專利名稱：具有神經保護作用的肽及其制備方法、藥物組合物和用途的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物醫學領域，具體而言，本發明涉及一種具有神經保護作用的肽、其制備方法、含有這種肽的藥物組合物及所述肽的制藥用途。
背景技術：
MLK3(混合性譜系激酶，Mixed lineage kinase 3)是MAPKKK(促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶)家族的MLKs亞家族成員，它通過磷酸化作用激活MAPK (促分裂原活化蛋白激酶)通路的絲/蘇氨酸蛋白激酶，是JNK3 (c-Jun N末端激酶家族成員)上游重要激酶(Gallo KA 等人，Nature reviews, 2002 年 9 月，3 (9):663-72 ;Ip YT 等人,Curr Opin CellBiol, 1998,10:205-219)。MLK3 由 SH3 (Src homology 3)結構域、激酶結構域、亮氨酸拉鏈結構域、Cd4c2/Rac相互作用的結構域組成，可以通過277位蘇氨酸和281位絲氨酸發生自身磷酸化，又可通過其自身SH3結構域的連接發揮自身抑制功能，MLK3的自身磷酸化和它的激活有著密切的關系(Hua Z 等人，J Biol Chem，2001，276:45598-45603)。研究發現，阻斷MLK3-MKK7-JNKS信號通路對腦缺血、β -淀粉樣肽(Α β )誘導的神經元損傷有顯著的保護作用(Pan J等人，Neuroscience2005 ;131(1):147-59)。以上結果提示，MLK3信號通路參與中樞神經系統疾病，它和許多促凋亡和抗凋亡因子相互作用并最終決定細胞的生與死，這種平衡的失常將會導致各種疾病的發生。因此，MLK3是中樞神經系統疾病新的治療靶點。目前受體酪氨酸激酶TrkA(酪氨酸激酶)抑制劑K252a雖然可抑制MLK3，以抑制細胞的凋亡，促進細胞的生長發育(Kaneko M等人，J Med Chem, 1997,40:1863-1869)，但K252a并不是特異性的MLK3抑制劑。CEP1347和CEPl 1004雖然是MLK3抑制劑，但它抑制病理狀態下過度活化的MLK3的同時也抑制了 MLK3的生理功能，在II期臨床實驗中失敗(Parkinson Study Group PRECEPT Investigators.Neurology 2007 ；69:1480-1490)。研究表明,PSD-95(突觸后致密物質 95,postsynaptic density-95)與 MLK3 的特異結合可促進MLK3的活化。PSD-95是組成興奮性突觸的突觸后致密物質的一個關鍵蛋白，它屬于膜相關的鳥苷酸激酶(membrane-associated guanylate kinases,MAGUK)蛋白家族中的一員，又被稱為腳手架蛋白，在興奮性突觸的PSD中募集信號蛋白(Kennedy MB, TrendsNeurosci,1997,20:264-268 ；Sheng M.Proc.Natl.Acad.Sc1.USA,2001, 98:7058-7061 ；Sheng M等人，Science，2002，298:776-780 ;Sheng M.J Cell Sci，2001，114 (Pt 7):1251)。PSD-95由N-端3個PDZ (PSD-95/Dlg/Z0-l)結構域，I個SH3結構域和C-端無活性的鳥苷酸激酶(GK)結構域組成(Anderson JM.1996 Curr Biol,6:382-384 ；Gonzalez-MariscalL 等人，Semin Cell Dev Biol, 2000，11:315-324)。PSD-95 通過其 SH3 結構域與 MLK3 的 C末端富含脯氨酸(proline-rich region domain, PRD)的結構域結合形成PSD-95-MLK3復合體(ffhitmarsh AJ 等人，Davis RJ.Science, 1998, 281:1671-1674 ；Savinainen A 等人，JBiol Chem, 2001, 276:11382-11386)。本發明人的研究表明MLK3在生理狀態下活性較低，與PSD-95不結合，但病理狀態下MLK3與PSD-95結合增加，并且被激活，從而導致下游信號通路激活而引起細胞凋亡，因此阻斷MLK3與PSD-95在病理狀態下的結合從而阻斷下游信號通路的激活對細胞損傷具有保護作用。

發明內容
本發明人研究發現靶向于PSD-95-MLK3復合體的肽對病理狀態下過度激活的MLK3有抑制作用，從而可用作神經保護藥物。因此，開發這種MLK3特異性肽抑制劑對研究和開發神經元保護藥物，預防和/或治療腦卒中、神經退行性疾病、癲癇以及疾病的免疫炎性反應等的治療藥物具有重要意義。因此，本發明的一個目的為針對現有MLK3抑制劑的不足，提供新型肽，所述肽可以與MLK3競爭性結合PSD95的SH3結構域，從而抑制病理狀態下MLK3-JNK3信號通路的過
度激活。本發明的另一個目的為提供可以表達所述肽的核苷酸；此外，本發明的再一個目的為提供包含所述肽的藥物組合物；本發明的目的還在于提供所述肽的制藥用途。本發明的技術方案如下:一方面，本發明提供一種具有神經保護作用的肽，所述肽的氨基酸序列如SEQ.1D.N0.1 所示:SEQ.1D.N0.1:Pro Glu Pro Glu Glu Pro Arg Arg Ser Gly Arg Lys Lys ArgArgGln Arg Arg Arg在下文其它部分，S EQ.1D.N0.1所示肽又被簡稱為P2。P2中未加下劃線的部分可以競爭性地結合PSD95，干擾MLK3與PSD-95的結合，抑制神經細胞凋亡過程中MLK3的活化及其下游的細胞信號轉導，產生神經保護作用；帶下劃線部分的序列為穿膜肽序列，其幫助小肽進入細胞。穿膜肽序列是一種帶正電荷的短肽，具有穿膜活性，能將外源性的生物學分子如多肽、寡核苷酸、DNA、蛋白、質粒甚至顆粒型物質攜帶入多種哺乳動物活細胞，并且對細胞不會產生毒副作用，這種設計已被公認(Vives E等人，J Biol Chem, 1997, 272:16010-16017)。P2中的穿膜序列可以是其他任何能幫助該肽進入細胞的序列，因此將其修改為本領域現有或未來開發的穿膜序列而得到的肽都應該在本發明的保護范圍之內。下表I列舉了一些常用的穿膜序列，除此之外新型穿膜肽或穿膜序列仍在不斷被報道，本發明不能--列舉。表I現有常用穿膜序列
權利要求
1.一種具有神經保護作用的肽，所述肽的氨基酸序列如SEQ.1D.N0.1所示。
2.編碼根據權利要求1所述肽的核苷酸，所述核苷酸的序列如SEQ.1D.N0.2所示。
3.根據權利要求1所述肽和根據權利要求2所述核苷酸的制備方法，所述制備方法為生物合成或化學合成方法。
4.一種構建體,所述構建體包含根據權利要求2所述的核苷酸序列。
5.一種藥物組合物，所述藥物組合物包含根據權利要求1所述的肽或根據權利要求2所述的核苷酸序列或者根據權利要求4所述的構建體； 優選地，所述藥物組合物包含根據權利要求1所述的肽。
6.根據權利要求5所述的藥物組合物，所述藥物組合物還包含藥學上可接受的載體。
7.根據權利要求6所述的藥物組合物，其特征在于，所述載體選自稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑、吸附載體、潤滑劑、調味劑、香味劑等的一種或多種； 優選地，所述藥物組合物為片劑、粉劑、顆粒劑、膠囊、口服液或注射液。
8.根據權利要求1所述的肽或根據權利要求2所述的核苷酸序列或者根據權利要求4所述的構建體在制備用于預防和/或治療神經系統疾病、免疫炎性疾病的藥物和/或神經元保護藥物中的用途。
9.根據權利要求8所述的用途，其特征在于，所述神經系統疾病選自神經退行性疾病、癲癇以及腦卒中中的一種或幾種； 優選地，所述神經退行性疾病例如包括老年癡呆和帕金森病。
10.根據權利要求8或9所述的用途，其特征在于，所述藥物選自片劑、粉劑、粒劑、膠囊、口服液和注射液。
全文摘要
本發明提供一種肽、編碼所述肽的核苷酸序列、包含所述肽的藥物組合物以及所述肽的制藥用途。本發明提供的肽的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。所述肽可以干擾MLK3與PSD-95的結合，抑制神經細胞凋亡過程中MLK3的活化及其下游的細胞信號轉導，從而產生神經保護作用，具有良好的藥物應用前景。
文檔編號A61P25/08GK103159832SQ20111040402
公開日2013年6月19日 申請日期2011年12月8日 優先權日2011年12月8日
發明者侯筱宇, 李婷, 徐珍, 張曉紅, 徐巖, 胡斌 申請人:徐州醫學院