專利名稱：鬼針草總黃酮的提取方法及其在制備治療類風濕性關節炎藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及鬼針草總黃酮的提取方法及其在制備治療類風濕性關節炎藥物中的應用，屬于醫藥技術領域。
背景技術：
類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis, RA)是一種不明病因的臨床綜合征，以慢性多關節炎癥為主要表現，目前認為屬于系統性自身免疫性疾病。主要特征為慢性、全身性、侵蝕性外周關節滑膜炎，主要侵犯滑膜組織，繼而引起關節軟骨、周圍韌帶及骨質的破壞。本病呈全球性分布，我國的患病率為0. 32% 0. 36%，低于歐美國家白人的1%，是造成我國人群喪失勞動力和致殘的主要病因之一。目前RA的治療主要是①控制關節及其他組織炎癥，緩解癥狀；②保持關節功能和防止畸形；③修復受損關節以減輕疼痛和恢復功能， 尚缺乏根治RA的方案以及預防RA的措施。到目前為止尚無特異性治療藥物，臨床上常采用的是控制炎癥和抑制機體免疫應答的藥物，如潑尼松、氨甲喋呤等，但是，它們在抑制機體免疫應答引起的炎癥反應和組織損傷的同時，也抑制了免疫系統的抗感染能力，將由此而產生一系列不良反應。RA是一種以關節滑膜及關節軟骨損害為特征的全身性免疫性疾病，主要表現為對稱性、慢性、進行性多關節炎。一旦發病，往往終身罹患，嚴重影響患者的生活質量。但類風濕性關節炎至今尚無特效療法，抗炎和免疫療法是治療RA的主要手段，但主要是激素和抗代謝等不良反應較多的藥物。因此尋找有效的具有免疫調節作用且副作用小的藥物，對于類風濕性關節炎的治療具有重要的意義。在此背景下，人們的目光轉向了中醫中藥。中醫藥防治類風濕性關節炎的長期臨床實踐積累給抗類風濕性關節炎的中藥研究奠定了堅實的基礎，特別是前人對類風濕性關節炎(中醫痹癥范疇)治療的理論總結和處方用藥經驗，為當今中藥抗類風濕性關節炎研究提供了線索和捷徑。尋找價格便宜和療效好的中藥及其有效成分治療RA，日漸成為研究的熱點。迄今報道對類風濕性關節炎中藥有效成分有多糖類、黃酮類、苷類、生物堿類、內酯類、揮發油類及其他。具有療效確切、安全、副作用少、價格便宜等特點。《中藥大辭典》載鬼針草有清熱解毒、祛風除濕、散瘀消腫之功效。我們從鬼針草中提取了活性成分TFB，研究其在治療類風濕性關節炎中的作用和作用機制。鬼針草(Bidens bipinnata L.)系菊科鬼針草屬一年生草本植物,在我國大多數省區均有分布。鬼針草藥用歷史悠久，味苦、性平而無毒，具有清熱解毒，散瘀消腫等功效。其主要成分有黃酮苷、皂苷、生物堿、揮發油等，民間用于治療痢疾、腹瀉、肝炎、胃痛、關節痛等，現代研究發現鬼針草富含黃酮類化合物，為將其開發成對類風濕性關節炎有治療作用的有效藥物提供非常珍貴的依據。我們提取其有效部位，通過動物實驗證實其有顯著的抗類風濕性關節炎的作用。經檢索，尚未見關于鬼針草總黃酮治療類風濕性關節炎的文獻報道。

發明內容
本發明的目的在于提供鬼針草總黃酮(total flavones of Bidens pilosa L,TFB)的提取方法及其在治療類風濕性關節炎藥物中的應用。按照本發明提供的技術方案，鬼針草總黃酮的提取方法，其提取工藝步驟為取鬼針草，用1(T14倍鬼針草重量的、質量濃度為709^90%的乙醇溶解提取2次，每次Ih ;收集提取液，用大孔吸附樹脂HPDlO吸附提取液；提取液上樣濃度為f I. 5mg mL'以f 3BV 的吸附速率進行吸附，上樣量以溶質總黃酮計為3飛mg mL—1大孔吸附樹脂；吸附后先以3飛BV的水水洗去雜質，再用3飛BV質量濃度為70% 90%的乙醇以3飛BV .h—1的速率進行洗脫；在此條件下進行吸附、洗脫，大孔吸附樹脂能夠重復使用3飛次；經大孔吸附樹脂吸附，質量濃度為709^90%的乙醇解吸后為鬼針草總黃酮溶液，采用比色法測定鬼針草總黃酮溶液中總黃酮的含量和得率。所述總黃酮百分含量為60% 80%，得率為3% 6%。
所述鬼針草總黃酮溶液在制備治療類風濕性關節炎藥物中的應用。所述鬼針草總黃酮溶液制備成治療類風濕性關節炎藥物，即片劑、膠囊劑、沖劑和顆粒。鬼針草總黃酮的臨床推薦劑量為IOOlOOmg/天，口服，一日三次。(8(Tl60mg/kg是大鼠的用藥劑量)將所制備得到的鬼針草總黃酮溶液進行動物實驗，結果如下鬼針草總黃酮(TFB160mg/kg)于用藥后第4天開始明顯減輕AA大鼠的足腫脹度(與AA模型組比較，p〈0. 05)，用藥第12天(d21)開始TFB40，80mg/kg均可顯著減輕AA大鼠的足腫脹度(TFB40mg/kg組與AA模型組比較，p<0. 05 ；TFB80mg/kg組與模型組比較，p〈0.01);同時TFB (80、160mg/kg)在d21、d24顯著降低了 AA大鼠全身多發性關節炎指數(表2);TFB160mg/kg能明顯降低AA大鼠血清IL-6水平(與模型組比較，P〈0. 05)，而TNF- a水平在TFB各劑量組中均明顯降低。病理組織學檢查結果提示TFB (40，80，160mg/kg)可明顯減少炎性細胞浸潤，明顯改善關節受損程度。本發明的有益效果本發明發掘了 TFB新的藥用前景，開拓了一個新的藥用領域；制備的鬼針草總黃酮采用口服給藥，服用方便，毒副作用小，長期服藥無危害。鬼針草總黃酮的原藥資源非常豐富，具有良好的社會和經濟效益；對類風濕性關節炎的療效確切，為將鬼針草進一步開發為新藥提供了強有力的依據。


圖I大鼠AA關節炎模型誘導(A :正常組、B :模型組)圖2 AA大鼠膝關節肉眼形態。圖3 AA大鼠膝關節病理特點。
具體實施例方式實施例I鬼針草總黃酮的提取采用正交實驗法對鬼針草總黃酮乙醇提取工藝進行優化，確定乙醇提取的生產工藝為用鬼針草12倍重量、質量濃度為80%的乙醇溶液提取2次，每次I小時。并從總黃酮靜態吸附-解吸量、動態吸附-解吸量、靜態吸附動力學過程等方面，對國產七種大孔吸附樹脂進行研究，選擇出了一種最適合于制備鬼針草總黃酮的大孔吸附樹脂HPD100。并對HPD100純化總黃酮的工藝參數進行考查，確定其工藝條件提取液上樣濃度為ri. 5mg mL'以2BV IT1的吸附速率進行吸附，最大上樣量以總黃酮計為4. 99mg mL—1大孔吸附樹脂。吸附后先以4BV水洗去雜質，再用4BV的質量濃度為70%的乙醇溶液以的速率進行洗脫。在此條件下進行吸附、洗脫，樹脂可重復使用5次。經大孔樹脂吸附、乙醇解吸后為鬼針草總黃酮溶液，采用比色法測定鬼針草總黃酮溶液中總黃酮含量為72. 1%，得率為4. 7%0質量控制是中藥研制工作的重點。利用化學鑒別法和薄層層析法對TFB進行定性鑒別；采用NaNO2-Al (NO3)-NaOH顯色系統，用紫外分光光度法測定了鬼針草總黃酮提取物中黃酮的含量。TFB的含量為73. 3%，平均回收率為96. 51%，RSD為2. 61 %。該法簡便、快速、重現性好，可用于TFB的質控方法。
實施例2提取步驟為取鬼針草，用10倍鬼針草重量的、質量濃度為70%的乙醇溶解提取2次，每次Ih ;收集提取液，用大孔吸附樹脂HPD100吸附；提取液上樣濃度為Img mL'以IBV h-1的吸附速率進行吸附，上樣量以溶質總黃酮計為3mg mL-1大孔吸附樹脂；吸附后先以3BV水洗去雜質，再用3BV質量濃度為70%乙醇以3BV 的速率進行洗脫；在此條件下進行吸附、洗脫，大孔吸附樹脂能夠重復使用3次；經大孔吸附樹脂吸附，質量濃度為70%的乙醇解吸后為鬼針草總黃酮溶液，采用比色法測定鬼針草總黃酮溶液中總黃酮的含量和得率。所述鬼針草總黃酮溶液中總黃酮百分含量為75%，得率為3. 8%。實施例3提取步驟為取鬼針草，用14倍鬼針草重量的、質量濃度為90%的乙醇溶解提取2次，每次Ih ;收集提取液，用大孔吸附樹脂HPD100吸附；提取液上樣濃度為I. Smg.mL-1,以3BV h-1的吸附速率進行吸附，上樣量以溶質總黃酮計為5mg mL-1大孔吸附樹脂；吸附后先以5BV水洗去雜質，再用5BV質量濃度為90%乙醇以5BV IT1的速率進行洗脫；在此條件下進行吸附、洗脫，大孔吸附樹脂能夠重復使用5次；經大孔吸附樹脂吸附，質量濃度為709^90%的乙醇解吸后為鬼針草總黃酮溶液，采用比色法測定鬼針草總黃酮溶液中總黃酮的含量和得率。所述鬼針草總黃酮溶液中總黃酮百分含量為62. 8%，得率為6%。實施例4鬼針草總黃酮動物性實驗動物實驗的對象是選取弗氏完全佐劑(Freund’s complete adjuvant, CFA)誘導的佐劑性關節炎(adjuvant-induced arthritis, AA)大鼠模型。實驗包括 I、AA大鼠模型的誘導 Sprague-Dawley (SD)大鼠，雌雄不限，體重160g±20g,由江蘇省血吸蟲病防治研究所實驗動物中心提供。除正常組外，所有大鼠左側后足跖皮內注射CFA (即為卡介苗80°C、lh滅活后與高壓滅菌的液體石臘充分碾磨混勻配成IOmg ml/1的乳劑)0. ImL致炎，造成AA大鼠模型。2、動物分組及給藥方案將AA大鼠隨機分為5組模型組；TFB (40、80、160mg kg—1)組和雷公藤多苷片(Glucoside Tripterygium Total, GTT) IOmg kg-1 對照組。AA 大鼠于致炎后第 10 24 天分別灌胃給藥(ImL IOOg-1);正常組與模型組給予等容量的無菌注射用水。3、關節腫脹度測定分別于致炎前(d0)、致炎后第10天(dlO)、第13天(dl3)、第17天(dl7)、第21天(d21)、第24天(d24)測定右側(繼發側)足容積，并計算其腫脹度(A mL=致炎后容積-致炎前容積)，以觀察AA大鼠繼發側炎癥的變化情況。4、多發性關節炎指數(polyarthritis indes,PI)評分 致炎后dlO、dl3、dl7、d21、d24觀察并記錄全身關節病變程度，按5級評分法評價，計算出PI :0=無紅腫；1 =趾關節紅腫；2=趾關節和足趾腫脹；3=踝關節以下的足爪腫脹；4=包括踝關節在內的全部足爪腫脹。根據未注射CFA的其余3個關節的病變程度累計積分，即為每只大鼠的PI。5、關節滑膜組織病理組織學檢查致炎后d24引頸處死大鼠，取膝關節滑膜及其周圍組織，用4%多聚甲醛固定，常規脫水、透明、浸蠟、包埋、切片，作病理組織學檢查。采用隨機雙盲法鏡下觀察各組大鼠關節組織中炎癥細胞浸潤、骨侵蝕以及新生血管生成情況并評分0=正常；1=輕度；2=中度；3=嚴重。病理學評分為3者之和。6、血清IL-6和TNF-a的測定股動脈取血，室溫靜置過夜，使其充分凝固，然后置于4°C冰箱過夜。以1500rpm離心30min，吸取上部清亮的血清，分裝于小瓶中，-20°C冰箱保存待放免法檢測。檢測方法，嚴格按照E2、P放免試劑盒說明書提供的步驟進行操作。實驗結果如下I、AA大鼠模型的成功制備大鼠左后足趾皮下注射CFA dlO后繼發側(右側)關節炎出現，以后逐漸表現為以多發性關節炎為特征的慢性、全身性炎癥反應。大鼠足爪腫脹明顯(如圖1B)，實驗中見大鼠倦怠、攝食減少、消瘦、多發性關節腫脹及關節觸痛，活動障礙等與RA相似的癥狀。2、TFB對AA模型大鼠繼發側足腫脹度的影響大鼠致炎后第1(T24天繼發側足腫脹度與正常組相比明顯增加；與模型組相比，TFB (160mg/kg)于用藥后第4天明顯減輕AA大鼠的足腫脹度；TFB (40、80mg/kg)自d21開始可顯著減輕AA大鼠的足腫脹度；GTT (10mg/kg)自第17天起對AA大鼠的足腫脹度有顯著抑制作用(表I)。表I TFB對AA大鼠繼發側關節腫脹度的影響(n=8, x±s )
權利要求
1.鬼針草總黃酮的提取方法，其特征是提取步驟為取鬼針草，用1(T14倍鬼針草重量的、質量濃度為70% 90%的乙醇溶解提取2次，每次Ih ;收集提取液，用大孔吸附樹脂HPDlO吸附提取液；提取液上樣濃度為f I. 5mg mL—1，以f 3BV IT1的吸附速率進行吸附，上樣量以溶質總黃酮計為:T5 mg 大孔吸附樹脂；吸附后先以:T5 BV的水水洗去雜質，再用3 5 BV質量濃度為709^90%的乙醇以3 5 BV 的速率進行洗脫；在此條件下進行吸附、洗脫，大孔吸附樹脂能夠重復使用3飛次；經大孔吸附樹脂吸附，質量濃度為709^90%的乙醇解吸后為鬼針草總黃酮溶液，采用比色法測定鬼針草總黃酮溶液中總黃酮的含量和得率。
2.如權利要求I所述鬼針草總黃酮的提取方法，其特征是所述鬼針草總黃酮溶液中總黃酮百分含量為60% 80%，得率為3% 6%。
3.鬼針草總黃酮在制備治療類風濕性關節炎藥物中的應用，其特征是所述鬼針草總黃酮溶液在制備治療類風濕性關節炎藥物中的應用。
全文摘要
本發明涉及鬼針草總黃酮的提取方法及其在制備治療類風濕性關節炎藥物中的應用。鬼針草總黃酮的提取步驟為取鬼針草，用乙醇溶解提取；收集提取液，用大孔吸附樹脂吸附；吸附后先以水洗去雜質，再用乙醇進行洗脫；在此條件下進行吸附、洗脫，大孔吸附樹脂能夠重復使用；經大孔吸附樹脂吸附，用乙醇解吸后為鬼針草總黃酮溶液，采用比色法測定鬼針草總黃酮溶液中總黃酮的含量和得率。所述鬼針草總黃酮溶液用于治療類風濕性關節炎。所述鬼針草總黃酮溶液用于治療類風濕性關節炎時的用量為80~160mg/kg。本發明發掘了TFB新的藥用前景，鬼針草總黃酮對類風濕性關節炎的療效確切；制備的鬼針草總黃酮采用口服給藥，服用方便，毒副作用小，長期服藥無危害。
文檔編號A61P19/02GK102716166SQ20121023867
公開日2012年10月10日 申請日期2012年7月10日 優先權日2012年7月10日
發明者李成萬, 李霞, 袁鳳來, 賀春暉, 趙懿清 申請人:無錫市第三人民醫院