專利名稱：用家蠶絲素蛋白與貝殼粉末制備人工骨的方法
技術領域：
本發明涉及生物組織工程及生物材料技術領域，特別是涉及一種人工骨的制備方法， 具體說是一種以家蠶后部絲腺來源的絲素蛋白與貝殼粉末為材料制備人工骨的方法。
背景技術：
天然蠶絲由絲素蛋白與絲膠蛋白組成，其中，由于絲膠蛋白具有免疫原性，故限制了 蠶絲在生物組織工程領域的廣泛應用，因此，蠶絲在生物組織工程領域的應用中，通常是 以蠶絲脫膠的方法制備絲素蛋白。目前的脫膠工藝很難完全去除蠶絲中的絲膠蛋白，也就 是說，目前所采用的以蠶絲脫膠的方法所制備的絲素蛋白中必定有絲膠蛋白殘留。材料的 免疫原性問題是組織工程材料首先要避免的問題，所以，很有必要采用其他方法獲取沒有 殘留絲膠蛋白的絲素蛋白。有鑒于此，人們開始直接從家蠶的后部絲腺獲取絲素蛋白，這 種方法獲得的絲素蛋白中不含絲膠。這是因為，在家蠶體內，絲膠位于家蠶的中部絲腺， 絲素蛋白位于家蠶的后部絲腺，家蠶吐絲時，后部絲腺中的絲素蛋白經過中部絲腺并被絲 膠包裹后，經吐絲管壓絲區的擠壓最終形成天然蠶絲。
直接從家蠶后部絲腺提取絲素蛋白的方法由于可以獲得不含有絲膠蛋白的絲素蛋白 而具有其先進性。
絲素蛋白由于具有良好的生物相容性而被廣泛應用于組織工程領域，如人工血管、人 工神經、人工韌帶等。但是，絲素蛋白本身并不是一種十全十美的生物材料，所以，在通 常情況下，絲素蛋白需要與其他材料進行復合以制備復合材料，以滿足組織工程領域不同 研究及應用的需要。但是，到目前為止，用取自家蠶后部絲腺的絲素蛋白與貝殼粉末進行 復合以制備人工骨的研究還未見報道。

發明內容
本發明的目的在于提供一種人工骨的制備方法，該方法以家蠶后部絲腺來源的絲素蛋 白與貝殼粉末為材料制備。
本發明依次通過下列步驟實現 (1)后部絲腺來源絲素蛋白粉末的制備
取家蠶五齡幼蟲，取出后部絲腺，放入水相介質中，0-4'C下搖床或其他震動方式處 理6 12小時，過濾，制得絲素蛋白水相介質溶液，冷凍干燥后機械粉碎，篩分備用；(2) 貝殼粉末的制備 將背角無齒蚌貝殼去角質層，機械粉碎，篩分備用；
(3) 人工骨的制備
將絲素蛋白及貝殼粉末按1: 9 9: 1的質量比進行配伍，將此混合物在水相介質中
進行物理共混，在模具中成型，冷凍干燥后，在烘箱中6(TC條件下烘5分鐘，反復烘4 5 次，即獲得人工骨。
上述方法中，冷凍干燥為現有技術，冷凍溫度一般為-80'C,冷凍時間為20小時。 本發明方法獲得的人工骨為質地均一的蜂窩狀，孔隙率8-50%，孔徑10-100微米，彎 曲模量50-1000MPa,壓縮模量100-1200MPa，拉伸強度為1-100 MPa。同時，本發明方法 所制備的人工骨的孔隙率、孔徑大小及生物力學參數等，可以根據絲素蛋白及貝殼粉末的 比例進行調節。
本發明的優點是
本發明方法所制備的人工骨的孔隙率、孔徑大小及生物力學參數等，可以根據絲素蛋 白及貝殼粉末的比例進行調節，也可以通過人工骨的成型工藝來進行調節。因此，其壓縮、 彎曲、拉伸力學測試結果可以分別滿足人松質骨或密質骨的要求；其形態及幾何尺寸可以 根據臨床需求而改變，生物安全性符合國頒標準；本人工骨在30-160攝氏度范圍內，內部 結構穩定，也就是說，在人體溫度及濕熱滅菌溫度范圍內，其內部結構穩定。因此，本人 工骨對矯形外科臨床需求的適應范圍較廣。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發明方法進行詳細描述，下面的描述是為了進一步說明本發明， 而不構成對本發明的限定。
實施例l:柱狀密質骨型人工骨制備
(1) 后部絲腺來源絲素蛋白粉末的制備
取家蠶五齡幼蟲，取出后部絲腺，放入水相介質中，0-4"C下搖床處理6小時，過濾， 制得絲素蛋白水相介質溶液，冷凍干燥后機械粉碎，篩分備用；
(2) 貝殼粉末的制備 將背角無齒蚌貝殼去角質層，機械粉碎，篩分備用；
(3) 人工骨的制備
將絲素蛋白及貝殼粉末按1: 9的質量比進行配伍，將此混合物在水相介質中進行物
理共混，在模具中成型，冷凍干燥后，在烘箱中6(TC條件下烘5分鐘，反復烘4次，即獲得人工骨。
冷凍干燥溫度-80。C ，冷凍時間為20小時。
本柱狀密質骨型人工骨的幾何形態及尺寸
紡錘型，中空，兩端封閉，長3-50厘米，外徑1-6厘米，內徑0. 5-5厘米，壁厚0. 2-3 厘米，骨干及骨端質地均一，均為蜂窩狀結構。 性能檢測
(1) 采用掃描電鏡觀察其斷面結構。
(2) 孔隙率的測定
采用比重法，在室溫條件下測定選用一個比重瓶，加滿蒸餾水并稱質量(M1);把質
量為Ms的樣品浸入蒸餾水中，抽真空，使樣品中的氣體完全被蒸餾水取代，待比重瓶補
滿蒸餾水后稱質量(M2);將浸透了蒸餾水的樣品取出，稱剩余的蒸餾水與比重瓶的質量
(M3)。
計算公式e = (M2 - M3 - Ms) / (Ml - M3) X 100 %
(3) 力學性能檢測
將樣品在CMT6503型微機控制電子萬能試驗機上測試彎曲模量、壓縮模量和拉伸強度， 加載速度為lmm/min。
(4) 紅外光譜檢測
將樣品用KBr壓片。采用傅立葉變換紅外光譜儀(美國Nicolet公司)測定其在波數 4000 400cm-1的吸收光譜。
(5) DSC熱分析檢測
取樣品若干克，研磨，篩分(200目)，備用。用STA409PC型差熱分析儀對樣品在加熱 過程中的相變溫度(DSC)進行分析，分析條件為在氬氣保護氣氛中以10K/min的加熱速率 進行升溫原材料混合粉末從30。C加熱至60(TC;樣品粉末從30'C加熱至160°C。
(6) 生物安全性檢測
① 供試液準備
取樣品lg,生理鹽水中下浸提24h (37土rC)，常溫下8000rpm離心5min，取上清 液作為供試液備用，并將生理鹽水作為對照。
② 過敏性試驗
隨機抽取28只小白鼠，雌雄各半，分成七組，分別用已配制好的7種供試液，對七 組小白鼠進行腹腔注射，觀察15min內小白鼠有無爪搔鼻、噴嚏、豎毛、干嘔或咳嗽三聲以上、抽搐、呼吸困難、大小便失禁、休克和死亡等反應，并記錄結果；第3天，進行第 二次腹腔注射；第5天，進行第三次腹腔注射；第14天，進行第一次尾靜脈攻擊，觀察 15min內小白鼠的反應，并記錄結果；第15天、第16天、第17天陸續完成靜脈注射；第 19天，進行第二次尾靜脈攻擊。如兩次攻擊小白鼠均未出現明顯的上述過敏現象，即可認 為受試品不會引起過敏反應。
③ 動物急性(單劑量)毒性
隨機抽取32只小白鼠，雌雄各半，分成八組，分別用已配制好的7種供試液對七組 小白鼠進行靜脈注射，另外一組用生理鹽水作陰性對照。觀察小白鼠的生長情況，并記錄 小白鼠的體重。
④ 皮膚刺激試驗
隨機抽取28只小白鼠，雌雄各半，分成七組，分別用已配制好的7種供試液對七組 小白鼠進行試驗。在脊柱兩側各選3個2 3cm3面積的去毛區，將試驗樣品斑貼，左側3 點為供試液，右側3點為生理鹽水，用4層25mmX25mm紗布覆蓋，包扎固定。4h后除去 斑貼物，并標記斑貼部位，用溫水或70%乙醇清潔后吸干，觀察斑貼部位的反應。每12h 重復一次，連續7天，后續觀察7天，并記錄結果。
⑤ 溶血試驗
取2.0士0.2kg的白兔l只，自心臟取血20ml，用玻璃棒攪拌除去血塊，加入生理鹽 水7ml，肝素lml，混合后4。C下，2200rpm，離心10min，分離，棄去上清，用生理鹽水反 復離心清洗，直至上清不呈紅色，然后按所得紅細胞容積，用生理鹽水配成2%的懸液，即 用移液槍按0.2ml:9.8ml (血細胞生理鹽水)的比例配置。
添加順序供試液、生理鹽水，37。C水浴10min， 2%紅細胞懸液，37"水浴，觀察15min， 結果無棕色絮狀沉淀；然后1000rpm， 5min離心，取上清液，用UV-2100分光光度計測 定各吸收值，以生理鹽水為對照。
結果顯示內部結構為質地均一的蜂窩狀，孔隙率8-15%;孔徑10-30微米，彎曲模 量800-1000MPa，壓縮模量800-1200MPa，拉伸強度為80-100 MPa;紅外特征譜帶顯示， 其分子形態基本是無規巻曲結構；DSC檢測表明在16(TC的溫度范圍內只有水分的揮發，沒 有發生相的變化；生物安全性測試表明，樣品的安全性指標合格。
實施例2:板狀密質骨型人工骨制備 (1)后部絲腺來源絲素蛋白粉末的制備
取家蠶五齡幼蟲，取出后部絲腺，放入水相介質中，0-4"C下震動處理9小時，過濾，
6制得絲素蛋白水相介質溶液，冷凍干燥后機械粉碎，篩分備用；
(2) 貝殼粉末的制備 將背角無齒蚌貝殼去角質層，機械粉碎，篩分備用；
(3) 人工骨的制備
將絲素蛋白及貝殼粉末按1: 1的質量比進行配伍，將此混合物在水相介質中進行物 理共混，在模具中成型，冷凍干燥后，在烘箱中60'C條件下烘5分鐘，反復烘5次，即獲
得人工骨。
冷凍干燥溫度-80°C ，冷凍時間為20小時。
本板狀密質骨型人工骨的幾何形態及尺寸
板狀，長1-10厘米，寬l-5厘米，厚0.5-1厘米，內部質地均一，為蜂窩狀結構。 性能檢測同實施例1
結果顯示內部結構為質地均一的蜂窩狀，孔隙率15-30%;孔徑30-60微米，彎曲模 量400-800MPa，壓縮模量400-800MPa，拉伸強度為40-80 MPa;紅外特征譜帶顯示，其分 子形態基本是無規巻曲結構；DSC檢測表明在16(TC的溫度范圍內只有水分的揮發，沒有發 生相的變化；生物安全性測試表明，樣品的安全性指標合格。
實施例3:塊狀松質骨型人工骨制備
(1) 后部絲腺來源絲素蛋白粉末的制備
取家蠶五齡幼蟲，取出后部絲腺，放入水相介質中，0-4'C下搖床處理12小時，過濾， 制得絲素蛋白水相介質溶液，冷凍干燥后機械粉碎，篩分備用；
(2) 貝殼粉末的制備
將背角無齒蚌貝殼去角質層，機械粉碎，篩分備用；
(3) 人工骨的制備
將絲素蛋白及貝殼粉末按9: 1的質量比進行配伍，將此混合物在水相介質中進行物
理共混，在模具中成型，冷凍干燥后，在烘箱中6(TC條件下烘5分鐘，反復烘5次，即獲 得人工骨。
冷凍干燥溫度-80°C，冷凍時間為20小時。 本塊狀松質骨型人工骨的幾何形態及尺寸
塊狀，長5-IO厘米，寬5-IO厘米，厚5-IO厘米，內部質地均一，為蜂窩狀結構。 性能檢測同實施例l
結果顯示內部結構為質地均一的蜂窩狀，孔隙率30-50%;孔徑60-100微米，彎曲模量50-400MPa，壓縮模量100-400MPa，拉伸強度為卜40 MPa;紅外特征譜帶顯示，其分 子形態基本是無規巻曲結構；DSC檢測表明在16(TC的溫度范圍內只有水分的揮發，沒有發 生相的變化；生物安全性測試表明，樣品的安全性指標合格。
權利要求
1、一種用家蠶絲素蛋白與貝殼粉末制備人工骨的方法，其特征在于，依次通過下列步驟實現(1)后部絲腺來源絲素蛋白粉末的制備取家蠶五齡幼蟲，取出后部絲腺，放入水相介質中，0-4℃下搖床或其他震動方式處理6～12小時，過濾，制得絲素蛋白水相介質溶液，冷凍干燥后機械粉碎，篩分備用；(2)貝殼粉末的制備將背角無齒蚌貝殼去角質層，機械粉碎，篩分備用；(3)人工骨的制備將絲素蛋白及貝殼粉末按1∶9～9∶1的質量比進行配伍，將此混合物在水相介質中進行物理共混，在模具中成型，冷凍干燥后，在烘箱中60℃條件下烘5分鐘，反復烘4～5次，即獲得人工骨。
全文摘要
一種用家蠶絲素蛋白與貝殼粉末制備人工骨的方法，以家蠶后部絲腺來源的絲素蛋白與貝殼粉末為材料制備。所制備的人工骨的孔隙率、孔徑大小及生物力學參數等，可以根據絲素蛋白及貝殼粉末的比例進行調節，也可以通過人工骨的成型工藝來進行調節，在30-160攝氏度范圍內，內部結構穩定，其生物安全性符合國頒標準。因此，所制備的人工骨對矯形外科臨床需求的適應范圍較廣。
文檔編號A61L27/22GK101549173SQ200910103809
公開日2009年10月7日 申請日期2009年5月8日 優先權日2009年5月8日
發明者代時春, 佳 劉, 彬 劉, 水 徐, 惠 李 申請人:西南大學