專(zhuān)利名稱(chēng)：富勒烯及其衍生物在射頻或微波照射下作為制備治療皮膚病或腫瘤藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是一種富勒烯及其衍生物在射頻或微波照射下作為制備治療皮膚病或腫瘤藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
富勒烯以其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)倍受人們重視，近十年來(lái)，幾乎全世界所有著名大學(xué)和研究所的科學(xué)家都進(jìn)行了與富勒烯有關(guān)的研究。它已成為當(dāng)今物理、化學(xué)、材料及生命科學(xué)研究者共同關(guān)心的課題。富勒烯的獨(dú)特結(jié)構(gòu)賦予了它一些特殊的性質(zhì)。如摻雜堿金屬的富勒烯具有超導(dǎo)性能；富勒烯具有長(zhǎng)的三重激發(fā)態(tài)壽命，成為研究激發(fā)態(tài)化學(xué)和物理特性的理想平臺(tái)；富勒烯能有效地把302轉(zhuǎn)變成102，量子效率幾乎達(dá)到100%，從而具有優(yōu)異的抗癌滅菌能力。射頻(RadioFrequency, RF)是一種高頻交流變化電磁波的簡(jiǎn)稱(chēng),表示可以福射到空間的電磁頻率，頻率范圍從300KHz-30GHz之間。其中13.56MHz最為常用。射頻治療是通過(guò)射頻電磁場(chǎng)對(duì)人體局部組織進(jìn)行加熱治療，射頻治療皮膚病、癌腫是皮膚或?qū)嶓w腫瘤透熱治療的一種方式。射頻的治療作用主要是通過(guò)感應(yīng)電作用、電解作用以及熱效應(yīng)等對(duì)組織產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)。根據(jù)射頻的生物熱效應(yīng)原理，射頻作用于生物體后可導(dǎo)致殺死病菌、擴(kuò)張血管，使血液和淋巴液循環(huán)加快，毛細(xì)血管和細(xì)胞膜通透性增加，細(xì)胞內(nèi)酶活性提高，新陳代謝加速。增強(qiáng)機(jī)體免疫系統(tǒng)的功能，抑制和殺滅某些病原微生物，從而達(dá)到活血、抗炎抗癌、消腫之目的。另外，射頻能降低感覺(jué)神經(jīng)的興奮性，降低肌肉和纖維結(jié)締組織的張力，軟化瘢痕組織，具有解痙止痛效果。與激光比較， 射頻電波有如下特點(diǎn):(1)選擇性電熱作用:與激光的作用原理不同，射頻轉(zhuǎn)化的熱能產(chǎn)生于組織內(nèi)部，發(fā)射極本身不發(fā)熱，無(wú)電流通過(guò)人體，所以局部作用溫度低而熱效應(yīng)高，減輕了對(duì)周?chē)M織的損傷和細(xì)胞的破壞，特別是皮下脂肪液化性壞死少，Sadick等稱(chēng)之為“選擇性電熱作用”；(2)微創(chuàng):透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，射頻電波刀對(duì)組織側(cè)面的熱損傷深度僅為15 μ m,而普通電刀>650 μ m, C02激光和欽激光均>500 μ m,手術(shù)刀雖對(duì)組織無(wú)熱效應(yīng)，但有機(jī)械損傷；(3)安全:由于射頻對(duì)組織細(xì)胞的損傷極輕微，故術(shù)后恢復(fù)快，瘢痕不明顯，無(wú)色素沉著。此外，射頻對(duì)組織的切割是無(wú)壓力切割，切口光滑精細(xì)、止血良好、對(duì)病變組織氣化完全、無(wú)炭化、溫度可調(diào)、視野清晰；(4)用于皮膚科治療特點(diǎn):無(wú)創(chuàng)傷性治療；治療后立刻引起真皮膠原收縮，見(jiàn)效快，治療后效果持久，真皮膠原繼續(xù)增生，多數(shù)可持續(xù)3 6個(gè)月，甚至達(dá)18 24個(gè)月，可調(diào)控其真皮層受熱的深度；治療后患者無(wú)需休息、不影響工作；(5)操作方便:由于電極種類(lèi)多，且可制成各種形狀，工作面可以任意控制，靈巧精確，在身體任何部位均操作方便。此外，多數(shù)電極可重復(fù)使用，大大降低了成本。富勒烯在射頻或微波照射的情況下可以產(chǎn)生活性氧，活性氧包括單線態(tài)氧、超氧負(fù)離子等。富勒烯的純態(tài)氧發(fā)生的量子產(chǎn)出率(Φ=0.96)顯著高于其他代表性的光敏劑，如亞甲藍(lán)(Φ=0.52)、玫瑰紅(Φ=0.83)、曙紅(Φ=0.57)等，并且預(yù)測(cè)對(duì)人體無(wú)毒性，因此，被寄予較大期望用作光線力學(xué)的療法劑。富勒烯射頻或微波照射下產(chǎn)生活性氧為高度反應(yīng)性的，并且可以表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性，比如裂解細(xì)胞中的DNA，抑制細(xì)胞的有絲分裂以及生長(zhǎng)，還可以抑制細(xì)胞蛋白水解酶的活性。由此推斷，富勒烯可以用于腫瘤的治療。射頻或微波照射除了治療腫瘤外，還用于其他很多疾病的治療。所述的皮膚病包括痤瘡、化膿性汗腺炎、嫩膚等，此外還可用于銀屑病、扁平苔蘚、硬化萎縮性苔蘚、硬皮病、皮膚T淋巴細(xì)胞瘤、斑禿、尋常疣、Darier’ s病以及皮膚癬菌病等皮膚病；所述的腫瘤為器官表面或者內(nèi)部出現(xiàn)的各種實(shí)體瘤，肺癌，鼻咽癌，食道癌，胃癌，肝癌，大腸癌，乳腺癌，卵巢癌，膀胱癌，白血病，胰腺癌，宮頸癌，喉癌，甲狀腺癌，舌癌，腦瘤(顱內(nèi)腫瘤)，小腸腫瘤，膽囊癌，膽管癌，腎癌，前列腺癌，陰莖癌，睪丸腫瘤，子宮內(nèi)膜癌，絨毛膜癌，陰道惡性腫瘤，外陰惡性腫瘤，霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤，皮膚癌，惡性黑色素瘤中的一種，目前將富勒烯及其衍生物在射頻或微波照射下治療皮膚病或腫瘤的應(yīng)用尚未見(jiàn)報(bào)道。。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述情況，為克服現(xiàn)有技術(shù)之缺陷，本發(fā)明之目的就是提供一種富勒烯及其衍生物在射頻或微波照射下作為制備治療皮膚病或腫瘤藥物中的應(yīng)用，可有效解決皮膚病的治療用藥問(wèn)題。本發(fā)明解決的技術(shù)方案是，利用富勒烯及其衍生物在射頻或微波照射下發(fā)熱的機(jī)理，并結(jié)合富勒烯及其衍生物有著極小的毒性，較強(qiáng)的水溶性，生物相容性好，比表面積大，化學(xué)惰性高的特點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)富勒烯在射頻或微波照射下作為制備治療皮膚病藥物上的應(yīng)用，所述的富勒烯為富勒烯C6tl，所述的衍生物為富勒烯-聚乙烯亞胺聚合物、富勒烯-聚乙二醇聚合物、富勒烯-透明質(zhì)酸聚合物等各種衍生物中的一種；射頻或微波頻率為13.56MHz,射頻功率為300-350W，效率為60-70%，照射時(shí)間為15_30min ；
本發(fā)明有效解決了治療皮膚病或腫瘤的用藥問(wèn)題，易操作，效果好，外用、口服或靜脈注射富勒烯及其衍生物后 ，在射頻或微波照射下產(chǎn)生更多的活性氧和熱量，導(dǎo)致膜破壞，細(xì)胞死亡，從而達(dá)到更有效治療皮膚病或腫瘤的目的，是治療皮膚病或腫瘤藥物上的創(chuàng)新。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明在實(shí)施中，是由以下方式實(shí)現(xiàn)的。利用基于富勒烯及其衍生物的射頻發(fā)熱及產(chǎn)生活性氧的性能，在13.56MHz射頻或微波照射下的發(fā)熱性能，由射頻功率為300-350W，效率為60-70%的射頻治療儀，照射時(shí)間15-30min，在射頻或微波照射后，富勒烯及其衍生物溫度升高10_15°C，產(chǎn)生更多的活性氧和熱量，導(dǎo)致膜破壞，細(xì)胞死亡，非常利于達(dá)到更有效治療皮膚病的目的，經(jīng)用活性氧檢測(cè)試劑盒檢測(cè)水溶性富勒烯產(chǎn)生活性氧的性能，測(cè)得活性氧水平明顯增高；
富勒烯及其衍生物作為熱敏劑在治療腫瘤藥物中的應(yīng)用分為體外和體內(nèi)兩部分:
1)將富勒烯及其衍生物溶于水中制成溶液，加入到癌細(xì)胞A中進(jìn)行培養(yǎng)，給藥后3h后用射頻B照射，照射15 30min，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，測(cè)定癌細(xì)胞A的存活率；
2)將制得的富勒烯及其衍生物溶于水中制成溶液，靜脈注射到荷瘤小鼠C體內(nèi)，給藥后3h后用射頻D照射，照射時(shí)間為15 30min，測(cè)量荷瘤小鼠C的腫瘤體積大小。上述步驟I中的癌細(xì)胞(腫瘤)A為:器官表面或者內(nèi)部出現(xiàn)的各種實(shí)體瘤，肺癌，鼻咽癌，食道癌，胃癌，肝癌，大腸癌，乳腺癌，卵巢癌，膀胱癌，白血病，胰腺癌，宮頸癌，喉癌，甲狀腺癌，舌癌，腦瘤(顱內(nèi)腫瘤)，小腸腫瘤，膽囊癌，膽管癌，腎癌，前列腺癌，陰莖癌，睪丸腫瘤，子宮內(nèi)膜癌，絨毛膜癌，陰道惡性腫瘤，外陰惡性腫瘤，霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤，皮膚癌，惡性黑色素瘤中的一種；
上述步驟I中的射頻B為:頻率范圍為300KHC30GHZ的射頻，最好為13.56MHz、功率300W的射頻。上述荷瘤小鼠C的荷瘤為:器官表面或者內(nèi)部出現(xiàn)的各種實(shí)體瘤，肺癌，鼻咽癌，食道癌，胃癌，肝癌，大腸癌，乳腺癌，卵巢癌，膀胱癌，白血病，胰腺癌，宮頸癌，喉癌，甲狀腺癌，舌癌，腦瘤(顱內(nèi)腫瘤)，小腸腫瘤，膽囊癌，膽管癌，腎癌，前列腺癌，陰莖癌，睪丸腫瘤，子宮內(nèi)膜癌，絨毛膜癌，陰道惡性腫瘤，外陰惡性腫瘤，霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤，皮膚癌，惡性黑色素瘤中的一種(同癌細(xì)胞A)。上述射頻D為:頻率范圍為300KHz 30GHz的射頻，最好為13.56MHz、功率300W的射頻。本發(fā)明的富勒烯及其衍生物作為熱敏劑來(lái)進(jìn)行熱敏治療體內(nèi)深度腫瘤時(shí)，13.56MHz射頻能夠深度穿透生物體，可以用于治療生物腫瘤。所述的富勒烯及其衍生物在富勒烯及其衍生物的溶液中，以納米聚集物的形式存在。將富勒烯及其衍生物作為治療皮膚病或腫瘤的藥物，通過(guò)各種不同的方式給入體內(nèi)，在射頻或微波照射下，用于痤瘡、化膿性汗腺炎、嫩膚、銀屑病、扁平苔蘚、硬化萎縮性苔蘚、硬皮病、皮膚T淋巴細(xì)胞瘤、斑禿、尋常疣、Darier’S病以及皮膚癬菌病等皮膚病上。所述的藥物包括化學(xué)藥物，蛋白質(zhì)或基因藥物；用于熱動(dòng)力和藥物結(jié)合抑制腫瘤細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的富勒烯及其衍生物可以制成任意的藥物制劑劑型，比如:注射劑、注射用無(wú)菌粉針、分散劑、貼劑、凝膠劑、植入劑等。本發(fā)明的富勒烯及其衍生物可以加入各種制劑的添加劑，比如:生理鹽水、葡萄糖、緩沖溶液和防腐劑等以便于制備成需要的劑型。給藥方式可以為:靜脈注射、肌肉注射、腫瘤內(nèi)注射和皮下注射、透皮給藥、體內(nèi)植入方式等。本發(fā)明的富勒烯及其衍生物可以更多的分布在病變部位中，與正常組織相比，它可以長(zhǎng)期的高濃度的保留在病變部位中，這樣當(dāng)采用適當(dāng)?shù)氖侄问褂蒙漕l進(jìn)行照射時(shí)能夠在病變部位中產(chǎn)生更多的熱，但也會(huì)分布在正常的組織器官中，為了避免產(chǎn)生的高溫對(duì)正常組織產(chǎn)生損傷，可以通過(guò)一些手段來(lái)加以改善，比如:可以在富勒烯及其衍生物上裝載一些具有靶向性質(zhì)的靶頭，也可以使用抗體等手段介導(dǎo)，可以使用臨床手段比如說(shuō)內(nèi)窺鏡的方式來(lái)直接輸送載藥系統(tǒng)到達(dá)靶組織，聚焦射頻面積等方式。本發(fā)明富勒烯及其衍生物本身有著極小的毒性，較強(qiáng)的水溶性，生物相容性好，比表面積大，化學(xué)惰性高等優(yōu)點(diǎn)。結(jié)合射頻或微波照射可以發(fā)揮出更為優(yōu)秀的治療皮膚病的效果，并經(jīng)實(shí)驗(yàn)得到了充分證明，有關(guān)情況如下:
1、本發(fā)明藥物射頻下用于治療痤瘡
患者共30例，年齡17 31歲， 其中男8例，女22例，均為面部尋常型痤瘡面部皮損以炎癥性紅斑、丘疹、膿皰、結(jié)節(jié)或囊腫為主。按照靳培英的三度四級(jí)分類(lèi)法將痤瘡分為輕、中、重度，I IV級(jí)。每周采用本發(fā)明藥物使用射頻治療儀GP699A，先按默認(rèn)設(shè)置的參數(shù)由最小值開(kāi)始進(jìn)行，再根據(jù)個(gè)人的適應(yīng)程度，逐步調(diào)節(jié)增大能量，每個(gè)部位可反復(fù)循環(huán)照射數(shù)遍，以患者感到溫?zé)岫鵁o(wú)顯著灼痛為度，時(shí)間為20-30min，療程為5次，結(jié)束后對(duì)志愿者皮損的改善和滿意度進(jìn)行評(píng)價(jià)，并記錄不良反應(yīng)。結(jié)果為炎性痤瘡療效表現(xiàn)為炎癥不同程度消退、丘疹膿皰消退或顯著減輕。其中7人痊愈，15人顯效，6人有效，有效率達(dá)93%，受試患者自我評(píng)價(jià)均在“好”或“很好”。試驗(yàn)結(jié)果表明，射頻下對(duì)炎性痤瘡具有較好的治療作用。2、本發(fā)明藥物射頻下用于治療面頸部皮膚皺紋和松弛的療效和安全性。30例皮膚老化志愿者，每2周使用Alum — FAcEs射頻治療儀用本發(fā)明藥物照射面頸部皮膚皺紋和松弛I次，共6次，分別在治療前、治療第4、6次時(shí)(即完成3次、5次治療后)以及治療結(jié)束后I個(gè)月對(duì)志愿者皮損的改善和滿意度進(jìn)行評(píng)價(jià)，并記錄不良反應(yīng)。結(jié)果為:24例志愿者治療3次后總有效率66.7%，5次后總有效率90.5%，停止治療后I個(gè)月，總有效率94.4%。志愿者滿意度評(píng)價(jià):治療3次后為50.0%，5次后為90.5%，停止治療后I個(gè)月為100%。治療中主要不良反應(yīng)為皮膚輕度紫癜。可得出結(jié)論:本發(fā)明藥物在射頻下治療面頸部皮膚皺紋和松弛安全、有效。3、本發(fā)明藥物射頻下治療面部增殖性皮膚病
患者共572例，年齡5 79歲，其中男241例，女331例。使用射頻治療儀用本發(fā)明藥物進(jìn)行手術(shù)治療。結(jié)果為572例中痊愈527例，顯效28例，痊愈率92.13%，總有效率97.03%，獲得了較好的療效。試驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明藥物射頻下切割精確，術(shù)中出血少，術(shù)后色素沉著不明顯，適用于對(duì)精密程度要求較高的面部手術(shù)，值得臨床推廣應(yīng)用。4、本發(fā)明藥物射頻下治 療尖銳濕疣(CA)的臨床療效及其安全性。患者共66例，隨機(jī)分為A、B、C3組，其中A組23例，男12例，女11例；B組22例，男12例，女10例。C組21例，男性11例，女性10例。各組患者在性別、年齡、病程、CA體積及數(shù)量方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)意義，具可比性。A組用本發(fā)明藥物進(jìn)行射頻治療徹底清除疣體，待患處愈合后按每周3次涂布5%咪喹莫特乳膏，連續(xù)12周為I療程；B組單純進(jìn)行射頻治療；C組直接進(jìn)行5%咪喹莫特乳膏，療程同A組。各組患者于治療的1、2周和1、3、6月后進(jìn)行隨診，統(tǒng)計(jì)痊愈率、復(fù)發(fā)率及不良反應(yīng)。結(jié)果為A組痊愈率為82.6%，復(fù)發(fā)率17.4%，不良反應(yīng)率 43.5% ；B 組則分別為 45.5%,54.5%,27.3% ；C 組分別為 61.9%,38.1%、42.9%。3 組痊愈率、復(fù)發(fā)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈0.05)。A組痊愈率最高復(fù)發(fā)率最低，C組次之，B組痊愈最低、復(fù)發(fā)率最高，但A、C組不良反應(yīng)較B組高。試驗(yàn)結(jié)果表明，采用本發(fā)明藥物射頻下治療CA臨床療效好，復(fù)發(fā)率低，值得臨床推廣，但要注意減少咪喹莫特外用時(shí)的不良反應(yīng)。5、本發(fā)明藥物射頻消融治療體表脈管性疾病
患者共70例，其中男32例(45.7%)，女38例(54.3%);就診年齡:最小2歲，最大71歲，平均年齡26歲；血管瘤分類(lèi):血管瘤24例，其中草莓狀血管瘤14例，混合型血管瘤6例，鮮紅斑痣4例，脈管畸形46例，均為靜脈畸形；病灶分布:頭頸部38例，四肢21例，軀干11例。采用本發(fā)明藥物使用XL-皮膚射頻消融美容儀進(jìn)行射頻治療。病灶及周邊部位碘伏消毒，2%利多卡因行皮下局部麻醉，根據(jù)患者病變類(lèi)型、部位、侵犯皮膚的深度和范圍、病變部位血管的形態(tài)等因素，結(jié)合術(shù)者個(gè)人經(jīng)驗(yàn)選擇不同的電極插入深度和角度、消融時(shí)間以及消融功率進(jìn)行治療。結(jié)果為射頻消融治療草莓狀血管瘤、混合型血管瘤、靜脈畸形、鮮紅紅斑痣四脈管性疾病后的有效率分別為78.6%、50%、67.4%,50%,四組療效差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P > 0.05);射頻消融治療不同面積和不同年齡患者體表脈疾病療效間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.05);病變部位、是否曾接受過(guò)其它治療、性別、治療次數(shù)、病程均與療效無(wú)關(guān)(P >
0.05);射頻消融后77.5%的患者臨床癥狀得到明顯改善，22.5%的患者癥狀改善不明顯。試驗(yàn)結(jié)果表明，采用本發(fā)明藥物射頻消融能夠有效地縮小不同類(lèi)型體表脈管性疾病的瘤體；病變面積、患者年齡是射頻消融治療體表脈管疾病療效的主要影響因素；射頻消融對(duì)于體表脈管性疾病臨床癥狀的緩解具有很好的效果；射頻消融治療體表脈疾病安全性高、副作用少。本發(fā)明富勒烯及富勒烯衍生物使用射頻照射富勒烯-聚乙二醇2000對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制活性的測(cè)定:
通過(guò)射頻照射的富勒烯-聚乙二醇2000在體外抗腫瘤活性。將PC3前列腺癌細(xì)胞(由上海細(xì)胞庫(kù)提供)用作待考察的癌細(xì)胞。將PC3細(xì)胞培養(yǎng)在含胎牛血清(FBS) 10%，青鏈霉素混合液1%的RPMI1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)箱條件為37°C、5% CO2，每2 3天傳代一次。收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，96孔板每孔加入200 μ I，鋪板使待測(cè)細(xì)胞調(diào)密度至6 X IO3個(gè)/ L，(邊緣孔用無(wú)菌PBS填充)。置于5% CO2, 37 °C孵育24 h，至細(xì)胞單層鋪滿孔底(96孔平底板)，加入濃度梯度(12.5,25,50,100 μ g/ml)的富勒烯-聚乙二醇2000水溶液，設(shè)置復(fù)孔為4 6個(gè)。射頻照射組放置在13.56MHz射頻功率300W的射頻儀中30min，射頻照射結(jié)束后用鋁箔包裹細(xì)胞板置于CO2培養(yǎng)箱中孵育24h，對(duì)于非射頻照射組而言，則直接用鋁箔包裹細(xì)胞板置于CO2培養(yǎng)箱中孵育24h，終止培養(yǎng)，吸出含藥培養(yǎng)基，每孔用150 μ I PBS洗2遍，加入預(yù)冷的10% TCA 200 yl，4°C放置I h。倒掉固定液，每孔用去離子水洗5遍，甩干，空氣干燥。每孔加入100 μ I的SRB溶液，靜置放置lOmin，未與蛋白結(jié)合的SRB用1%醋酸洗5遍，空氣干燥。結(jié)合的SRB用150 μ I 10 mmol/L非緩沖Tris堿溶解。在515nm處測(cè)定每孔的OD值。存活率的計(jì)算公式:存活率=實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值，其中實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均為扣除空白對(duì)照組后的值。已經(jīng)證實(shí)當(dāng)用射頻照射30min，富勒烯-聚乙二醇2000的加入直接影響了 PC3細(xì)胞的增殖，抑制率約為90%。射頻照射時(shí)，富勒烯-聚乙二醇2000聚合物的體內(nèi)抗腫瘤活性測(cè)定
射頻照射時(shí)，水溶性富勒烯-聚乙二醇2000的體內(nèi)抗腫瘤活性測(cè)定。取小鼠S180腹水瘤細(xì)胞，用注射用生理鹽水以3:1比例稀釋后，每只小鼠于腹腔注射0.3 ml，小鼠喂養(yǎng)7天后，抽取小鼠S180腹水瘤細(xì)胞，計(jì)數(shù)后以注射用生理鹽水稀釋成濃度為2X IO6個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，皮下接種與小鼠右前肢上部。小鼠接種腫瘤7d后，取其中24只腫瘤體積> 100mm3昆明小鼠，隨機(jī)分為4組，每組6只。具體分組如下:(I)對(duì)照組(NS組):生理鹽水；(2)生理鹽水射頻組；(3)富勒烯-聚乙二醇2000組；(4)富勒烯-聚乙二醇2000射頻組。4組均采用靜脈給藥的方式，其中射頻組使用的電磁波頻率為13.56MHz,電壓為300W，給藥3h后射頻照射腫瘤部位，一次照射時(shí)間為30min。每2d給藥一次，每次注射生理鹽水或者2mg/ml的富勒烯溶液100 μ 1，共給藥7次。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中每日觀察小鼠生活狀態(tài)，每2d稱(chēng)其體重并使用游標(biāo)卡尺測(cè)量小鼠肉瘤的長(zhǎng)徑(A)與短徑(B)，并計(jì)算腫瘤體積。結(jié)果表明，當(dāng)給藥富勒烯-聚乙二醇 2000合并射頻照射時(shí)，小鼠的腫瘤體積的增加得到了明顯的抑制。水溶性富勒烯-聚乙二醇2000作為藥物轉(zhuǎn)運(yùn)載體在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。
取水溶性富勒烯-聚乙二醇2000 IOmg和多西紫杉醇(由北京怡和生物科技有限公司提供)20mg，加入超純水2mL，混合均勻后，探頭超聲(工作3s，間隔6s，工作12次，功率為400W)，將探超完成的樣品進(jìn)行離心(4000rpm，15min)除去大顆粒。得到了水溶性富勒烯為載體的抗腫瘤藥物多西紫杉醇給藥系統(tǒng)。通過(guò)40倍(體積比)乙醇提取出給藥系統(tǒng)中包封的多西紫杉醇，紫外分光光度計(jì)測(cè)定作為載體包封的多西紫杉醇的含量，載藥量為2.5mg/mL，實(shí)驗(yàn)表明，水溶性富勒烯-聚乙二醇2000可以吸附抗腫瘤藥物多西紫杉醇，提高了多西紫杉醇在水中的溶解度，可以作為抗腫瘤藥物的載體使用。本發(fā)明水溶性富勒烯-聚乙二醇2000多西紫杉醇給藥系統(tǒng)的粒子大小和表面帶電量的確定。本發(fā)明的水溶性富勒烯-聚乙二醇2000多西紫杉醇給藥系統(tǒng)的粒子大小和表面帶電量的確定，使用Nano-ZS90型激光粒度分析儀進(jìn)行測(cè)定，折射率設(shè)置為1.590，吸收系數(shù)設(shè)置為0.010，溫度設(shè)置為25 °C，測(cè)量模式設(shè)置為自動(dòng)，以Z平均統(tǒng)計(jì)值作為測(cè)定結(jié)果。每一水平縮合體均配制3份，每份測(cè)量一次，取三次測(cè)量值的平均值作為測(cè)量結(jié)果。介電常數(shù)設(shè)置為79，黏度系數(shù)設(shè)置為0.8872，溫度設(shè)置為25 °C，測(cè)量模式設(shè)置為自動(dòng)。每一水平縮合體均配制3份，每份測(cè)量一次，取三次測(cè)量值的平均值作為測(cè)量結(jié)果。本發(fā)明水溶性富勒烯-聚乙二醇2000多西紫杉醇給藥系統(tǒng)的體外抗腫瘤活性，將PC3前列腺癌細(xì)胞(由上海細(xì)胞庫(kù)提供)用作待考察的癌細(xì)胞。將PC3細(xì)胞培養(yǎng)在含胎牛血清(FBS) 10%,青鏈霉素混合液1%的RPMI1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)箱條件為37°C、5% CO2,每2 3天傳代一次。收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，96孔板每孔加入200 μ 1，鋪板使待測(cè)細(xì)胞調(diào)密度至6 X IO3個(gè)/孔，(邊緣孔用無(wú)菌PBS填充)。置于5% CO2, 37 °C孵育24 h，至細(xì)胞單層鋪滿孔底(96孔平底板)，加入濃度梯度(0、0.5、1、2、4、6、8μ g/ml)的水溶性富勒烯-聚乙二醇2000多西紫杉醇，不加入水溶性富勒烯-聚乙二醇2000多西紫杉醇為對(duì)照組，設(shè)置復(fù)孔為4飛個(gè)。射頻組放置在13.56MHz射頻中30min，保持射頻照射過(guò)程中溫度在37 °C，上下極板距離為30cm，細(xì)胞距離上極板為4.5cm。射頻照射結(jié)束后用鋁箔包裹細(xì)胞板置于CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h，對(duì)于非射頻照射組而言，則直接用鋁箔包裹細(xì)胞板置于CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h，終止 培養(yǎng)，吸出含藥培養(yǎng)基，每孔用150 μ I PBS洗2遍，加入預(yù)冷的10% TCA 200 μ 1,4 °C放置I h。倒掉固定液，每孔用去離子水洗5遍，甩干，空氣干燥。每孔加入100 μ I的SRB溶液，靜置放置10 min，未與蛋白結(jié)合的SRB用1%醋酸洗5遍，空氣干燥。結(jié)合的SRB用150 μ I 10 mmol/L非緩沖Tris堿溶解。在515 nm處測(cè)定每孔的OD值。抑制率的計(jì)算公式:抑制率=1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值，其中實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均為扣除空白對(duì)照組后的值。結(jié)果表明，本發(fā)明水溶性富勒烯作為藥物載體時(shí)能裝載藥物進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)部，更好的發(fā)揮出抗腫瘤藥物的療效，而且結(jié)合射頻照射后，能夠更明顯的抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。本發(fā)明的水溶性富勒烯多西紫杉醇給藥系統(tǒng)的體內(nèi)抗腫瘤活性試驗(yàn)。本發(fā)明水溶性富勒烯多西紫杉醇給藥系統(tǒng)的體內(nèi)抗腫瘤活性，取小鼠S180腹水瘤細(xì)胞，用注射用生理鹽水以3:1比例稀釋后，每只小鼠于腹腔注射0.3 ml，小鼠喂養(yǎng)7天后，抽取小鼠S180腹水瘤細(xì)胞，計(jì)數(shù)后以注射用生理鹽水稀釋成濃度為2 X IO6個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，皮下接種與小鼠右前肢上部。小鼠接種腫瘤7 d后，取其中24只腫瘤體積> 100mm3昆明小鼠，隨機(jī)分為4組，每組6只。具體分組如下:(I)對(duì)照組(NS組):生理鹽水；(2)多西紫杉醇注射液組；(3)水溶性富勒烯-聚乙二醇2000多西紫杉醇；(4)水溶性富勒烯-聚乙二醇2000多西紫杉醇射頻組。多西紫杉醇注射液組、水溶性富勒烯-聚乙二醇2000多西紫杉醇和水溶性富勒烯-聚乙二醇2000多西紫杉醇射頻組的多西紫杉醇給藥劑量相等，都為25.125mg/kg。4組均采用靜脈給藥的方式，其中射頻組使用的電磁波頻率為13.56MHz,電壓為300W，給藥3h后射頻照射腫瘤部位，一次照射時(shí)間為30min。每2d給藥一次，共給藥7次。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中每日觀察小鼠生活狀態(tài)，每2d稱(chēng)其體重并使用游標(biāo)卡尺測(cè)量小鼠肉瘤的長(zhǎng)徑(A)與短徑(B)，并計(jì)算腫瘤體積。當(dāng)給藥水溶性富勒烯多西紫杉醇時(shí)，小鼠的腫瘤體積的增加比起多西紫杉醇注射液得到了明顯的抑制。合并射頻照射時(shí)，小鼠的腫瘤體積的增加得到了更加明顯的抑制。在做上述實(shí)驗(yàn)的同時(shí)，還采用抗腫瘤藥物做了類(lèi)似的實(shí)驗(yàn)，均取得了相同和相類(lèi)似的結(jié)果，本發(fā)明分組科學(xué)，方法穩(wěn)定可靠，其他實(shí)驗(yàn)結(jié)果不再一一列舉。本發(fā)明富勒烯及其衍生物可以作為抗腫瘤熱敏治療時(shí)的一種良好的熱敏劑，測(cè)試表明無(wú)論是體外還是體內(nèi)在射頻照射的情況下都可以很好的抑制腫瘤細(xì)胞以及組織的發(fā)生和發(fā)展，而在非射頻照射的情況下富勒烯及其衍生物對(duì)正常細(xì)胞以及組織毒副作用很小。本發(fā)明富勒烯及·其衍生物可以作為一種良好的抗腫瘤藥物的載體，本身有著極小的毒性，較強(qiáng)的水溶性，生物相容性好，比表面積大,化學(xué)惰性高等優(yōu)點(diǎn)。測(cè)試結(jié)果表明，本發(fā)明富勒烯及其衍生物作為抗腫瘤藥物的載體時(shí)，粒徑均勻，結(jié)合射頻照射可以發(fā)揮出更為優(yōu)秀的抗腫瘤活性。上述表明，本發(fā)明富勒烯及其衍生物在射頻或微波照射下作為制備治療皮膚病或腫瘤藥物，預(yù)期可以用于治療皮膚病或腫瘤的一種良好的藥物，是藥物制備上的一大創(chuàng)新。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下突出的有益技術(shù)效果:
本發(fā)明富勒烯及其衍生物可以作為抗腫瘤治療的一種良好的熱敏劑，射頻照射時(shí)產(chǎn)生熱能夠發(fā)揮抗腫瘤活性，可以根據(jù)射頻的聚焦等手段來(lái)選擇性的殺傷腫瘤組織和細(xì)胞。本發(fā)明提供富勒烯及其衍生物的射頻熱療，可有效實(shí)現(xiàn)富勒烯作為熱敏劑和藥物轉(zhuǎn)運(yùn)載體在腫瘤治療中的聯(lián)合應(yīng)用，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)放化療治療腫瘤的不足，本發(fā)明的研制成功具有實(shí)際的臨床意義。本發(fā)明富勒烯及其衍生物射頻或微波照射時(shí)產(chǎn)生熱能夠發(fā)揮抗炎殺菌活性，可以根據(jù)射頻的聚焦等手段來(lái)選擇性的治療皮膚病。本發(fā)明提供富勒烯及其衍生物在射頻或微波照射下產(chǎn)生活性氧，可有效實(shí)現(xiàn)富勒烯及其衍生物對(duì)皮膚病的治療，彌補(bǔ)了其他治療皮膚病藥物上的不足，有實(shí)際的臨床意義。
權(quán)利要求
1.一種富勒烯及其衍生物在射頻或微波照射下作為制備治療皮膚病或腫瘤藥物中的應(yīng)用，所述的富勒烯為富勒烯C6tl，所述的衍生物為富勒烯-聚乙烯亞胺聚合物、富勒烯-聚乙二醇聚合物、富勒烯-透明質(zhì)酸聚合物中的一種；射頻或微波頻率為13.56MHz，射頻功率為300-350W，效率為60-70%，照射時(shí)間為15_30min。
2.權(quán)利要求1所述的富勒烯及其衍生物在射頻或微波照射下作為制備治療皮膚病或腫瘤藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述的富勒烯及其衍生物在富勒烯及其衍生物的溶液中，以納米聚集物的形式存在。
3.權(quán)利要求1所述的富勒烯及其衍生物在射頻或微波照射下作為制備治療皮膚病或腫瘤藥物中的應(yīng)用，其特征在于，用于熱動(dòng)力和藥物結(jié)合抑制腫瘤細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用，所述的藥物為化學(xué)藥物，蛋白質(zhì)或基因藥物。
4.權(quán)利要求1所述的富勒烯及其衍生物在射頻或微波照射下作為制備治療皮膚病或腫瘤藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述的富勒烯及其衍生物作為熱敏劑制成注射劑、注射用無(wú)菌粉針、分散劑、貼劑、凝膠劑、植入劑的一種劑型。
5.權(quán)利要求1所述的富勒烯及其衍生物在射頻或微波照射下作為制備治療皮膚病或腫瘤藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述的水溶性富勒烯及其衍生物加入生理鹽水、葡萄糖、緩沖溶液和防腐劑的一種中， 制備成制備治療皮膚病或抗腫瘤藥物的劑型。
全文摘要
本發(fā)明涉及富勒烯及其衍生物在射頻或微波照射下作為制備治療皮膚病或腫瘤藥物中的應(yīng)用，可有效解決皮膚病的治療用藥問(wèn)題，方法是，利用富勒烯及其衍生物在射頻或微波照射下發(fā)熱的機(jī)理，并結(jié)合富勒烯及其衍生物的特點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)富勒烯在射頻或微波照射下作為制備治療皮膚病藥物上的應(yīng)用，所述的富勒烯為富勒烯C60，衍生物為富勒烯-聚乙烯亞胺聚合物、富勒烯-聚乙二醇聚合物、富勒烯-透明質(zhì)酸聚合物等各種衍生物中的一種；射頻或微波頻率為13.56MHz，射頻功率為300-350W，效率為60-70%，照射時(shí)間為15-30min；本發(fā)明易操作，效果好，外用、口服或靜脈注射富勒烯及其衍生物后，在射頻或微波照射下產(chǎn)生更多的活性氧和熱量，導(dǎo)致膜破壞，細(xì)胞死亡，更有效治療皮膚病或腫瘤。
文檔編號(hào)A61P17/00GK103191427SQ201310138038
公開(kāi)日2013年7月10日 申請(qǐng)日期2013年4月19日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月19日
發(fā)明者張紅嶺, 史進(jìn)進(jìn), 王蕾, 劉艷, 張振中, 高君, 馬柔柔, 劉瑞瑗, 張靜, 余曉媛, 潘晶晶 申請(qǐng)人:鄭州大學(xué)