專利名稱：調節性樹突細胞的制備方法
技術領域：
本發明涉及在起因于免疫系統的異常應答和過度應答的移植排斥反應、移植物抗宿主病、自身免疫疾病、變態反應疾病、慢性炎性疾病和敗血癥等疾病的預防和治療中利用的調節性樹突細胞的制備方法。更詳細地，本發明涉及應用[1，2，4]三唑并[l，5_a]嘧啶衍生物、特別是(S)-(+)-1-(5-羥基-I, 5- 二甲基己基)-3-[7-(4-甲氧基苯基)-[1，2，4]三唑[1，5-α]嘧啶-2-基]脲(ΝΚ026680)的調節性樹突細胞的制備方法。進一步地，本發明涉及通過上述方法制備的調節性樹突細胞、以及含有上述調節性樹突細胞的藥物組合物或藥物試劑盒。進一步地，本發明涉及[1，2，4]三唑并[l，5-a]嘧啶衍生物在調節性樹突細胞的制備中的用途。
背景技術：
對于起因于免疫性的異常和過度應答的疾病的預防和治療，迄今主要利用免疫抑 制劑、抗炎癥劑和抗變態反應劑等藥劑。藥劑治療是有效的，但也產生副作用引起的患者的QOL低下的問題。這些藥劑也遷移到靶免疫細胞以外的組織。藥物在這種靶外組織中表現非特異性的作用，從而出現副作用。由于這種副作用，常常發生盡管顯示免疫抑制效果也不得不中止給藥的情況，另外，進行用于減輕副作用的醫療處置等有時也降低患者的Q0L。也嘗試通過局部給藥減輕副作用，但其限于疾病部位局限于特定的組織或器官的特應性皮炎、支氣管哮喘等。因此，嘗試應用調節性樹突細胞進行前述疾病等的預防和治療。樹突細胞是具有樹狀突起的抗原呈遞細胞，在末梢非淋巴組織、淋巴組織中作為未成熟樹突細胞廣泛存在。在受微生物、病毒、異物等外來抗原侵襲的炎癥組織中，其吞噬這些抗原而分化為成熟樹突細胞，并向所屬次級淋巴組織遷移。在此處，成熟樹突細胞與抗原刺激共刺激幼稚T細胞，使其分化誘導為抗原特異性效應T細胞而引起免疫應答。這樣的樹突細胞是連接天然免疫和獲得性免疫的強有力的抗原呈遞細胞。一方面揭示了，存在在炎癥環境下共刺激分子的表達降低的樹突細胞，這些樹突細胞抑制性地調節T細胞，誘導對自身組織等的免疫耐受。這樣的樹突細胞稱為調節性樹突細胞。應用調節性樹突細胞的免疫細胞療法在小鼠中在移植物抗宿主病、自身免疫疾病、變態反應疾病模型中誘導抗原特異性不應答T細胞、調節性T細胞，從而顯示治療效果(非專利文獻1、2和3)。進一步地，在小鼠敗血癥模型中，調節性樹突細胞通過IL-10的產生阻礙炎性細胞因子的產生而顯示延長壽命的效果(非專利文獻4)。專利文獻I記載了，將人樹突細胞或其前體細胞在體外與至少含有IL-10和TGF-β的細胞因子類共培養而誘導人免疫調節性樹突細胞的方法，和通過該方法得到的人免疫調節性樹突細胞。專利文獻2嘗試了，將調節性樹突細胞作為IL-10產生促進劑使用，用于全身性炎癥反應綜合征。迄今，致力于應用如前述的調節性樹突細胞的免疫細胞療法對免疫疾病的臨床應用，對于實際臨床應用，需要建立包含調節性樹突細胞的安全性的大量制備方法。如非專利文獻I中所示，迄今報告的調節性樹突細胞的制備中使用包含IL-IO和TGF-β的細胞因子類等，但由于這些細胞因子類由大腸桿菌等的基因重組體制備，具有阻礙大量制備的制備成本、安全性的問題。一方面，[I, 2，4]三唑并[1，5-a]嘧啶衍生物(專利文獻3和4)是阻礙樹突細胞的功能的物質，對小鼠延遲型過敏反應顯示抑制作用(專利文獻4)。特別地，在其衍生物之一的(S)-⑴-1-(5-羥基-1,5-ニ甲基己基)-3-[7-(4_甲氧基苯基)-[1，2，4]三唑并[I, 5-α]嘧啶-2-基]脲(下文稱為“ΝΚ026680”)存在下培養樹突細胞，共刺激分子的表達降低，另外ΝΚ026680對移植物抗宿主病模型和自身免疫性血管炎模型顯示效果(非專利文獻5和6)。現有技術文獻 專利文獻 專利文獻I :特開2004-298181號公報 專利文獻2 :特開2006-290761號公報 專利文獻3 :特開2005-154335號公報 專利文獻4 :國際公開2004/108729號公報。非專利文獻
非專利文獻 I Sato K, Yamashita N, Yamashita N, Baba M, Matsuyama T.Regulatory dendritic cells protect mice from murine acute graft-versus-hostdisease and leukemia relapse. Immunity 2003; 18(3): 367-379.
非專利文獻 2 :Sato Kj Yamashita N，Baba M，Matsuyama T. Modified myeloiddendritic cells act as regulatory dendritic ceils to induce anergic andregulatory T cells. Blood 2003; 101(9): 3581-3589.
非專利文獻 3 :Fujita Sj Yamashita N，Ishii Y，Sato Y，Sato K，Eizumi K，Fukaya T， Nozawa R， Takamoto Y， Yamashita N， Tanigucni M， Sato K. Regulatorydendritic cells protect against allergic airway inflammation in a murineathmatic model. J Allergy Clin Immunol 2008; 121(1): 95-104.
非專利文獻 4 :Fujita Sj Seino K，Sato K，Sato Y，Eizumi K，Yamashita N，Taniguchi M， Sato K. Regulatory dendritic cells act as regulators of acutelethal systemic inflammatory response. Blood 2006; 107(9): 3656-3664.
非專利文獻5 ；Saiga K，Toyoda E，Tokunaka K，Masuda A，Matsumoto S，MashibaHj Kuramochi H，Nemoto K，Abe F，Kawagishi N，Furukawa H，Ono Μ. NK026680，anovel compound suppressive of dendritic cell function, ameliorates mortality inacute lethal graft-versus-host reaction in mice. Bone Marrow Transplant 2006;37(3) : 317-323.
非專利文獻 6 Saiga K，Yoshida M，Nakamura I，Toyoda E，Tokunaka K，Morohashi H， Abe F， Nemoto K， Nose M. Evaluation of the ameliorative effectsof immunosuppressants on crescentic glomerulonephritis in SCG/Kj mice. IntImmunopharmacoI 2008; 8(9): 1183-1189。

發明內容
發明要解決的課題
本發明要解決的課題是，建立能夠安全且簡便地制備大量的調節性樹突細胞的方法。進ー步地，本發明要解決的課題是，提供維持患者的QOL的、對于免疫系統疾病的預防和治療有用的調節性樹突細胞。解決課題的手段
本發明人為了解決上述課題而深入研究，結果發現，通過在[1，2， 4]三唑并[l，5-a]嘧啶衍生物的存在下培養可誘導為調節性樹突細胞的細胞，能夠制備調節性樹突細胞，從而完成本發明。即，根據本發明，提供以下的發明。(I)調節性樹突細胞的制備方法，其包括在[1，2，4]三唑并[1，5-a]嘧啶衍生物的存在下培養可誘導為調節性樹突細胞的細胞。(2) (I)中記載的調節性樹突細胞的制備方法，其中[1，2，4]三唑并[l，5_a]嘧啶衍生物是(S) - (+)-I-(5-羥基-1，5- ニ甲基己基)-3- [7- (4-甲氧基苯基)-[1，2，4]三唑并[1，5-α]嘧啶-2-基]脲。(3) (I)或(2)中記載的調節性樹突細胞的制備方法，其中可誘導為調節性樹突細胞的細胞是樹突細胞或其前體細胞。(4) (3)中記載的調節性樹突細胞的制備方法，其中樹突細胞的前體細胞是單核細胞。(5) (I)至⑷中的任一項中記載的調節性樹突細胞的制備方法，其中可誘導為調節性樹突細胞的細胞是末梢血、骨髄、脾臟、或臍帶血來源的細胞。(6) (I)至(5)的任一項中記載的調節性樹突細胞的制備方法，其包含在GM-CSF和IL-4的存在下培養細胞。(7) (I)至(6)的任一項中記載的調節性樹突細胞的制備方法，其包含在TNF-α和/或LPS的存在下培養細胞。(8)由(I)至(7)的任ー項中記載的制備方法制備的調節性樹突細胞。(9) (8)中記載的調節性樹突細胞，與通過在[1，2，4]三唑并[1，5-a]嘧啶衍生物不存在下培養可誘導為調節性樹突細胞的細胞而得到的細胞比較，其CD40、CD80和CD86的表達量低。(10) (8)或(9)中記載的調節性樹突細胞，與通過在[1，2，4]三唑并[1，5-a]嘧啶衍生物不存在下培養可誘導為調節性樹突細胞的細胞而得到的細胞比較，其IL-6和IL-12 p40的產生量低。(11) (8)至(10)的任一項中記載的調節性樹突細胞，與通過在[1，2，4]三唑并[I, 5-a]嘧啶衍生物不存在下培養可誘導為調節性樹突細胞的細胞而得到的細胞比較，其誘導T細胞針對異源抗原活化的能力低。(12)含有(8)至(11)的任一項中記載的調節性樹突細胞的藥物組合物或藥物試劑盒。(13) (12)中記載的藥物組合物或藥物試劑盒，其用于在起因于免疫系統的異常應答和過度應答的移植排斥反應、移植物抗宿主病、自身免疫疾病、變態反應疾病、慢性炎性疾病和敗血癥的預防和/或治療中應用。(14) [I, 2，4]三唑并[1，5-a]嘧啶衍生物在調節性樹突細胞的制備中的應用。(15) (14)中記載的應用，其中[1，2，4]三唑并[l，5_a]嘧啶衍生物是(S)-(+)-l-(5-羥基-1，5-ニ甲基己基)-3-[7-(4_ 甲氧基苯基)-[1，2，4]三唑并[I, 5-α ]嘧啶-2-基]脲。(16)含有[1，2，4]三唑并[1，5-a]嘧啶衍生物的調節性樹突細胞誘導試劑。(17) (16)中記載的調節性樹突細胞誘導試劑，其中[1，2，4]三唑并[1，5_a]嘧啶衍生物是(S) - (+)-I-(5-羥基-1，5- ニ甲基己基)-3- [7- (4-甲氧基苯基)-[1，2，4]三唑并[1，5-α]嘧啶-2-基]脲。
發明的效果
本發明中的[1，2，4]三唑并[l，5-a]嘧啶衍生物對于在生物體外從末梢血細胞、骨髄細胞等中包含的單核的細胞誘導調節性樹突細胞是有用的。[1，2，4]三唑并[l，5-a]嘧啶衍生物是制備成本低且能夠確保大量生產和安全性的低分子化合物。通過將[1，2，4]三唑并[l，5-a]嘧啶衍生物用于調節性樹突細胞的制備，能夠安全且簡便地得到大量的調節性樹突細胞。本發明中，可以不應用昂貴且物理性質不穩定的基因重組細胞因子類、以低成本配制大量的調節性樹突細胞。另外，由于本發明的調節性樹突細胞中不殘留制備中使用的藥劑，不發生制備中使用的藥劑引起的副作用，對于骨髄抑制、臟器移植、自身免疫疾病、變態反應疾病和休克等起因于免疫系統的異常和過度應答的疾病的預防和治療是非常有效的。


圖I顯示本發明的調節性樹突細胞(NK-DC)、未處理樹突細胞(CTR-DC)和未成熟樹突細胞(unstim-DC)的3H_TdR的摻入(incorporation)。黑色圓圈表示NK-DC,白色圓圈表示 CTR-DC，X 表示 unstim-DC。圖2顯示分別移入本發明調節性樹突細胞(NK-DC)與未處理樹突細胞(CTR-DC)的C3He/J小鼠中，移植了 C57BL/6小鼠的心臟的心移植C3He/J小鼠的存活率。實線表示NK-DC,點線表示 CTR-DC。具體實施方案
本發明中，通過將可誘導為調節性樹突細胞的細胞(例如，樹突細胞或其前體細胞等)在試管內應用[1，2，4]三唑并[l，5-a]嘧啶衍生物處理、以及根據期望應用細胞因子類和/或炎性刺激物處理，可以制備調節性樹突細胞。具體地，通過向從末梢血或骨髓等收集的單核細胞中添加GM-CSF、IL-4、[I, 2，4]三唑并[1，5-a]嘧啶衍生物而誘導樹突細胞、和對該樹突細胞進行細胞因子類和/或炎性刺激(例如TNF-α、LPS等)處理，可以獲得調節性樹突細胞。另外，這些細胞因子類和/或炎性刺激、和[1，2，4]三唑并[l，5-a]嘧啶衍生物的刺激順序沒有特別限制，通過以任意順序進行該刺激順序，可以配制調節性樹突細胞。作為ー個例子，通過將單核細胞在GM-CSF和IL-4的存在下體外培養，使單核細胞分化為樹突細胞，得到的樹突細胞通過[1，2，4]三唑并[l，5-a]嘧啶衍生物可誘導調節性樹突細胞。此時，可以將單核細胞最初用GM-CSF和IL-4刺激分化為樹突細胞后用[1，2，4]三唑并[I, 5-a]嘧啶衍生物刺激，也可以用GM-CSF、IL-4、[I, 2，4]三唑并[I, 5-a]嘧啶衍生物同時刺激。此時，可以使使調節性樹突細胞分化的細胞因子類(例如IL-IO和TGF-β等)與[1，2，4]三唑并[1，5-a]嘧啶衍生物共存。進ー步地，通過TNF-α、LPS等給予炎性刺激，可以得到成熟的調節性樹突細胞。在本發明的調節性樹突細胞的制備中使用的細胞因子類、炎性刺激物沒有特別限制。細胞因子類可列舉，例如GM-CSF、IL-4、IL-10, TGF-β等具有分化誘導樹突細胞的作用的物質。炎性刺激物可列舉，例如以LPS為代表的脂多糖、TNF-α等賦予炎性刺激的細胞因子。樹突細胞通過在GM-CSF和/或IL_4的存在下培養如前述的單核細胞獲得。此時的單核細胞可以源自末梢血、源自骨髄、源自脾臟細胞、源自臍帶血。進ー步地，可以利用細胞分選儀等，以⑶Ia等樹突細胞特異性表面抗原的表達為指標，從這些組織、器官分離樹突細胞。利用細胞分選儀分離特定細胞群可以利用公知的方法進行。用于得到本發明的調 節性樹突細胞的單核細胞源自哺乳動物即可，可列舉靈長目、嚙齒目、食肉目、偶蹄目、奇蹄目等，例如人、猴、小鼠、大鼠、兔、貓、牛、犬、馬、山羊等，最優選地是人。在上述中優選地，與利用本發明的調節性樹突細胞實施疾病的預防或治療的動物為同種來源。單核細胞、樹突細胞的培養可以通過公知的淋巴系細胞培養技術進行。培養液可以應用例如RPMI1640、DMEM，可在這些基本培養基中添加適當的抗生素、動物血清等進行培養。培養容器也不進行限定，可以根據培養規模適當選擇并應用市售的平板、培養皿、搖瓶。本發明中應用的[1，2，4]三唑并[1，5-a]嘧啶衍生物具體為特開2005-154335號公報和國際公開2004/108729號公報中記載的化合物。即，本發明中應用的[1，2，4]三唑并[l，5-a]嘧啶衍生物優選地是下述通式(I)中表示的化合物或其藥學容許的鹽。[化學式I]
權利要求
1.調節性樹突細胞的制備方法，其包括在[1，2，4]三唑并[l，5-a]嘧啶衍生物的存在下培養可誘導為調節性樹突細胞的細胞。
2.權利要求I中記載的調節性樹突細胞的制備方法，其中[1，2，4]三唑并[l，5-a]嘧啶衍生物是(S) - (+)-I-(5-羥基-1，5- ニ甲基己基)-3-[7- (4-甲氧基苯基)-[1，2，4]三唑并[1，5-α]嘧啶-2-基]脲。
3.權利要求I或2中記載的調節性樹突細胞的制備方法，其中可誘導為調節性樹突細胞的細胞是樹突細胞或其前體細胞。
4.權利要求3中記載的調節性樹突細胞的制備方法，其中樹突細胞的前體細胞是單核細胞。
5.權利要求I至4的任一項中記載的調節性樹突細胞的制備方法，其中可誘導為調節性樹突細胞的細胞是末梢血、骨髄、脾臟、或臍帶血來源的細胞。
6.權利要求I至5的任一項中記載的調節性樹突細胞的制備方法，其包含在GM-CSF和IL-4的存在下培養細胞。
7.權利要求I至6的任一項中記載的調節性樹突細胞的制備方法，其包含在TNF-α和/或LPS的存在下培養細胞。
8.由權利要求I至7的任ー項中記載的制備方法制備的調節性樹突細胞。
9.權利要求8中記載的調節性樹突細胞，與通過在[1，2，4]三唑并[l，5-a]嘧啶衍生物不存在下培養可誘導為調節性樹突細胞的細胞而得到的細胞比較，其CD40、CD80和CD86的表達量低。
10.權利要求8或9中記載的調節性樹突細胞，與通過在[1，2，4]三唑并[l，5-a]嘧啶衍生物不存在下培養可誘導為調節性樹突細胞的細胞而得到的細胞比較，其IL-6和IL-12P40的產生量低。
11.權利要求8至10的任一項中記載的調節性樹突細胞，與通過在[1，2，4]三唑并[I, 5-a]嘧啶衍生物不存在下培養可誘導為調節性樹突細胞的細胞而得到的細胞比較，其誘導T細胞針對異源抗原活化的能力低。
12.含有權利要求8至11的任一項中記載的調節性樹突細胞的藥物組合物或藥物試劑盒。
13.權利要求12中記載的藥物組合物或藥物試劑盒，其用于在起因于免疫系統的異常應答和過度應答的移植排斥反應、自身免疫疾病、變態反應疾病、炎性疾病、敗血癥或休克的預防和/或治療中應用。
14.[1,2,4]三唑并[l，5-a]嘧啶衍生物在調節性樹突細胞的制備中的應用。
15.權利要求14中記載的應用，其中[1，2，4]三唑并[1，5-a]嘧啶衍生物是(S)-(+)-1-(5-羥基-1，5-ニ甲基己基)-3-[7-(4_ 甲氧基苯基)-[1，2，4]三唑并[I, 5-α ]嘧啶-2-基]脲。
16.含有[1，2，4]三唑并[l，5-a]嘧啶衍生物的調節性樹突細胞誘導試劑。
17.權利要求16中記載的調節性樹突細胞誘導試劑，其中[1，2，4]三唑并[l，5-a]嘧啶衍生物是(S) - (+)-I-(5-羥基-1，5- ニ甲基己基)-3- [7- (4-甲氧基苯基)-[1，2，4]三唑并[1，5-α]嘧啶-2-基]脲。
全文摘要
本發明的目的是建立能夠安全且簡便地制備大量的調節性樹突細胞的方法。根據本發明，提供了調節性樹突細胞的制備方法，包括在[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶衍生物存在下培養可誘導為調節性樹突細胞的細胞。
文檔編號A61P37/06GK102834506SQ20118001051
公開日2012年12月19日 申請日期2011年2月23日 優先權日2010年2月23日
發明者藤堂省, 山下健一郎, 柴崎晉 申請人:日本化藥株式會社, 國立大學法人北海道大學