專利名稱：一種提高原核表達豬干擾素抗病毒活性的方法
技術領域：
本發明涉及一種提高原核表達豬干擾素抗病毒活性的方法，具體涉及提高原核表達豬IFN-α及IFN-γ抗病毒活性的方法，屬于生物技術領域。
背景技術：
我國是一個養豬大國，豬的各類疾病，尤其是病毒性疾病嚴重危害了養豬業的發展。為此，研制出高效低成本的抗病毒和免疫增強藥物是非常重要的應對措施。干擾素是動物機體在誘導因子的作用下分泌的具有免疫調節功能、廣譜抗病毒、抗腫瘤等多種生物活性的分泌性蛋白質，是機體防御系統的重要組成部分，其抗病毒、抗腫瘤和抗寄生蟲的效果已被廣泛研究并得到肯定。豬干擾素(Interferon，IFN)具有廣譜的抗病毒、抗腫瘤及免疫調節作用，成為抗病毒制劑研究的重點。已知豬干擾素有α、β和Y三種，干擾素α屬于I型，具有廣譜的抗病毒作用，干擾素Y屬于II型，除具有抗病毒作用外，還具有較強的免疫調節功能。近年來，豬的干擾素受到廣泛重視，出現了許多具有抗病毒活性的基因工程重組豬IFN-α和IFN-Y。但在實際應用中，往往只是單個應用某一型干擾素。而在機體內，I 型的α-干擾素主要表現為抑制病毒復制作用，而II型的Y-干擾素主要的免疫調節活性遠遠高于α和β干擾素，I型和II型協同作用，具有較大的免疫預防和治療功能。因此， 在實際應用中，如果模擬天然狀態，將兩種類型的干擾素進行聯合抗病毒應用，將為臨床應用提供更加有效抗病毒干擾素應用方法，更好地發揮其抗病毒作用。

發明內容
本發明的目的是針對現有技術的不足，利用ΡΕΤ-30原核表達載體，構建了豬 IFN-α及IFN-γ基因的原核重組表達質粒；將具有免疫原性的兩種重組蛋白豬IFN-α及豬IFN-Y按一定比例作為抗病毒制劑，對豬干擾素在Η(15細胞上抑制星狀病毒復制的活性進行檢測，并確定了最佳抗病毒比例。為實現上述目地，本發明采用以下技術方案本發明涉及一種提高原核表達豬干擾素抗病毒活性的方法，包括提取豬白細胞 DNA和豬脾臟RNA，構建重組表達質粒，轉化大腸桿菌，誘導表達豬IFN- α和IFN- γ。具體包括如下步驟1.構建豬IFN-α及IFN-γ基因的原核重組表達質粒提取豬白細胞DNA、豬脾臟RNA，特異性引物擴增豬IFN-α、IFN-Y基因，將 IFN-α和IFN-γ基因分別插入原核表達載體ρΕΤ_30構建重組表達質粒pET-30_IFN-α和 pET-30-IFN- γ，轉化大腸桿菌BL21，在IPTG誘導下表達豬IFN- α及IFN- γ，SDS-PAGE分析重組表達蛋白。2.重組質粒的誘導表達將酶切鑒定正確及測序結果正確的重組表達質粒菌液取100 μ 1加入到5ml卡那霉素抗性LB培養液中搖菌過夜，之后按1 100的比例接入200ml含卡那霉素的LB培養液中37°C、250r/min擴大培養2.證，加入IPTG (終濃度為lmmol/L)誘導表達，分別在誘導后0、2、4、5、6、8、10小時取Iml菌液12000rpm離心2min，棄上清，干燥后懸于100 μ 1 2X 上樣緩沖液中，100°C煮沸5分鐘后進行SDS-PAGE。3.包涵體的提取和重組蛋白的純化將IL菌液加入IPTG誘導表達5h后，于4°C以5000g離心15min，吸棄上清，按 1 20 (w/v)用菌體裂解液重懸菌體沉淀，超聲破碎后，4°C、12000g離心20min，收集沉淀。 按1 20(W/V)依次用包涵體洗滌液洗滌包涵體；8000g離心20min，沉淀為包涵體。按 1 20 (W/V)的比例用7M鹽酸胍變性液溶解包涵體，16000g離心15min，收集上清。采用含低濃度鹽酸胍的谷胱甘肽復性液對變性蛋白進行稀釋復性，即在磁力攪拌下，將變性蛋白以20μ l/20sec的速度稀釋于14倍體積的復性液中，置于4°C 12h ；4°C、12000g離心15min， 收集上清；將Ni2+親和樹脂層析柱先用0.02mol/L PBS (pH 7. 8)緩沖液平衡，再用變性緩沖液平衡；將制備好的復性蛋白過M2+親和樹脂層析柱，然后用平衡液和洗滌液依次清洗柱，最后依次用10mmOl/L、50mmOl/L、100mmOl/L、150mmOl/L的咪唑洗脫液洗脫目的蛋白。 緩沖液按照分子克隆實驗指南中的方法進行配制。純化產物進行12% SDS-PAGE，測定純化效率。4.重組蛋白含量和病毒毒價(TCID50)測定用紫外分光光度計分別測定純化后的豬IFN- α和IFN- γ在波長260和280處的 OD值，按照公式計算純化后的樣品的蛋白質質量濃度；計算公式為蛋白質質量濃度(mg/ mL) = 1. 45X0D280-0. 74X0D260 ；在96孔細胞培養板上用含10%胎牛血清的DMEM培養液培養H(15細胞長成單層，吸棄培養液，分別接種用PBS(0. OlM pH 7. 4) 10倍遞次稀釋的星狀病毒，每個稀釋度重復8孔，同時以PBS(0.01M pH 7.4)做陰性對照，37°C，5%的C02培養Ih后，分別加入 0. Iml含10%胎牛血清的DMEM培養液繼續培養，逐日觀察細胞病變(CPE)，連續3d，然后按Reed-Muench法計算病毒的TCID50。5.單一重組蛋白抗病毒活性檢測將純化并已測定濃度的豬IFN- α和IFN- γ分別10倍稀釋，再分別進行2倍遞次稀釋，按0. Iml/孔的量加入兩塊Η(15細胞長成單層的96孔細胞培養板上，37°C，5%的C02 誘導培養24h后，吸棄培養液，分別用100 TCID50的星狀病毒攻毒，同時設干擾素不加病毒的對照和病毒不加干擾素的對照，繼續培養并觀察CPE，連續3d，參照病毒毒價測定法，按 Reed-Muench法分別計算豬IFN- α和IFN- γ在Η(15細胞上抑制星狀病毒復制的活性。6.重組蛋白的聯合抗病毒活性檢測將純化的豬IFN-α和IFN-γ蛋白分別稀釋為已確定的該重組蛋白抑制星狀病毒復制的最佳濃度；將稀釋好的豬IFN-α和IFN-γ蛋白按照不同比例1 1，5 1,52 1， 53 1,54 1,55 1,56 1配比混勻，接種Η(15細胞長成單層的96孔細胞培養板上， 每個配比度重復12孔，37°C，5%的C02誘導培養Mh ；吸棄培養液，分別用100 TCID50的星狀病毒攻毒，同時設干擾素不加病毒的對照和病毒不加干擾素的對照，37°C，5%的C02繼續培養。逐日觀察CPE，連續3d，參照病毒毒價測定法，按Reed-Muench法計算豬IFN- α和IFN-Y在不同比例時抑制生長在H(15細胞上的星狀病毒復制的活性；重組豬IFN-α蛋白和IFN-γ蛋白在53 1的比例時，抑制星狀病毒復制的活性最好。本發明還涉及一種根據上述方法制備得到的豬IFN-α和IFN-γ，當IFN-α和 IFN-Y的質量比為53 1時抗星狀病毒的活性最佳。本發明方法的優點在于1、成功構建重組表達質粒pET-30-IFN- α和pET-30-IFN- γ2、確定了豬IFN- α和IFN- γ在Η(15細胞上抑制星狀病毒復制的活性。3、計算豬IFN- α和IFN- γ在不同比例時抑制生長在Η(15細胞上的星狀病毒復制的活性，并確定了達到最佳抑制病毒效果時兩種干擾素的比例。


圖 1 為 IFN- α 和 IFN- γ 的 PCR 擴增結果；M 為 DL2000Marker ；1 為 IFN- α 擴增結果；2為IFN-γ擴增結果。圖2為重組質粒雙酶切鑒定結果；Ml為DL2000Marker ； 1為pET-30-IFN- α雙酶切結果；2、3為pET-30-IFN- Y雙酶切結果；4為ρΕΤ_30空質粒雙酶切結果；Μ2為 DL15000Markero圖3為重組質粒的誘導表達；M為蛋白Marker ； 1-7為pET-30-IFN-y/BL21的 SDS-PAGE 結果；a-g 為 pET-30-IFN- α /BL21 的 SDS-PAGE 結果；8、h 為 pET30a/BL21 用 IPTG 誘導IOh的表達結果。圖 4 為重組目的蛋白 pET-30-IFN- α /BL21 和 pET_30_IFN_ y /BL21 純化后的 SDS-PAGE ；M為預染蛋白Marker ； 1-4為pET-30-IFN- y /BL21純化過程中連續的收集目的蛋白；6-9為pET-30-IFN- α /BL21純化過程中連續的收集目的蛋白。
具體實施例方式實施例1 1.構建豬IFN-α及IFN-γ基因的原核重組表達質粒提取豬白細胞DNA、豬脾臟RNA，特異性引物擴增豬IFN-α、IFN-γ基因，結果如圖1所示。將IFN-α和IFN-Y基因分別插入原核表達載體ρΕΤ_30，構建重組表達質粒 pET-30-IFN- α和pET-30_IFN-γ，轉化大腸桿菌BL21，在IPTG誘導下表達豬IFN-α及 IFN- γ，SDS-PAGE分析重組表達蛋白。結果如圖2所示。2.重組質粒的誘導表達將測序結果正確的重組表達質粒菌液取100 μ 1加入到5ml卡那霉素抗性LB培養液中搖菌過夜，之后按1 100的比例接入200ml含卡那霉素的LB培養液中37°C、250r/min 擴大培養2. 5h，加入IPTG (終濃度為lmmol/L)誘導表達，分別在誘導后0、2、4、5、6、8、10小時取11111菌液12000印111離心&1^1，棄上清，干燥后懸于10(^1 2X上樣緩沖液中，100°C煮沸5分鐘后進行SDS-PAGE，結果如圖3所示。在各時間的表達重組質粒pET-30-IFN- α經誘導后在21. 3kD處出現明顯條帶，重組質粒pET-30-IFN- γ經誘導后在19. 4kD處出現明顯條帶，與預測的結果一致。3.包涵體的提取和重組蛋白的純化將IL菌液加入IPTG誘導表達5h后，于4°C以5000g離心15min，吸棄上清，按1 20(w/v用菌體裂解液重懸菌體沉淀，超聲破碎后，4°C、12000g離心20min，收集沉淀。 按1 20 (W/V)依次用包涵體洗滌液洗滌包涵體。8000g離心20min，沉淀為包涵體。按 1 20 (W/V的比例用7M鹽酸胍變性液溶解包涵體，16000g離心15min，收集上清。采用含低濃度鹽酸胍的谷胱甘肽復性液對變性蛋白進行稀釋復性，即在磁力攪拌下，將變性蛋白以 20μ l/20sec的速度稀釋于14倍體積的復性液中，置于4°C 12h。4°C、12000g離心15min， 收集上清。將Ni2+親和樹脂層析柱先用0. 02mol/L PBS (pH 7. 8)緩沖液平衡，再用變性緩沖液平衡。將制備好的復性蛋白過M2+親和樹脂層析柱，然后用平衡液和洗滌液依次清洗柱，最后依次用10mmOl/L、50mmOl/L、100mmOl/L、150mmOl/L的咪唑洗脫液洗脫目的蛋白。 緩沖液按照分子克隆實驗指南中的方法進行配制。純化產物進行12% SDS-PAGE，電泳結果見圖4。4.重組蛋白含量和病毒毒價(TCID50)測定用紫外分光光度計分別測定純化后的豬IFN- α和IFN- γ在波長260和280處的 OD值，按照公式計算純化后的樣品的蛋白質質量濃度。計算公式為蛋白質質量濃度(mg/ mL) = 1. 45X0D280-0. 74 XO擬60。計算結果如表1所示。表1 重組蛋白的含量計算結果Table 1 Content of the Purified protein pET-30-IFN-α /BL21and pET-30 -IFN-y/BL2權利要求
1.一種提高原核表達豬干擾素抗病毒活性的方法，其特征在于包括提取豬白細胞DNA 和豬脾臟RNA，構建重組表達質粒，轉化大腸桿菌，誘導表達豬IFN- α和IFN- γ。
2.一種根據權利要求1所述的方法制備得到的豬IFN-α和IFN-Y，其特征在于所述豬IFN-α和IFN-γ的質量比為53 1時抗星狀病毒的活性最佳。
全文摘要
本發明公開了一種提高原核表達豬干擾素抗病毒活性的方法，包括提取豬白細胞DNA和豬脾臟RNA，構建重組表達質粒，轉化大腸桿菌，誘導表達豬IFN-α和IFN-γ；重組豬IFN-α和IFN-γ在質量比為53∶1時，抑制星狀病毒復制的活性最好；本發明方案提供了一種表達量高、純度的好豬干擾素生產制備方法及提高干擾素抗病毒活性使用方法，為新型基因工程抗病毒制劑的開發以及用于豬的傳染性疾病的預防和治療奠定了基礎。
文檔編號A61P31/14GK102329813SQ20111023788
公開日2012年1月25日 申請日期2011年8月18日 優先權日2011年8月18日
發明者俞向前, 葉承榮, 朱建國, 林 源, 趙偉鴿 申請人:上海交通大學, 上海市浦東新區動物疫病預防控制中心