專利名稱：含乳酸的18個環原子環縮肽類殺內寄生蟲劑及其制備方法
技術領域：
本發明涉及制備含乳酸的具有18個環原子的環縮肽類化合物(depsipeptides)的新方法，這些縮肽類化合物中的一些化合物是已知的。
一些含乳酸的具有18個環原子的環縮肽類化合物(恩鐮孢菌素類化合物)和其作為殺內寄生蟲劑(endoparasiticides)的用途已是在先專利申請(DE-OS(德國公開說明書)4317458)中的主題。
存在一系列制備含D-2-羥基-異戊酸的具有18個環原子的環縮肽類化合物的化學和微生物方法(例如通過合成法，參見P.Quitt等人，Helv. Chimica Acta 46(1963)pp. 1715-1720;P.Quitt等人，Helv. Chimica Acta 47(1964)pp. 166-173 [恩鐮孢菌素 A];Pl. A. Plattner等人，Helv. Chimica Acta 46 (1963)pp. 927-935 [恩鐮孢菌素B];Yu. A. Ovchinnikov等人，Tetrahedron Lett. 2(1971)pp. 159-162;R. W. Roeske等人，Biochem. Biophys. Res. Commun. 57(1974)pp.554-561[beauvericin];例如通過發酵法，參見R. Zocher等人，J. Antibiotics 45 (1992) pp. 1273-1277[恩鐮孢菌素A、B和C];A. Visconti等人，J. Agric. Food Chem. 40 (1992)pp. 1076-1082[恩鐮孢菌素 B4];Hiroshi Tomoda 等人，J. Antibiotics 45(1992)pp. 1207-1215[恩鐮孢菌素A、A1、B、B1、D、E和F])。
在日本專利(參見MK 1688的合成法JP 專利02 229 177A2;參見C.A.114(23)227 487k)中描述了含有D-2-羥基-仲己酸的環己縮肽的發酵。
但是，關于通過發酵方法合成含乳酸的環己縮肽類化合物(恩鐮孢菌素類化合物)，還未被公開過。
本發明涉及借助于鐮孢菌屬的真菌菌株，或從其中分離出的酶制備物制備含乳酸的旋光的具有18個環原子的環縮肽類化合物的方法。
在根據本發明的方法中，通式(Ⅰ)的含乳酸的旋光的具有18個環原子的環縮肽類化合物(恩鐮孢菌素類化合物)，是通過使式(Ⅱ)、(Ⅲ)和(Ⅳ)的旋光的或外消旋的氨基酸與式(Ⅴ)和(Ⅵ)的旋光的或外消旋的2-羥基-羧酸和旋光的或外消旋的乳酸，在鐮孢菌屬的真菌菌株存在下在適合的營養液中或在緩沖系統中在從微生物中分離出的合成酶存在下反應而制備的，且隨后分離所要的含乳酸的具有18個環原子的環縮肽類化合物(恩鐮孢菌素類化合物)，
其中R1、R2和R4彼此獨立地代表氫、具有最多達8個碳原子的直鏈或支鏈烷基、羥烷基、巰基烷基、烷硫基烷基、烷基亞磺酰基烷基、烷基磺酰基烷基、羧基烷基、烷氧羰基烷基、氨基甲酰基烷基、氨基烷基、烷基氨基烷基、二烷基氨基烷基、胍基烷基、具有最多達6個碳原子的直鏈或支鏈鏈烯基、具有最多達8個碳原子的環烷基、和任選取代的芳基烷基或雜芳基烷基，可提及的取代基為鹵素、羥基、烷氧基、烷基、硝基或氨基，R3和R5彼此獨立地代表氫、具有最多達8個碳原子的直鏈或支鏈烷基、羥烷基、巰基烷基、烷硫基烷基、烷基亞磺酰基烷基、烷基磺酰基烷基、具有最多達6個碳原子的直鏈或支鏈鏈烯基、具有最多達8個碳原子的環烷基、和任選取代的芳基烷基或雜芳基烷基、可提及的取代基為鹵素、羥基、烷氧基、烷基、硝基或氨基， 其中R1、R2和R4具有上述定義，
其中R3和R5具有上述定義。
通式(Ⅰ)的含乳酸的具有18個環原子的環縮肽類化合物(恩鐮孢菌素類化合物)特別適合于防治內寄生蟲，在醫學和獸醫學領域尤其如此。
通式(Ⅰ)提供了根據本發明的含乳酸的具有18個環原子的環縮肽類化合物(恩鐮孢菌素類化合物)的一般定義。
優選的通式(Ⅰ)化合物是下述化合物其中R1、R2和R4彼此獨立地代表氫，直鏈或支鏈的C1-C8-烷基，特別是甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、仲戊基、1，2-二甲基丙基、新戊基、1-乙基-丙基、1，1-二甲基丙基、己基、異己基、仲己基、庚基、異庚基、仲庚基、叔庚基、辛基、異辛基、仲辛基、羥基-C1-C4-烷基，特別是羥甲基、1-和2-羥基乙基，巰基-C1-C4-烷基，特別是巰基甲基，C1-C4-烷硫基-C1-C4-烷基，特別是甲硫基甲基、甲硫基乙基，C1-C4-烷基亞磺酰基-C1-C4-烷基，特別是甲基亞磺酰基甲基、甲基亞磺酰基乙基、C1-C4-烷基磺酰基-C1-C4-烷基，特別是甲磺酰基甲基、甲磺酰基乙基、羧基-C1-C6-烷基，特別是甲氧羰基甲基、乙氧羰基乙基、氨基甲酰基-C1-C6-烷基，特別是氨基甲酰基甲基、氨基甲酰基乙基、氨基-C1-C6烷基，特別是氨基丙基、氨基丁基、C1-C4-烷基氨基-C1-C6-烷基，特別是甲基氨基丙基、甲基氨基丁基、C1-C4-二烷基氨基-C1-C6-烷基，特別是二甲基氨基丙基、二甲基氨基丁基、胍基-C1-C6-烷基，特別是胍基丙基，C2-C6-鏈烯基，特別是乙烯基、烯丙基、丁烯基、己烯基、C3-C7-環基C1-C4-烷基，特別是環丙基甲基、環戊基甲基、環己基甲基、環庚基甲基，雜芳基-C1-C4-烷基，特別是噻吩-2-基-甲基、噻吩-3-基-甲基、吲哚-3-基-甲基、苯基-C1-C4-烷基，特別是可被下列基團任選取代的苯基甲基鹵素，特別是氟、氯、溴或碘，羥基、硝基、氨基、C1-C4-烷氧基，特別是甲氧基或乙氧基和C1-C4-烷基，特別是甲基，R3和R5彼此獨立地代表氫，直鏈或支鏈的C1-C8-烷基，特別是甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、仲戊基、1，2-二甲基丙基、新戊基、1-乙基-丙基、1，1-二甲基丙基、己基、異己基、仲己基、庚基、異庚基、仲庚基、叔庚基、辛基、異辛基、仲辛基、羥基-C1-C4-烷基，特別是羥甲基、1-和2-羥基乙基，巰基-C1-C4-烷基，特別是巰基甲基，C1-C4-烷硫基-C1-C4-烷基，特別是甲硫基甲基、甲硫基乙基，C1-C4-烷基亞磺酰基-C1-C4-烷基，特別是甲基亞磺酰基甲基、甲基亞磺酰基乙基、C1-C4-烷基磺酰基-C1-C4-烷基，特別是甲磺酰基甲基、甲磺酰基乙基、C2-C6-鏈烯基，特別是乙烯基、烯丙基、丁烯基、己烯基、C3-C7-環基C1-C4-烷基，特別是環丙基甲基、環戊基甲基、環己基甲基、環庚基甲基、雜芳基-C1-C4-烷基，特別是噻吩-2-基-甲基、噻吩-3-基-甲基、苯基-C1-C4-烷基，特別是可被下列基團任選取代的苯基甲基鹵素，特別是氟、氯、溴或碘，羥基、硝基、氨基、C1-C4-烷氧基，特別是甲氧基或乙氧基和C1-C4-烷基，特別是甲基。
特別優選的通式(Ⅰ)化合物是下述化合物，其中R1、R2和R4彼此獨立地代表直鏈或支鏈C1-C8-烷基，特別是甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、戊基、仲戊基、1，2-二甲基-丙基、新戊基、1-乙基-丙基、1，1-二甲基-丙基、己基、異己基、仲己基、庚基、異庚基、仲庚基、辛基、異辛基、仲辛基、羥基-C1-C4-烷基，特別是羥甲基、1-和2-羥基乙基，巰基-C1-C4-烷基，特別是巰基甲基，C1-C4-烷硫基-C1-C4-烷基，特別是甲硫基甲基、甲硫基乙基，C2-C6-鏈烯基，特別是乙烯基、烯丙基、丁烯基、己烯基、C3-C7-環基C1-C4-烷基，特別是環丙基甲基、環戊基甲基、環己基甲基或環庚基甲基，R3和R5彼此獨立地代表直鏈或支鏈C1-C8-烷基，特別是甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、仲戊基、1，2-二甲基丙基、新戊基、1-乙基-丙基、1，1-二甲基丙基、己基、異己基、仲己基、庚基、異庚基、仲庚基、叔庚基、辛基、異辛基、仲辛基，羥基-C1-C4-烷基，特別是羥甲基、1-和2-羥基乙基，C1-C4-烷硫基-C1-C4-烷基，特別是甲硫基甲基、C2-C6鏈烯基，特別是乙烯基、烯丙基、丁烯基、己烯基、C3-C7-環基C1-C4-烷基，特別是環丙基甲基、環戊基甲基、環己基甲基或環庚基甲基。
非常特別優選的式(Ⅰ)化合物是下述化合物，其中R1、R2和R4彼此獨立地代表直鏈或支鏈C1-C8-烷基，特別是甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、戊基、仲戊基、1，2-二甲基-丙基、新戊基、1-乙基-丙基、1，1-二甲基-丙基、己基、異己基、庚基、異庚基、仲庚基、辛基、異辛基、仲辛基，C2-C6鏈烯基，特別是乙烯基、烯丙基、丁烯基、C3-C7-環基C1-C4-烷基，特別是環己基甲基，R3和R5彼此獨立地代表直鏈或支鏈C1-C8-烷基，特別是甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、仲戊基、1，2-二甲基丙基、新戊基、1-乙基-丙基、1，1-二甲基丙基、己基、異己基、仲己基、庚基、異庚基、仲庚基、叔庚基、辛基、異辛基、仲辛基，C2-C6鏈烯基，特別是乙烯基、烯丙基、丁烯基、己烯基、C3-C7-環基C1-C4-烷基，特別是環己基甲基。
下面可分別地述及通式(Ⅰ)的旋光化合物環(-N-甲基-L-丙氨酰-D-乳酰-N-甲基-L-異亮氨酰-D-乳酰-N-甲基-L-纈氨酰-D-乳酰-)，環(-N-甲基-L-丙氨酰-D-乳酰-N-甲基-L-異亮氨酰-D-乳酰-N-甲基-L-正纈氨酰-D-乳酰-)，環(-N-甲基-L-丙氨酰-D-乳酰-N-甲基-L-異亮氨酰-D-乳酰-N-甲基-L-亮氨酰-D-乳酰-)，環(-N-甲基-L-丙氨酰-D-乳酰-N-甲基-L-異亮氨酰-D-乳酰-N-甲基-L-正亮氨酰-D-乳酰-)，環(-N-甲基-L-纈氨酰-D-乳酰-N-甲基-L-纈氨酰-D-2-羥基-異戊酰-N-甲基-L-纈氨酰-D-乳酰-)，環(-N-甲基-L-纈氨酰-D-2-羥基-異戊酰-N-甲基-L-纈氨酰-D-2-羥基-異戊酰-N-甲基-L-纈氨酰-D-乳酰-)，環(-N-甲基-L-丙氨酰-D-乳酰-N-甲基-L-別異亮氨酰-D-乳酰-N-甲基-L-別異亮氨酰-D-乳酰-)，環(-N-甲基-L-丙氨酰-D-乳酰-N-甲基-L-別異亮氨酰-D-乳酰-N-甲基-L-丙氨酰-D-乳酰-)，環(-N-甲基-L-丙氨酰-D-乳酰-N-甲基-L-異亮氨酰-D-乳酰-N-甲基-L-2-氨基-丁酰-D-乳酰-)，環(-N-甲基-L-丙氨酰-D-乳酰-N-甲基-L-別異亮氨酰-D-乳酰-N-甲基-L-2-氨基-丁酰-D-乳酰-)。
一些通式(Ⅰ)的化合物是已知的(參見，例如V.Z. Pletnev等人，Bioorg. Khim. 1(2)(1975)pp. 160-165;參見C. A. 83(13)∶114872e;DE-OS(德國公開說明書)4317458)并可通過本文中所述的化學合成方法得到。
在根據本發明制備含乳酸的環縮肽類化合物(恩鐮孢菌素類化合物)(Ⅰ)的方法中，如果將L-纈氨酸(R1、R2和R4-異丙基)用作式(Ⅱ)到(Ⅳ)化合物且D-乳酸(R3和R5-甲基)作為式(Ⅴ)和(Ⅵ)化合物，則本發明例如可通過下述方程式描述 SAMS-腺苷-L-蛋氨酸ATP三磷酸腺苷金屬鹽例如堿土金屬鹽(Mg2+鹽)或Mn2+鹽。
式(Ⅱ)至(Ⅳ)提供了進行本發明方法所需氨基酸起始化合物的一般定義。在這些結構式中，R1、R2和R4優選代表在描述本發明式(Ⅰ)物質時已提及的這些取代基的那些優選基團。
如果用作起始物質的天然或合成氨基酸是手性的，則它們可以D構型或L構型存在。但是，L構型的α-氨基酸是優選的。
可述及的實例為Aad，Abu，jAbu，ABz，2ABz，εAca，Ach，Acp，Adpd，Ahb，Aib， Aib，Ala， Ala，△Ala，Alg，All，Ama，Amt，Ape，Apm，Apr，Arg，Asn，Asp，Asu，Aze，Azi，Bai，Bph，Can，Cit，Cys，(Cys)2，Cyta，Daad，Dab，Dadd，Dap，Dapm，Dasu，Djen，Dpa，Dtc，Fel，Gln，Glu，Gly，Guv，hAla，hArg，hCys，hGln，hGlu，His，hIle，hLeu，hLys，hMet，hPhe，hPro，hSer，hThr，hTrp，hTyr，HyI，Hyp，3Hyp，Ile，Ise，Iva，Kyn，Lant，Lcn，Leu，Lsg，Lys， Lys，△Lys，Met，Mim，Min，nArg，Nle，Nva，Oly，Orn，Pan，Pec，Pen，Phe，Phg，Pic，Pro，△Pro，Pse，Pya，Pyr，Pza，Qin，Ros，Sar，Sec，Sem，Ser，Thi， Thi，Thr，Thy，Thx，Tia，Tle，Tly，Trp，Trta，Tyr，Val，Nal，Tbg，Npg，Chg，Thia，(參見例如，Houben-Weyl，Methoden der Organischen Chemie[有機化學方法]，VolumesXV/1和2，Stuttgart，1974)。
式(Ⅴ)到(Ⅵ)提供了進行本發明方法所需2-羥基-羧酸起始物質的一般定義。
在這些結構式中R3和R5優選代表在描述本發明式(Ⅰ)物質時已提及的這些取代基的那些優選基團。
如果用作起始物質的2-羥基-羧酸是手性的，則它們可以D構型或L構型存在。但是，D構型的2-羥基羧酸是優選的。
下述為可提及的實例Hyac，Hyba，Hydd，Hyde，Hyic，Hyiv，Hymb，Hypp，Hypr(Lac)，Hytd，Hyud，Hyva，(參見例如，Houben-Weyl，Methoden der OrganischenChemie[有機化學方法]，VolumesXV/1和2，Stuttgart，1974)。
適合于進行本發明方法的鐮孢菌屬菌株是下述的鐮孢菌屬菌株。
鐮孢菌屬(Fusarium)菌株分離自Fusarium acuminatumBBA 61 148毛羽扇豆節孢狀鐮孢(Fusarium arthrosporoides)BBA 64 134翦股穎屬(種子)燕麥鐮孢(Fusarium avenaceum)BBA 64 338冬小麥(種子)BBA 62 163甘藍Fusarium compactumBBA 65 671棉花Fusarium crookwellenseBBA 64 297小麥(莖基)Fusarium ensiformeBBA 64 683甘薯木賊鐮孢(Fusarium equiseti)BBA 64 814黑麥Fusarium inflexum
BBA 63 203蠶豆Fusarium gibbosum磚紅鐮孢(Fusarium lateritium)BAA 65 090小麥(莖基)節狀鐮孢(Fusarium meresmoides)BBA 64 329黑麥(莖基)串珠鐮孢(Fusarium moniliforme)尖鐮孢(Fusarium oxysporum)BBA 62 057f.pisi豌豆BBA 62 060f.lycopersici番茄BBA 62 334f.lupini白羽扇豆BBA 64 952f.batatas甘薯Fusarium proliferatumBBA 63 625龍血樹芳香鐮孢(Fusarium redolens)BBA 62 390紫羅蘭花接骨木鐮孢(Fusarium sambucinum)BBA 63 933小麥
BBA 62 397馬鈴薯NRRL-13 500馬鈴薯NRRL-13 503馬鈴薯R-583蓼R-5390馬鈴薯R-7570土壤R-5455谷物R-6380馬鈴薯R-7843石竹R-5690土壤R-2633馬鈴薯R-6354谷物蔗草鐮孢(Fusarium scirpi)ETH 1536草地土壤半裸鐮孢(Fusarium semitectum)腐皮鐮孢(Fusarium solani)BBA 64 953甘薯BBA 62 420f.pisi豌豆長亞月牙鐮孢(Fusarium subglutinans)三隔鐮孢
(Fusarium tricinctum)BBA 62 446紅三葉草Fusarium udumBBA 62 451木豆特別應提及的是Mintolyte Fusarium 菌株DSM 8938和DSM 8939，根據布達佩斯條約，將它們于1994年1月31日保藏于Brunswick Deutsche Sammlung für Mikroorganismen (DSM)(德國微生物保藏中心)。
應用從微生物中分離出的合成酶也可進行本方法。為此目的所需的恩鐮孢菌素合成酶，可采用文獻中已知的方法，從上述的鐮孢菌屬菌株中分離出(參見例如R.Pieper，H.Kleinkauf，R.Zocher，J.Antibiot.45(1993)pp.1273-1277。
鐮孢菌屬的真菌菌株是通過本身已知的方法，在適合的營養液存在下發酵的。這些營養液中含有真菌生長所需的鹽，以及碳源和氮源。
進行根據本發明方法的適合的無機鹽為所有的堿金屬鹽、堿土金屬鹽和周期表中第Ⅱ至Ⅷ副族元素的金屬鹽。
可述及的無機鹽的實例為鋰、鈉、鉀、銫、鎂、鈣、鋇、鋅、鎘、鈧、鈦、鋯、釩、鈮、鉻、鉬、錳、鐵、鈷或鎳的乙酸鹽、氯化物、溴化物、碘化物、氟化物、硝酸鹽、亞硝酸鹽、磷酸鹽、磷酸氫鹽、磷酸二氫鹽、亞磷酸鹽、亞磷酸氫鹽、硫酸鹽、硫酸氫鹽、亞硫酸鹽、亞硫酸氫鹽、碳酸鹽或碳酸氫鹽。
優選使用的物質為堿金屬，特別是鈉和鉀的乙酸鹽、鹵化物、磷酸鹽、磷酸氫鹽、磷酸二氫鹽、硝酸鹽;堿土金屬，特別是鎂和周期表中第Ⅱ、Ⅶ和Ⅷ副族金屬，例如鋅、錳和鐵的硫酸鹽。
進行本發明方法的碳源是碳水化合物類和含碳水化合物的產品。
可提及的碳源的實例為單糖類，如戊糖，特別是核糖、己糖，特別是葡萄糖和果糖;低聚糖類，如二糖類，特別是蔗糖、麥芽糖和乳糖;三糖類，特別是，棉子糖，以及四糖、五糖和多聚己糖。
優選使用單糖類，例如，己糖，特別是葡萄糖;低聚糖類，例如二糖類，特別是蔗糖。
進行本發明方法的適合的氮源為氨基酸和含氮鹽類。
可提及的氮源的實例為上述已提及的天然的和合成的氨基酸，或含氮鹽類如硝酸銨、亞硝酸銨，或上述已提及的金屬的硝酸鹽和亞硝酸鹽。
優選使用上面已提及的天然氨基酸，和含氮鹽類，如硝酸銨。
用于發酵方法的鐮孢菌屬菌種，首先通過本身已知的方法生長于由例如，糖漿/玉米漿組成的培養基中。在它們已經成熟后，通過孢子濾器分離形成的孢子。為了生產前培養物，將由碳源和無機鹽組成的鐮孢菌屬限定的培養基(FDM)用大約109個孢子接種并再度發酵。幾天后，用1ml前培養物接種可制備FDM主培養物，可按類似的方法進行發酵。
然后，在式(Ⅱ)至(Ⅳ)或(Ⅴ)和(Ⅵ)化合物存在下和在旋光的或外消旋的乳酸存在下，進行實際的發酵過程。
發酵時間為1至30天。發酵在+5℃至+40℃的溫度下進行，優選在+15℃至+35℃，特別優選在+25℃至+30℃的溫度下進行。本方法是在滅菌條件和大氣壓力下進行的。
為了進行本方法，一般使用濃度為5mM至50mM，優選5mM至15mM的式(Ⅴ)和(Ⅵ)化合物。
發酵結束后，將鐮孢菌屬培養物的菌絲體用抽吸的方式過濾出，用有機溶劑重復進行均漿提取，然后過濾。用常規的方式提取獲得的培養物濾液，干燥并在真空下濃縮。
通過柱色譜法或逆流分配法等常規方法，可純化所得到的粗恩鐮孢菌素類化合物。最佳方法必須根據各種具體情況而確定(還可參考制備實施例)。
如果在分離出的合成酶存在下進行本發明的方法，則該方法是在有金屬鹽類、S-腺苷-L-蛋氨酸(SAM)和三磷酸腺苷(ATP)存在下的含水的緩沖液系統中進行的。
可述及的金屬鹽為鋰、鈉、鉀、銫、鎂、鈣或鋇的乙酸鹽、氯化物、溴化物、碘化物、氟化物、硝酸鹽、磷酸鹽、磷酸氫鹽、亞磷酸鹽、亞磷酸氫鹽、硫酸鹽、硫酸氫鹽、亞硫酸鹽、亞硫酸氫鹽、碳酸鹽和碳酸氫鹽。
優選使用的鹽是堿土金屬鹽類，例如，氯化鎂、硫酸鎂或乙酸鎂。
本發明的方法是在含水的緩沖溶液中進行的。
可述及的緩沖溶液的實例為商業上可獲得的緩沖溶液，例如pH1.0的緩沖溶液，特別是甘氨酸/鹽酸緩沖液;pH2.0至4.0的緩沖液，特別是檸檬酸鹽/鹽酸緩沖液;pH5.0至6.0的緩沖液，特別是檸檬酸鹽/氫氧化鈉溶液的緩沖液;pH7.0的緩沖液，特別是磷酸鹽緩沖液;pH8.0的緩沖液，特別是硼酸鹽/鹽酸緩沖液;和pH9.0至10.0的緩沖液，特別是硼酸/氯化鉀/氫氧化鈉溶液的緩沖液。
本方法優選在“生理范圍”內，即在pH6.0至9.0操作，為此優選使用磷酸鹽緩沖液，特別是磷酸氫鉀/磷酸氫二鈉或磷酸氫鉀/磷酸氫二鉀緩沖液。
為了進行本方法，對100μg至1000μg，優選200μg至600μg的體外分離的恩鐮孢菌素合成酶，通常一起使用2mM至8mM，優選3mM至5mM的式(Ⅱ)至(Ⅵ)化合物、旋光的或外消旋的乳酸和S-腺苷-L-蛋氨酸(SAM)，3mM至9mM，優選4mM至6mM的三磷酸腺苷(ATP)，2mM至25mM，優選5mM至15mM的堿土金屬鹽，10mM至100mM，優選40mM至60mM的緩沖液。
體外酶催化合成的反應時間為2分鐘至24小時。體外酶催化合成是在0℃至+50℃，優選+10℃至+35℃，特別優選+20℃至+30℃的溫度范圍內進行的。
反應在6.5至8.5，優選在7.0至8.0的pH范圍內進行，整個反應過程中通過加入緩沖液使pH保持在恒定的7.3。
本方法優選在無菌反應條件下和在大氣壓力下進行。
通過用水稀釋可停止體外酶催化合成。
為進行處理，用有機溶劑反復提取水相，并將提取液干燥并在真空下濃縮。
通過柱色譜法或逆流分配法等常規方法，可純化所得到的粗恩鐮孢菌素類化合物。應再次提及的是，理想的方法必須根據各種具體情況而確定(還可參考制備實施例)。
制備實施例實施例1環(-N-甲基-L-纈氨酰-D-乳酰-N-甲基-L-纈氨酰-D-乳酰-N-甲基-L-纈氨酰-D-乳酰-)的制備
D-乳酸的體內結合將濃度為10mM的D-乳酸在滅菌條件下加入到蔗草鐮孢的2-天期主培養物中，再繼續發酵3天。然后抽吸過濾掉鐮孢菌屬培養物的菌絲體，并用乙酸乙酯提取濾液三次。在研缽中用丙酮將菌絲體均化兩次，并隨后對勻漿進行抽濾。將培養物的濾液，每次用100ml乙酸乙酯振蕩提取三次，并將合并的有機相與丙酮提取物一起蒸發至干。
另一種可選擇的方式是，可用大約兩倍于其體積的乙酸乙酯將全部鐮孢菌屬培養物提取過夜。
為了通過柱色譜法濃縮恩鐮孢菌素，將溶于少量氯仿中的粗恩鐮孢菌素加入到Al2O3柱(30×2cm)上并進行分階洗脫。
體外酶催化合成在4mM L-纈氨酸、4mM D-乳酸、4mM S-腺苷-L-蛋氨酸(SAM)、5mM三磷酸腺苷(ATP)和10mM MgCl2存在下，將在50mM的磷酸鹽緩沖液(pH7.3)中的300-500μg純化的恩鐮孢菌素合成酶，在28℃，以總體積為1.5ml保溫10分鐘。
加入2ml的水后，用每份2ml乙酸乙酯重復提取混合物。有機相用硫酸鈉干燥，然后在真空下濃縮。
通過a)或b)已獲得的產物用制備性HPLC(RP18/75-80%甲醇)提純。
1H NMR(400 MHz，CDCl3，δ)0.83;1.03(d，18H，3×-CH(CH3)2);1.45(d，9H，3×-O-CH-CH3);2.27(m，3H，3×-CH(CH3)2);3.06(s，9H，3×-N-CH3);4.43(d，3H，3×-N-CH-CO-);5.62(q，3H，3×-O-CH-CO-)ppm13C NMR(100 MHz，CDCl3，δ)16.5(3×-CH3，D-Lac);18.5;20.1(6×-CH3，MeVal);27.8(3×-CH(CH3)2，L-MeVal);32.9(3×-N-CH3，L-MeVal);63.1(3×-N-CH-CO-，L-MeVal);66.3(3×-O-CH-CO-，D-Lac);169.2(3×-C＝O，amide);169.8(3×-C＝O，酯)ppmEI MS m/z(%)555(M+，32);482(20);353(1);268(34);168(100);86(53)實施例2環(-N-甲基-L-異亮氨酰-D-乳酰-N-甲基-L-異亮氨酰-D-乳酰-N-甲基-L-異亮氨酰-D-2-羥基-異戊酰-)的制備
D-乳酸的體內結合將濃度為10mM的D-乳酸在滅菌條件下加入到接骨木鐮孢的2-天期主培養物中，再繼續發酵3天。然后抽吸過濾掉鐮孢菌屬培養物的菌絲體，并用乙酸乙酯提取濾液三次。在研缽中用丙酮將菌絲體均化兩次，并隨后對勻漿進行抽濾。將培養物的濾液，每次用100ml乙酸乙酯振蕩提取三次，并將合并的有機相與丙酮提取物一起蒸發至干。
如實施例1所述進行恩鐮孢菌素的濃縮和純化。
13C NMR (100 MHz，CDCl3)，δ)18.4;18.0(2×-CH3，D-HyIv);16.8;15.8(2×-CH3，D-Lac);16.7;15.3;11.4;10.6;10.3;10.0(6×-CH3，L-Melle);25.0;24.9;24.4(3×-CH2-，L-Melle);34.7;34.1;32.3(3×-CH(CH3)-，L-Melle);35.6;31.6;31.2(3×-N-CH3，L-Melle);29.9(-CH(CH3)2，D-HyIv);74.0;67.5;66.1(3×-O-CH-CO-，D-HyIv);65.1;60.5;59.5;(3×-N-CH-CO-，L-Melle);169.2;169.1;169.0(3×-C＝O，酰胺);170.6;170.1;169.8(3×-C＝O，酯)ppmEI MS m/z(%)625(M+，23);552(14);409(5);296(20);182(43);100(100)類似地，可制備下表1中所列示的LDLDLD立體異構體形式的通式(Ⅰ)化合物。
表1通式(Ⅰ)化合物的實例
a)13C NMR(100 MHz，CDCl3，δ);FAB-MS或EI MS m/z(%)孢子培養物、前培養物和主培養物所討論的鐮孢菌屬菌株在由糖漿/玉米漿(分別為30g和10g/1)組成的培養基中生長。
培養物在100rpm(26至28℃)條件下在500ml錐形燒瓶(100ml培養基)中生長。4至5天后，通過孢子過濾器分離已形成的孢子。這些孢子可在4℃下保存數周。
為了制備前培養物，用109個孢子接種含有200ml FDM(每升含75.0g蔗糖、12.75g NaNO3、15.0g NaCl、7.5g MgSO4-7H2O、4.0g KH2PO4-7H2O、10g ZnSO4)的燒瓶，并如上所述進行發酵。
2至3天后，每次用1ml前培養物作接種物制備FDM主培養物，并如上所述進行發酵。
生產恩鐮孢菌素的體外合成制備物首先對2-至3-天期的主培養物檢查其恩鐮孢菌素滴度，以確保細胞的合成活性。為此，在滅菌條件下取3至5ml培養物樣品，并每次用2ml乙酸乙酯重復提取。蒸發掉有機相后，直接用HPLC(RP18.80%甲醇)檢定恩鐮孢菌素。
在滅菌條件下用相應的羥基-或氨基酸前體處理所討論的主培養物至最終濃度為10mM，并如實施例1所述繼續發酵(全部發酵時間大約為1周)。
權利要求
1.應用鐮孢菌屬真菌菌株或從其中分離出的酶制備物制備含乳酸的、旋光的、具有18個環原子的環縮肽類化合物的方法。
2.從式(Ⅱ)、(Ⅲ)和(Ⅳ)的旋光的或外消旋的氨基酸和式(Ⅴ)和(Ⅵ)的旋光的或外消旋的2-羥基-羧酸和旋光的或外消旋的乳酸制備通式(Ⅰ)的含乳酸的、旋光的、具有18個環原子的環縮肽類化合物(恩鐮孢菌素類化合物)的方法， 其中R1、R2和R4彼此獨立地代表氫、具有最多達8個碳原子的直鏈或支鏈烷基、羥烷基、巰基烷基、烷硫基烷基、烷基亞磺酰基烷基、烷基磺酰基烷基、羧基烷基、烷氧羰基烷基、氨基甲酰基烷基、氨基烷基、烷基氨基烷基、二烷基氨基烷基、胍基烷基、具有最多達6個碳原子的直鏈或支鏈鏈烯基、具有最多達8個碳原子的環烷基、和任選取代的芳基烷基或雜芳基烷基，可提及的取代基為鹵素、羥基、烷氧基、烷基、硝基或氨基，R3和R5彼此獨立地代表氫、具有最多達8個碳原子的直鏈或支鏈烷基、羥烷基、巰基烷基、烷硫基烷基、烷基亞磺酰基烷基、烷基磺酰基烷基、具有最多達6個碳原子的直鏈或支鏈鏈烯基、具有最多達8個碳原子的環烷基、和任選取代的芳基烷基或雜芳基烷基、可提及的取代基為鹵素、羥基、烷氧基、烷基、硝基或氨基， 其中R1、R2和R4具有上述定義， 其中R3和R5具有上述定義，其特征在于，本反應是在鐮孢菌屬真菌菌株存在下在適合的營養液中或在從微生物中分離出的合成酶存在下在緩沖系統中進行的。
全文摘要
本發明涉及應用鐮孢菌屬真菌菌株或從其中分離出的酶制備物制備含乳酸的、旋光的、具有18個環原子的環縮肽類化合物的方法。
文檔編號A61K38/00GK1112932SQ9510228
公開日1995年12月6日 申請日期1995年2月23日 優先權日1994年2月24日
發明者P·杰斯克, A·哈德, N·曼克, H·克萊恩考夫, R·佐赫 申請人:拜爾公司