專利名稱：甲型肝炎滅活疫苗的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種甲型肝炎滅活疫苗，屬于醫學生物制品。
我國是甲型肝炎病毒感染的高流行區，平均每年有24萬人患甲型肝炎，為此，許多研究者致力于甲型肝炎疫苗的研究和生產，力圖從預防的角度杜絕這一病魔的流行，以保障人們的身體健康。就現有技術而言，由于甲型肝炎病毒在組織培養中增殖較為緩慢，且產量偏低，不產生細胞病變(CPE)，尤其是甲肝病毒與細胞成分形成難于分離的聚合物，給制備滅活疫苗帶來很大困難。因此，有必要提供一種甲型肝炎滅活疫苗及其制備方法，以滿足人們預防甲肝病流行的需要。
本發明的目的在于提供一種安全、免疫性好、性質穩定的甲型肝炎滅活疫苗。
本發明的另一目的在于提供一種純度高，產量高，工藝簡單并能充分分離和純化甲型肝炎病毒的疫苗制備方法，以適應于規模化生產甲型肝炎滅活疫苗。
本發明提供的甲型肝炎滅活疫苗由下列成分組成成分 含量HAV抗原640 EU/ml(成人劑型)或者 320 EU/ml(少兒劑型)氫氧化鋁 0.8-1.4mg2-苯氧基乙醇 4.0-6.0mg吐溫-200.04-0.06mg甘氨酸 3.0-4.0mg氯化鈉 8.0mg氯化鉀 0.23mg磷酸氫二鈉 1.15mg磷酸二氫鉀 0.2mg。
本發明提供的甲型肝炎滅活疫苗由下列工藝方法制得1、將經過人胚肺二倍體細胞培養收獲的呂8快株甲型肝炎病毒，棄上清，用胰酶消化收獲，凍融、超聲破碎，加入終濃度為11-15×103u/L的核酸酶及2mM MgCl2，室溫消化9-18小時；2、用氯仿抽提5次，抽提緩沖液為0.01M磷酸緩沖液，其pH7.5，再加入終濃度為8-10％的聚乙二醇(MW6000)以及0.45MNaCl，沉淀過夜，10000r/min離心1小時；3、離心沉淀用1/10體積的90mM NaCl和4.7mM磷酸緩沖鹽水懸浮，pH7.0-7.2；4、將DEAE Sepharose FF凝膠裝入層析柱中，用過程3的緩沖鹽水平衡后，將粗制的甲型肝炎病毒液加于凝膠上面，待病毒液全部進入凝膠后，再用90mM NaCl/4.7mM磷酸緩沖鹽水(pH7.0-7.2)和120mM NaCl/6.2mM磷酸緩沖鹽水(pH7.4-7.6，其中含1mMEDTA)進行分段洗脫；5、將層析病毒液脫鹽、除菌，用1∶4000的甲醛37℃滅活12天，與氫氧化鋁吸附，分裝得甲肝滅活疫苗。
所述1過程中消化所用的溶液還可為終濃度為30-50×103u/L的核酸酶及2mM MgCl2，溫度為4-8℃，時間為9-18小時。
所述過程4的層析條件是室溫。
本發明與現有技術相比具有下列優點和效果先采用胰酶消化收毒，可縮小病毒體積，為儲存及下一步工序提供一個容易控制的體積；再通過核酸酶消化，將細胞中的核酸消化成小分子，有效避免了核酸-甲型肝炎病毒聚合物的形成，減少病毒的丟失，提高病毒的收獲率；消化后用氯仿提取，基本去除了細胞雜蛋白；DEAE Sepharose FF處理量大，附載系數高，一步縮小樣品體積大，去除雜蛋白能力強，適應于規模化生產，且生產成本低，工藝簡單、合理，每步驟之間都形成了有效的連環，有效釋放病毒和去除細胞雜蛋白，使病毒純度大于95％，本發明適應于其它甲型肝炎病毒株的純化。
本發明提供的甲肝滅活疫苗在2-8℃保存3年性質穩定，其異常毒性實驗、無菌實驗、pH等檢定合格，小白鼠效力實驗ED50基本不變。成人和少兒兩種劑型的滅活疫苗，經中國預防醫學科學院病毒學研究所負責，廣西壯族自治區衛生防疫站參加的臨床觀察，其結果如下1、材料和方法1.1、疫苗1.1.1、實驗疫苗批號為201219，分別標有成人和兒童用字樣，成人劑量1280EU/1.0ml，兒童劑量640EU/1.0ml。
1.1.2、對照疫苗由比利時史克必成公司生產，成人用批號VHA658A4，含1440EU/1.0ml，兒童用批號VHA627A2，含720EU/1.0ml。
1.1.3、注射程序均為0、6個月，注射部位為上臂三角肌內。
1.2、試劑1.2.1、進口試劑美國Abbott EIA，批號80644M200。血清加樣40μl/孔，用于抗-HAV定性測定。
1.2.2、國產試劑抗HAV EIA，本發明之單位生產，批號20011101，使用前經WHO甲型肝炎免疫球蛋白參考品(含100IU/ml)標化。用于免后血清抗HAV的定性和定量測定。檢測時血清加樣量為20μl/孔，試劑的靈敏度為120mIU/ml，用于定性和定量測定。
1.3、甲型肝炎易感者的篩選用國產抗HAV EIA診斷試劑盒檢測，凡抗HAV陰性，SGPT(用改良賴氏法小于40U)為指標正常，無肝炎病史、癥狀和體征者入選。其中少兒組篩選274人，成人組篩選337人。初篩合格的兒童組易感者，隨機分為三組，(性別和年齡的組成見表2、3)接種兒童疫苗，初篩合格的成人組易感者，隨機分為三組，(性別和年齡的組成見表2、4)接種成人疫苗。
1.4、疫苗分組(見表1)1.5、體溫測量為腋下法，體溫計均事先標化。
1.6、接種后疫苗副反應的觀察對所有接種疫苗者于接種后4、24、48、72小時進行局部及全身副反應觀察，記錄體溫及其它有關臨床反應，其判定標準按衛生部《生物制品接種手冊》和《預防接種的反應和處理》要求進行。
1.7、免后采血進行甲型肝炎抗體檢定接種后1、6、7月采靜脈3.0ml進行SGPT測定后，進行甲型肝炎抗體的定性和定量測定。甲型肝炎抗體先用進口試劑盒定性測定，再用國產試劑進行抗-HAV水平的定量測定。其測定方法是用WHO提供的甲型肝炎免疫球蛋白的參考品(含100IU/ml)倍比稀釋后，用國產試劑和進口試劑測定，以確定試劑的靈敏度。國產試劑的靈敏度為120mIU/ml，進口試劑的靈敏度為38mIU/ml。抗體的定量測定是將待測樣品倍比稀釋后與同樣稀釋后的WHO甲型肝炎免疫球蛋白的OD值帶入回歸方程，用SAS System程序進行統計學處理，得出樣品中甲型肝炎抗體的含量。試驗表明，用國產試劑測定的抗-HAV水平與進口試劑的測定結果基本一致。
2、結果2.1、局部及全身反應觀察初免和加強免疫后4、24、48、72小時分別記錄局部反應和體溫變化及有無頭痛、厭食、疲勞和胃腸道不適等癥狀。初免后兒童組未見發熱及全身反應。全量成人組9人有輕度發熱反應(6.87％)，半量組只有1人有輕度發熱反應。第二針加強免疫后，成人組及少兒組只有個別有發熱反應。除了發熱外未見其它全身反應(見表6、7)。初免及加強免疫除注射局部有較小紅暈反應外，未見其它局部過敏反應。所有疫苗接種者血清SGPT無異常(見表5)。結果證明疫苗的安全性良好。
2.2、疫苗免疫后抗體應答易感者一針免后1、6和加強免后1月的血清，進行抗-HAV檢測。免疫后血清樣品抗體定性和定量的測定結果見表8、9和10。
3、結論本發明單位-中國醫學科學院醫學生物學研究所研制生產的甲型肝炎滅活疫苗接種成人和兒童后，未見有臨床意義的不良反應。血清學試驗注射一針后，抗HAV陽轉率≥91.2％，抗體水平在756.6-3630.8mIU/ml，半年加強一針后，抗HAV均100％陽轉，抗體水平有2-4倍增長，因此，本疫苗具有良好的安全性和免疫效果。
實施例1將經過人胚肺二倍體細胞培養收獲的呂8快株甲型肝炎病毒，棄上清，用胰酶消化收獲，凍融、超聲破碎，加入終濃度為15×103u/L的核酸酶和2mM MgCl2，室溫消化9小時；用二倍體積的氯仿抽提5次，抽提緩沖液為0.01M磷酸緩沖液，pH7.5，再加入終濃度為8％PEG和0.45M NaCl沉淀過夜，10000r/min離心1小時；離心沉淀用1/10體積的90mM NaCl/4.7mM磷酸緩沖鹽水懸浮，pH7.2，制成粗制甲型肝炎病毒；將DEAE Sepharose FF凝膠裝入層析柱中，用90mM NaCl/4.7mM磷酸緩沖鹽水平衡，pH7.2，層析柱平衡后，將粗制的甲型肝炎病毒液加于凝膠上面，待病毒液全部進入凝膠后，再用90mM NaCl/4.7mM磷酸緩沖鹽水(pH7.2)和120mMNaCl/6.2mM磷酸緩沖鹽水(pH7.2，含1mMEDTA)進行分段洗脫，用214nm紫外監測洗脫液的吸光值，洗脫的第二峰為目的峰，將有活性的峰進行收集、合并；將層析樣品脫鹽、除菌，用1∶4000的甲醛37℃滅活12天，配制成下列成分的甲肝滅活疫苗(成人制劑)HAV抗原≥640EU/ml氫氧化鋁 1.4mg2-苯氧基乙醇 6.0mg吐溫-200.06mg甘氨酸 4.0mg氯化鈉 8.0mg氯化鉀 0.23mg磷酸氫二鈉 1.15mg磷酸二氫鉀 0.2mg。
實施例2將經過人胚肺二倍體細胞培養收獲的呂8快株甲型肝炎病毒，棄上清，用胰酶消化收獲，凍融、超聲破碎，加入終濃度為40×103u/L的核酸酶以及2mM的MgCl2，4℃消化18小時；用二倍體積的氯仿抽提5次，抽提緩沖液為120mM NaCl/6.2mM磷酸緩沖液，其pH7.5，再用終濃度為8％PEG和0.45M NaCl沉淀過夜，10000r/min離心1小時；離心沉淀用90mMNaCl/4.7mM磷酸緩沖鹽水懸浮，pH7.0，制成粗制甲型肝炎病毒；將DEAESepharose FF凝膠裝入層析柱中，用90mM NaCl/4.7mM磷酸緩沖鹽水平衡，pH7.0，層析柱平衡后，將粗制的甲型肝炎病毒液加于凝膠上面，待全部進入凝膠后，再用90mM NaCl/4.7mM磷酸緩沖鹽水(pH7.0)和120mMNaCl/6.2mM磷酸緩沖鹽水(pH7.4，含1mMEDTA)進行分段洗脫，用紫外監測洗脫液的吸光值，將有活性的峰進行收集、合并；將層析樣品脫鹽、除菌，用1∶4000的甲醛37℃滅活12天，配制成下列成分的甲肝滅活疫苗(兒童制劑)HAV抗原320EU/ml氫氧化鋁 0.8mg2-苯氧基乙醇 0.8mg吐溫-200.04mg甘氨酸 3.0mg氯化鈉 8.0mg氯化鉀 0.23mg磷酸氫二鈉 1.15mg磷酸二氫鉀 0.2mg。
表1甲型肝炎滅活疫苗臨床觀察分組分 組 抗原含量 接種人數接種程序(月) 采血日期(月)全量少兒組640ELU/1.0ml 107 0、6 1、6、7半量少兒組320ELU/0.5ml 98 0、6 1、6、7全量成人組1280ELU/1.0ml 131 0、6 1、6、7半量成人組640ELU/0.5ml 131 0、6 1、6、7少兒對照組720ELU/0.5ml 69 0、6 1、6、7成人對照組1440ELU/1.0ml 75 0、6 1、6、7表2疫苗接種者的性別組成疫苗分組 男女性別比全量少兒組70∶37(1∶0.53)半量少兒組53∶45(1∶0.85)全量成人組75∶56(1∶0.75)半量成人組81∶50(1∶0.62)少兒對照組35∶34(1∶0.97)成人對照組49∶26(1∶0.53)合計 363∶248(1∶0.68)
表3 少兒組疫苗接種者的年齡分布疫苗組年齡組(歲)全量少兒組半量少兒組少兒對照組N＝107 N＝98N＝695 46 3 17 107 4 308 369 6 5110 1511 30 23 112 13 3 713 21平均 9.7 8.9 9.2表4 成人組疫苗接種者的年齡分布疫苗組年齡組(歲)全量成人組半量成人組成人對照組N＝131N＝131 N＝7515 2 716 3617 617 5456 3518 3535 3219 3 13 220 1 3平均 17.2 17.3 17.4表5 接種及血清標本采集數組別 免前(接種) 免后一月免后六月免后七月全量少兒組107 97 10599半量少兒組107 91 78 103全量成人組131 120119119半量成人組131 12870 111少兒對照組6956 46 65成人對照組7572 50 71
表6 甲型肝炎滅活疫苗初次免疫后體溫觀察≤37℃ 37.1℃～37.5℃ 37.6℃～40℃分組人數24 48 72 24 48 7224 48 72全量少兒組 107 107 107 107000 000半量少兒組 98 98 98 98 000 000全量成人組 131 122 123 126985 000半量成人組 131 130 130 130111 000少兒對照組 69 69 69 69 000 000成人對照組 75 74 74 74 111 000表7甲型肝炎滅活疫苗加強免疫后體溫觀察≤37℃ 37.1℃～37.5℃ 37.6℃～40℃分組人數24 48 72 244872 24 48 72全量少兒組107 106 107 10611 1000半量少兒組9897 97 9711 1000全量成人組131 130 130 13111 0000半量成人組131 131 131 13100 0000少兒對照組6969 69 6900 0000成人對照組7575 75 7500 0000表8甲型肝炎滅活疫苗免疫后抗體陽轉率抗體陽轉率％(月)分組1 6 794.8 99.0 100.0全量少兒組(92/97) (104/105) (99/99)91.2 98.7 100.0半量少兒組(83/91) (77/78) (103/103)96.7 100.0 100.0全量成人組(116/120) (119/119) (119/119)92.2 100.0 100.0半量成人組(118/128) (70/70 ) (111/111)82.1 95.6 100.0少兒對照組(46/56) (44/46) (65/65)90.3 100.0 100.0成人對照組(65/72) (50/50) (71/71)
表9兒童組甲型肝炎滅活疫苗免疫后的抗體水平免后 測定 抗體水平mIU/ml時間 人數 ＜200 200～1000 ＞1000 幾何平均值(GMT) 95％可信限全量少兒組一月281 19 8 758.6446.7～1288.2六月28 7 212951.2 1737.8～5011.9七月28 1 2710471.2 7762.5～14125.4半量少兒組一月28 12 171778.2 1096.5～2884.0六月28 9 192344.2 1412.5～3890.5七月28 2 264786.3 3162.3～7244.4少兒對照組一月281012 6 457.1275.4～758.6六月286 17 5 478.6323.6～707.9七月28 4 243090.3 1995.3～4786.3表10 成人組甲型肝炎滅活疫苗免疫后的抗體水平免后 測定 抗體水平mIU/ml時間 人數＜200 200～1000 ＞1000 幾何平均值(GMT) 95％可信限全量成人組一月2816 21 3630.8 2089.3～6309.6六月28 5 23 2455.7 1548.8～3890.5七月28 1 27 12302.7 8079.6～17378.0半量成人組一月2841212 977.2 537.0～1778.3六月28 6 22 2344.2 1584.9～3467.4七月28 1 27 7762.5 5495.4～10964.8成人對照組一 2821412 1380.4 446.7～1288.2六月282233 501.2 331.1～758.6七月28 3 25 3388.4 2398.8～4786.權利要求
1.一種甲型肝炎滅活疫苗，其特征在于它由下列成分組成HAV抗原 640 EU/ml(成人劑型)或者 320 EU/ml(少兒劑型)氫氧化鋁 0.8-1.4mg2-苯氧基乙醇 4.0-6.0mg吐溫-20 0.04-0.06mg甘氨酸 3.0-4.0mg氯化鈉 8.0mg氯化鉀 0.23mg磷酸氫二鈉 1.15mg磷酸二氫鉀 0.2mg。
2.一種制備權利1所述甲肝滅活疫苗的方法，其特征在于通過下列工藝步驟制得A、將經過人胚肺二倍體細胞培養收獲的呂8快株甲型肝炎病毒，棄上清，用胰酶消化收獲，凍融、超聲破碎，加入終濃度為11-15×103u/L的核酸酶及2mM MgCl2，室溫消化9-18小時；B、氯仿抽提5次，抽提緩沖液為0.01M磷酸緩沖液，其pH7.5，再加入終濃度為8-10％的聚乙二醇(MW6000)以及0.45MNaCl，沉淀過夜，10000r/min離心1小時；C、離心沉淀用1/10體積的90mM NaCl和4.7mM磷酸緩沖鹽水懸浮，pH7.0-7.2；D、將DEAE Sepharose FF凝膠裝入層析柱中，用過程3的緩沖鹽水平衡后，將粗制的甲型肝炎病毒液加于凝膠上面，待病毒液全部進入凝膠后，再用90mM NaCl/4.7mM磷酸緩沖鹽水(pH7.0-7.2)和120mM NaCl/6.2mM磷酸緩沖鹽水(pH7.4-7.6，其中含1mM EDTA)進行分段洗脫；E、將層析病毒液脫鹽、除菌，用1∶4000的甲醛37℃滅活12天，分裝得甲肝滅活疫苗。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于所述1步驟中消化所用的溶液還可為終濃度30-50×103u/L的核酸酶及2mM MgCl2，溫度為4-8℃，時間為9-18小時。
4.根據權利要求2所述的方法，其特征在于所述4步驟的層析條件是室溫。
全文摘要
本發明提供一種甲型肝炎滅活疫苗及其制備方法，將經過培養傳代的甲肝病毒—呂8快株，先用胰酶消化收毒，縮小病毒體積，為儲存及下一步工序提供一個容易控制的體積；再通過核酸酶消化，將細胞中的核酸消化成小分子，有效避免了核酸－甲型肝炎病毒聚合物的形成，減少病毒的丟失，提高病毒的收獲率；消化后用氯仿提取，基本去除了細胞雜蛋白；DEAE Sepharose FF處理量大，附載系數高，一步縮小樣品體積大，去除雜蛋白能力強，適應于規模化生產，且生產成本低，工藝簡單、合理，每步驟之間都形成了有效的連環，有效釋放病毒和去除細胞雜蛋白，使病毒純度大于95％，從而制得安全、免疫性好、性質穩定的甲型肝炎滅活疫苗。
文檔編號A61P31/00GK1490050SQ0213392
公開日2004年4月21日 申請日期2002年10月17日 優先權日2002年10月17日
發明者陳統球, 褚嘉祐, 侯宗柳, 劉建生, 邵聰文, 陽選祥 申請人:中國醫學科學院醫學生物學研究所