末端插入的。該序列具有三個編碼潛在較長蛋白質的開放讀碼框(+1、+2和-1)。依照本發明的ORF是讀碼框+2。在突變體2F2中，轉座子破壞了 PM70基因PM1727的同源基因。該轉座子的定位對應于多殺巴斯德氏菌PM70序列Genbank編號AE006210 (PM1727)的第644-645位之間。 PM1727的核苷酸序列在本文中鑒定為SEQ ID NO :9，而其氨基酸鑒定為SEQ ID NO :10。通過使用SEQ ID NO :10進行的blast，鑒定了另ー種巴斯德氏菌科的基因/蛋白質。這是流感嗜血菌HI0621(Genbank編號U32744和AAC22281)。我們發現在PM1727與HI0621之間在183個氨基酸上具有77%同一性。PM1727是水解酶超家族的成員，具體而言，它與磷酸組氨醇磷酸酶有夫。突奪體3A2轉座子插入位點側翼的DNA序列顯示于SEQ ID NO :11 (467聚物)。轉座子是緊挨著該序列的5'末端插入的。終止密碼子位于第428-430位。在突變體3A2中，轉座子的定位對應于多殺巴斯德氏菌PM70序列Genbank編號AE006094 (PM0586)的第5103-5104位之間。PM0586的核苷酸序列在本文中鑒定為SEQ IDNO : 12，而其氨基酸序列鑒定為SEQ ID NO 130通過使用SEQ ID NO :13進行的blast，鑒定了另外兩種巴斯德氏菌科的基因和蛋白質。這些基因和蛋白質是溶血巴斯德氏菌AlPlpD (Genbank編號AF058703和AAC32565)和睡眠嗜血菌31kDa (Genbank編號L07795和AAA24941)。我們發現在PM0586與溶血巴斯德氏菌PlpD之間在276個氨基酸上具有73%同一性，而在PM0586與睡眠嗜血菌31kDa之間在273個氨基酸上具有71%同一性。PlpD和PM0586是ompA蛋白質家族的成員。突變體3D3轉座子插入位點兩側的側翼DNA序列顯示于SEQ ID NO :14 (204聚物，轉座子在5'末端)和SEQ ID NO :15(35聚物，轉座子在5'末端)。終止密碼子位于SEQ ID NO 14的第7-9位和SEQ ID NO 15的第33-35位。通過使用SEQ ID NO : 14及其編碼的氨基酸序列(65個氨基酸)進行的blast，鑒定了另一種巴斯德氏菌科的基因/蛋白質。我們發現與蛋白質PM0064在65個氨基酸上具有100%同一性。轉座子在突變體3D3中的定位分別對應于多殺巴斯德氏菌PM70基因組序列 Genbank 編號 AE006042 的第 4778-4779 位或第 4787-4788 位之間(由 SEQ ID NO 14 和SEQ ID NO :15推導的位置)。這種差異可能是因為轉座子的插入導致轉座子插入位點處的少數核苷酸發生復制。第4788位位于基因PM0064中。第4778位在PM0064終止密碼子的下游6bp處。PM0064的核苷酸序列在本文中鑒定為SEQ ID NO : 16，而其氨基酸序列鑒定為SEQID NO -.Il0通過使用SEQ ID NO :17進行的blast，鑒定了其它革蘭氏陰性細菌的基因和蛋白質。

權利要求
1.革蘭氏陰性細菌突變體，其中所述細菌在核苷酸序列中具有突變，且所述核苷酸序列編碼的多肽與由SEQ ID NO :75的核苷酸序列編碼的氨基酸序列具有等于或大于70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%的同一性，所述突變導致細菌的毒力減弱，其中所述突變是在SEQ ID NO 75的第1072-1087位核苷酸之間的插入。
2.權利要求I的突變體，其中所述突變具有第二多肽，第二多肽具有由SEQID NO 75所示核苷酸序列編碼的氨基酸序列。
3.權利要求I或2的突變體，其中細菌是巴斯德氏菌科。
4.權利要求3的突變體，其中細菌選自多殺巴斯德氏菌、溶血巴斯德氏菌、鴨瘟巴斯德氏菌和大葉性肺炎放線桿菌。
5.權利要求4的突變體，其中細菌是多殺巴斯德氏菌。
6.權利要求1-5中任ー項的突變體，它包含異源核酸序列，所述異源核酸序列編碼來自 致病病毒性、寄生物性或細菌性因子的免疫原、治療性蛋白質、變應原、生長因子或細胞因子。
7.權利要求1-6中任ー項的突變體，其具有SEQID NO 75的核苷酸序列中的突變。
8.權利要求1-7中任ー項的突變體，其是可以以編號CNCMI-3001獲得的突變體9G8。
9.權利要求1-7中任ー項的突變體，其中所述突變體具有2個或更多個突變。
10.權利要求1-7中任ー項的突變體，其具有突變的2個或更多個如下序列SEQIDNO :2、6、9、12、16、19、22、25、28、31、34、37、40、43、46、49、52、55、58、61、64、67、70、75、78、81、84、87、90、或 93。
11.權利要求1-7中任ー項的突變體，其具有突變的2個或更多個如下序列SEQIDNO :37、40、75、90、93。
12.權利要求1-7中任ー項的突變體，其具有突變的2個或更多個如下序列SEQIDNO :37 和 75 ；SEQ ID NO :40 和 75 ；SEQ ID NO :75 和 90 ;或 SEQ ID NO 75 和 93。
13.包含權利要求1-12中任一項的減毒的突變體以及制藥學可接受稀釋劑、載體、介質、或賦形劑的疫苗。
14.權利要求13的疫苗，還包含佐劑。
15.包含依照權利要求1-12中任一項的減毒的突變體以及制藥學可接受稀釋劑、載體、介質、或賦形劑的的免疫原性組合物。
16.權利要求15的免疫原性組合物，還包含佐劑。
17.具有SEQID NO :75所示序列并具有第1072-1087位核苷酸之間的插入的分離核酸分子。
18.權利要求1-12中任一項的突變體在制備活的減毒免疫原性組合物或制備活的減毒疫苗組合物中的用途。
19.權利要求1-12中任ー項的突變體，權利要求13或14的疫苗，或者權利要求15或16的免疫原性組合物，用于在動物中針對或預防細菌感染進行免疫。
20.權利要求1-12中任ー項的革蘭氏陰性細菌突變體，權利要求13或14的疫苗，或者權利要求15或16的免疫原性組合物在制備用于在動物中針對或預防細菌感染進行免疫的藥物中的用途。
全文摘要
本發明公開并要求保護革蘭氏陰性細菌的突變體，其中所述細菌在核苷酸序列中具有至少一處突變，且由所述核苷酸序列編碼的多肽與由選自下組的核苷酸序列編碼的氨基酸序列具有等于或大于70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％的同一性SEQID NO2、6、9、12、16、19、22、25、28、31、34、37、40、43、46、49、52、55、58、61、64、67、70、75、78、81、84、87、90、和93所示核苷酸序列，所述突變導致細菌的毒力減弱。本發明還公開并要求保護包含這種突變體的免疫原性組合物和疫苗。
文檔編號A61K39/39GK102864090SQ20111043111
公開日2013年1月9日 申請日期2003年4月4日 優先權日2002年4月5日
發明者H·R·科魯克, J·E·施, R·G·費爾德曼, S·G·科特布羅澤, F-X·里格羅斯 申請人:梅瑞爾有限責任公司