專利名稱：用于治骨質疏松癥和肥胖的OGP-rhLeptin融合蛋白及編碼該融合蛋白的核酸的制作方法
技術領域：
本發明涉及ー種融合蛋白及編碼該融合蛋白的核酸。
背景技術：
老年人骨質疏松發病率較高，全球有2億骨質疏松患者，并且女性多于男性。根據世界衛生組織(WHO)的標準，美國國家健康和營養調查(NHANES III，1988 1994年)結果表明，骨質疏松嚴重影響老年人生活質量，50歲以上人群中，1/2的女性、1/5的男性在他們的一生中都會出現骨質疏松性骨折，一旦患者經歷了第一次骨質疏松性骨折，繼發性骨折的危險明顯加大。中國老年人居于世界首位，現有骨質疏松癥患者9000萬，占總人口的7. 1%。隨著社會老齡化的進程，骨質疏松癥的發病率呈上升趨勢，預計到2050年將增加到2. 21億，那時全世界一半以上的骨質疏松性骨折將發生在亞洲，絕大部分在中國。有學者 對1995 1996年美國骨質疏松、心肌梗死、卒中和乳腺癌的年發生數進行調查顯示，每年發生骨質疏松性骨折150萬次，其中椎體骨折70萬次，腕部骨折20萬次，髖部骨折30萬次，其它骨折30萬次。肥胖與骨量關系臨床觀察表明，肥胖與骨密度(BMD)提高有夫。肥胖是骨量的保護因素，超重和肥胖的婦女絕經后較同齡非超重婦女骨量高且骨丟失較慢。體重下降是絕經早期骨丟失的危險因素，提高體重指數可減緩絕經后骨丟失。但肥胖也常常引發高血糖、高血壓、高血脂、高血粘、高尿酸、高胰島素血癥、冠心病、腦卒中、下肢靜脈曲張、脂肪肝、膽石癥、睡眠呼吸暫停癥、糖尿病、痛風癥及關節炎，是很多疾病的誘因之一。

發明內容
本發明既要降低肥胖者的體重，使之遠離高血糖、高血壓、高血脂、高血粘、高尿酸、高胰島素血癥、冠心病、腦卒中、下肢靜脈曲張、脂肪肝、膽石癥、睡眠呼吸暫停癥、糖尿病、痛風癥及關節炎等風險；同時又增加其骨量，避免骨質疏松的發生，而提供的一種用于治骨質疏松和肥胖的OGP-rhLeptin融合蛋白及編碼該融合蛋白的核酸。本發明用于治骨質疏松和肥胖的OGP-rhLeptin融合蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO 2所示。本發明上述用于治骨質疏松和肥胖的OGP-rhLeptin融合蛋白的核酸序列如SEQID NO 1 所示。本發明OGP-rhL印tin融合蛋白采用人為改造的L印tin和成骨生長肽基因編碼翻譯而成。具有降低使用者體重，并防治骨質疏松的效果。本發明用于治骨質疏松和肥胖的OGP-rhL印tin融合蛋白微生物制劑，不產生拮抗反應，使用安全。
具體實施方式
本發明技術方案不局限于以下所列舉具體實施方式
，還包括各具體實施方式
間的任意組合。
具體實施方式
一本實施方式用于治骨質疏松和肥胖的OGP-rhLeptin融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。本實施方式用于治骨質疏松和肥胖的OGP-rhLeptin融合蛋白的核酸序列如SEQID NO 1所示，該核酸序列由生物工程公司合成，制成含有融合蛋白的核酸的質粒載體pUC(0GP/0bese，)。將pUC (0GP/0bese’)載體用BamH I和EcoR I雙酶切出來(酶切反應體系如表I所示，酶切反應在37°C條件下反應10h，然后1. 5%瓊脂糖凝膠電泳，目的片段用DNAGEL EXTRACTION KIT純化回收)，并用BamHI和EcoR I雙酶切pGEX_6P_l (酶切反應體系如表2所示，酶切反應在37°C條件下反應10h，然后0. 6%瓊脂糖凝膠電泳，目的片段用DNAGEL EXTRACTION KIT純化回收)；再將本實施方式用于治骨質疏松和肥胖的OGP-rhL印tin融合蛋白的DAN片段(0GP/0bese’)與經過雙酶切的載體pGEX_6P_l的連接(連接反應體系 如表3所示)。表I
pUC (OGP/Obese，)20 ^il
IOXM buffer6[il
「 nBamHX3u,l___
EcoR I3(j,l
不含 DNA 酶的 ddH2028(^1表2
載體 pGEX-6P-l20(.1l
10XM buffer6 pi
BamUl3}il_；_
KcoR I3‘ul
不含DNA酶的ddH2028^1表3
雙酶切的載體pGEX-6P-l3 ^il
融合蛋白的DNA片段\3^\~10 X T4 DNA 連接酶 buffer20 T4 DNA連接酶20
融合蛋白的DAN片段與載體pGEX-6P-l 16°C放置連接過夜，得到載體pGEX_0GP/Obese’ ；然后將載體pGEX-OGP/Obese’轉化到大腸桿菌BL21 (DE3)中，選擇陽性重組子命名為大腸桿菌 BL21 (DE3-0GP/0bese，)。載體pGEX-6P-l上不含有Kpn I酶切位點，本實施方式合成的pGEX-OGP/Obese’均能為Kpn I單酶切開,說明本實施方式用于治骨質疏松和肥胖的OGP-rhLeptin融合蛋白基因成功導入質粒PGEX-6P-1中。隨機挑取大腸桿菌BL21 (DE3-0GP/0bese> )菌落37°C過夜培養，提取質DNA，用Kpn I進行單酶切，并用相應的空白質粒PGEX-6P-1作為對照，將含有Kpn I酶切位點的質粒進行基因測序。測序工作委托生物公司進行，大腸桿菌BL21 (DE3-0GP/0beSe’)內含有SEQ ID NO 1 所示 DNA。將大腸桿菌BL21 (DE3-0GP/0bese，)置于LB培養基30°C環境條件下培養18h，然后采用GST標簽融合蛋白法進行蛋白的分離純化，本實施方式用于治骨質疏松和肥胖的OGP-rhLeptin融合蛋白的純度為98%，融合蛋白的表達量為38. 7%。本實施方式融合蛋白(OGP-rhLeptin融合蛋白)治療骨質疏松實驗取雌性SD大鼠在無菌條件下摘除雙側卵巢，12周后取存活健康大鼠40只，隨機分為5組(陽性對照組1、陽性對照組2、融合蛋白實驗組和陰性對照組)，每組8只。另取雌性SD大鼠切除雙側一小塊脂肪，12周后隨機取存活健康大鼠8只作為假手術對照組。共計6組，分別口服以下藥物假手術對照組質量濃度為0. 5%的CMC-Na溶液，灌胃劑量為5ml/kg ；陰性對照組質量濃度為0. 5%的CMC-Na溶液，灌胃劑量為5ml/kg ；融合蛋白實驗組質量濃度為0. 5%的OGP-rhLeptin融合蛋白溶液，灌胃劑量為5ml/kg ；(獲得的用于治療骨質疏松和血栓的OGP-rhLeptin融合蛋白用無菌水溶解)陽性對照組1:阿侖膦酸鈉(Alen) 5mg/kg ；陽性對照組2 :質量濃度為0. 5%的OGP蛋白溶液，灌胃劑量為5ml/kg。陽性對照組3 :質量濃度為0. 5%的rhL印tin溶液，灌胃劑量為5ml/kg。連續給藥三個月，處死后取大鼠股骨頭，浸入4%戊二醛中固定，用牙科金剛石鋸將股骨頭矢面鋸開，取其一片，經清洗，10%次氯酸鈉浸泡6h，超聲清洗15min，乙醇梯度脫水，乙醚浸泡，干燥，離子濺射鍍膜，SX-40掃描電鏡觀察，加速電壓20kV。觀察骨質疏松治療對比實驗結果，實驗結果見表4，結果表明融合蛋白實驗組、陽性對照組I和陽性對照組2都具有治療骨質疏松的作用，且融合蛋白實驗組的效果最好。表4骨小梁寬度的比較和骨面積(X土SD)
權利要求
1.用于治骨質疏松和肥胖的OGP-rhLeptin融合蛋白，其特征在于用于治骨質疏松和肥胖的OGP-rhLeptin融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。
2.編碼權利要求1用于治骨質疏松和肥胖的OGP-rhLeptin融合蛋白的核酸，其特征在于該核酸的序列如SEQ ID N0:1所示。
全文摘要
用于治骨質疏松和肥胖的OGP-rhLeptin融合蛋白及編碼該融合蛋白的核酸，它涉及一種融合蛋白及編碼該融合蛋白的核酸。解決目前尚無同時有效治療骨質疏松和肥胖藥品的缺陷。用于治骨質疏松和肥胖的OGP-rhLeptin融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。該融合蛋白核酸的序列如SEQ ID NO1所示。本發明可用于醫藥領域。
文檔編號A61P19/10GK103012598SQ201210585618
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月31日 優先權日2012年12月31日
發明者余瓊 申請人:黑龍江大學