專利名稱：注射用重組卵泡抑素制劑及制備方法
技術領域：
本發明涉及卵泡抑素，尤其涉及一種注射用重組卵泡抑素制劑及其制備方法。
背景技術：
卵泡抑素(Follistatin)是1987年由Robertson和Ueno分別從牛和豬的卵泡液中分離出的一種富含半胱氨酸的糖基化單鏈多肽，對卵泡刺激素有較強的抑制作用。卵泡抑素分布較為廣泛，在不同組織中均能檢測到卵泡抑素。目前發現卵泡抑素至少有32KD，35KD,39KD三種不同的分子形式。卵泡抑素(Follistatin)作為Activin的結合蛋白，它可以通過Activin/Follistatin系統來調節動物的生殖活動。近年來的實驗表明，卵泡抑素可以通過其作用系 統，參與機體多種生理機能的調節，對卵巢顆粒細胞分化、胚胎發育、紅細胞生成和成骨細胞功能的調節均起重要的作用，具有重要的生物學意義。卵泡抑素(Follistatin)可用于治療肌肉疾病和病癥，尤其是肌肉組織的增加將有利于治療的疾病，也可用于治療與代謝、脂肪組織及骨變性相關的疾病和病癥。

發明內容
本發明解決的技術問題是克服現有技術存在的上述缺陷，提供一種表達量高、活性高、純化工藝簡單的重組卵泡抑素制備工藝；以及一種不含保護劑和防腐劑、有效期長的注射用重組卵泡抑素制劑配方。本發明的目的是通過以下技術方案實現的一種注射用重組卵泡抑素制劑，所述制劑包含重組卵泡抑素的凍干粉、甘露醇、甘氨酸。根據上述的制劑，優選的，所述制劑以每支計算包含I. 0-5. Omg重組卵泡抑素的凍干粉；1% _5%重量百分比的甘露醇；O. 2%-1%重量百分比的甘氨酸。根據上述的制劑，優選的，所述制劑以每支計算包含2mg±0. 2mg重組卵泡抑素的凍干粉；1%重量百分比的甘露醇；O. 2%重量百分比的甘氨酸。本發明的目的還通過以下技術方案實現的上述的制劑的制備方法，所述制備方法包括以下步驟(Al)建立菌種庫取出原始菌種，在kan抗性的LB平板上劃線，并在恒溫箱培養，挑取單克隆菌于LB液體培養基中，振蕩若干時間，取菌液和等量滅菌甘油混勻，分裝并保存；傳代若干次后，菌種應重新激活培養保存；
(A2)種子液培養；從保存的菌種管子用接種環在kan抗性LB平板上劃線，培養若干時間，挑取單克隆到LB液體培養基中，在恒溫搖床上培養至0D600為O. 4-0. 8之間；(A3)發酵培養；在發酵培養基中培養，并以一定速度補料，當0D600為7-12時，加入IPTG誘導劑，繼續發酵培養若干時間后，終止培養；(A4)收集和破碎菌體；收集菌體誘導完的菌液用離心機離心；破碎菌體將離心后菌體用緩沖液懸浮均勻，使用細胞破碎機進行碎菌，再用離心機離心，收集上清液，即粗制重細卵泡抑素蛋白溶液； (A5)目的蛋白純化將所述上清液通過親和層析柱，用包含不同濃度咪唑的緩沖液進行清洗，洗脫的為重組蛋白粗制品；再通過陰離子交換柱，用包含不同濃度Nacl的緩沖液進行清洗，洗脫的為重組蛋白精制品；(A6)濃縮半成品通過過濾系統去除多余的鹽和水，將液體濃縮至合適的體積，加入1-5 %甘露醇和
O.2-1 %甘氨酸，混合均勻后過濾，即制成重組卵泡抑素半成品；(A7)冷凍干燥將所述重組卵泡抑素半成品稀釋，分裝于西林瓶中，在冷凍干燥機上進行凍干處理若干時間，最后進行壓蓋、封口處理。根據上述的制備方法，可選地，所述步驟(Al)進一步包括如下步驟(BI)菌種進行以下鑒定，鑒定合格后投入生產形態特征觀察將所述菌種劃線于kan抗性的LB平板，并培養，觀察菌種克隆是否具有大腸桿菌典型的形狀特征，是否有雜菌生長；表達量檢測挑取單克隆菌，接種于l_3ml含kan的LB液體培養基，30_45°C搖床振蕩1-5小時，檢測0D600為O. 4-0. 6時，加入IPTG誘導，繼續振蕩3_4小時后收菌，經過SDS-PAGE檢測蛋白表達量；質粒檢查抽取質粒DNA，用限制性內切酶雙酶切，檢查酶切圖譜與原始酶切圖譜
是否一致。根據上述的制備方法，優選的，所述步驟(Al)進一步包括以下步驟從_70°C冰箱取出原始菌種，在kan抗性的LB平板上劃線，37°C恒溫箱培養16小時，挑取單克隆菌于LB液體培養基中，37°C搖床振蕩12小時，取菌液和等量30%滅菌甘油混勻，使甘油終濃度為15%。用滅菌后的1.5ml EP管分裝數管，保存于-70°C冰箱。傳代3次后，菌種應重新激活培養保存。根據上述的制備方法，優選的，所述步驟(A2)進一步包括以下步驟從保存的菌種管子用接種環在kan抗性LB平板上劃線，在37°C培養16小時，挑取單克隆到LB液體培養基中，在恒溫搖床上培養至0D600為O. 4-0. 8之間，即可用來接種發酵培養使用。根據上述的制備方法，優選的，所述步驟(A3)中，發酵培養基配方為
酵母提取物(Yeast)5g/L蛋白胨(Typtone)10g/L氯化鈉(NaCl)10g/L補料培養基配方為酵母提取物(Yeast)50g/L蛋白胨(Typtone)100g/L甘油(glycerole)50g/L ；發酵條件37°C培養，以200ml/小時速度補料，當0D600為7-12時，加入IPTG誘導劑，濃度為O. 5mM，繼續發酵培養4小時后，終止培養。根據上述的制備方法，優選的，所述步驟(A4)中，誘導完的菌液用大容量冷凍高速離心機，5000rpm/min，4°C離心10分鐘，收集菌體；破碎菌體將離心后菌體，用lxPBS、pH7. 4緩沖液懸浮均勻，冰浴條件下使用超聲波細胞破碎機進行碎菌，20分鐘后，用大容量冷凍高速離心機，10000rpm/min，4°C離心10分鐘，收集上清即為粗制重組卵泡抑素蛋白溶液。根據上述的制備方法，優選的，所述步驟(A5)中，重組蛋白粗純化將粗制的重組蛋白通過鎳離子親和層析柱，用包含不同濃咪唑的緩沖液進行清洗，最終洗脫的為重組蛋白粗制品；重組蛋白精細純化將重組蛋白粗制品通過Q-Sepharose陰離子交換柱，用包含不同濃度Nacl的緩沖液進行清洗，最終洗脫的為重組蛋白精制品。根據上述的制備方法，優選的，所述步驟(A6)中，超濾濃縮半成品將重組蛋白精制品通過Millipore超濾系統,去除多余的鹽和水，將液體濃縮至合適的體積，加入1%甘露醇和O. 2%甘氨酸，混合均勻后用O. 22um過濾器過濾，即制成重組卵泡抑素半成品。根據上述的制備方法，優選的，所述步驟(A7)中，分裝，冷凍干燥將重組卵泡抑素半成品稀釋成合適的濃度，分裝于3ml西林瓶中，每瓶Iml液體，隨后在冷凍干燥機上進行凍干處理，整個升溫過程不超過30°C，24小時后凍干結束，進行壓蓋，封口處理。與現有技術相比，本發明具有以下有益效果I、得到的重組卵泡抑素純度> 95%,每一劑量所含重組卵泡抑素為2mg左右，是因為臨床最佳用量是50ug/kg ；2、得到的重組卵泡抑素比活性高，實驗結果表明，比活性大于7000IU/mg ；3、生產工藝簡單，產物收率高，生產成本低。


參照附圖，本發明的公開內容將變得更易理解。本領域技術人員容易理解的是這些附圖僅僅用于舉例說明本發明的技術方案，而并非意在對本發明的保護范圍構成限制。圖中圖I本發明實施例I的制備方法的流程圖。
具體實施例方式圖I和以下說明描述了本發明的可選實施方式以教導本領域技術人員如何實施和再現本發明。為了教導本發明技術方案，已簡化或省略了一些常規方面。本領域技術人員應該理解源自這些實施方式的變型或替換將在本發明的范圍內。本領域技術人員應該理解下述特征能夠以各種方式組合以形成本發明的多個變型。由此，本發明并不局限于下述可選實施方式，而僅由權利要求和它們的等同物限定。實施例I :圖I示意性地給出了本發明實施例的注射用重組卵泡抑素制劑制備方法的流程圖，如圖I所示，所述制備方法包括以下步驟(Al)建立菌種庫
取出原始菌種，在kan抗性的LB平板上劃線，并在恒溫箱培養，挑取單克隆菌于LB液體培養基中，振蕩若干時間，取菌液和等量滅菌甘油混勻，分裝并保存；傳代若干次后，菌種應重新激活培養保存；(A2)種子液培養；從保存的菌種管子用接種環在kan抗性LB平板上劃線，培養若干時間，挑取單克隆到LB液體培養基中，在恒溫搖床上培養至0D600為O. 4-0. 8之間；(A3)發酵培養；在發酵培養基中培養，并以一定速度補料，當0D600為7-12時，加入IPTG誘導劑，繼續發酵培養若干時間后，終止培養；(A4)收集和破碎菌體；收集菌體誘導完的菌液用離心機離心；破碎菌體將離心后菌體用緩沖液懸浮均勻，使用細胞破碎機進行碎菌，再用離心機離心，收集上清液，即粗制重組卵泡抑素蛋白溶液；(A5)目的蛋白純化將所述上清液通過親和層析柱，用包含不同濃度咪唑的緩沖液進行清洗，洗脫的為重組蛋白粗制品；再通過陰離子交換柱，用包含不同濃度Nacl的緩沖液進行清洗，洗脫的為重組蛋白精制品；(A6)濃縮半成品通過過濾系統去除多余的鹽和水，將液體濃縮至合適的體積，加入1-5%甘露醇和
0.2-1 %甘氨酸，混合均勻后過濾，即制成重組卵泡抑素半成品；(A7)冷凍干燥將所述重組卵泡抑素半成品稀釋，分裝于西林瓶中，在冷凍干燥機上進行凍干處理若干時間，最后進行壓蓋、封口處理。上述制備方法制得的注射用重組卵泡抑素制劑，所述制劑包含重組卵泡抑素的凍干粉、甘露醇、甘氨酸。優選的，所述制劑以每支計算包含
1.0-5. Omg重組卵泡抑素的凍干粉；1%-5%重量百分比的甘露醇；O. 2% -I %重量百分比的甘氨酸。實施例2
根據實施例I所述的制劑及制備方法的應用例，在該應用例中，所述制備方法具體過程為(Al)菌種庫的建立從_70°C冰箱取出原始菌種，在kan抗性的LB平板上劃線，37°C恒溫箱培養16小時，挑取單克隆菌于LB液體培養基中，37°C搖床振蕩12小時，取菌液和等量30%滅菌甘油混勻，使甘油終濃度為15%。用滅菌后的1.5ml EP管分裝數管，保存于-70°C冰箱。傳代3次后，菌種應重新激活培養保存。每批生產菌種應進行以下鑒定后，鑒定合格后防可投入生產，具體方式為形態特征觀察將上述菌種劃線于kan抗性的LB平板，37°C培養16小時后，觀察菌種克隆是否具有大腸桿菌典型的形狀特征，是否有雜菌生長。表達量檢測挑取單克隆菌，接種于2ml含kan的LB液體培養基，37°C搖床振蕩3小時，檢測0D600為O. 4-0. 6時，加入IPTG誘導，繼續振蕩3_4小時后收菌，經過SDS-PAGE檢測蛋白表達量。質粒檢查抽取質粒DNA，用限制性內切酶雙酶切，檢查酶切圖譜與原始酶切圖譜
是否一致。(A2)種子液培養從保存的生產菌種，接種于含有kan抗性的LB平板上，37°C培養16小時后，挑取單克隆到LB液體培養基中，在恒溫搖床上培養至0D600為O. 4之間，即可用來接種發酵培養使用。(A3)發酵培養3. I發酵用培養基成份3. I. I基礎發酵培養基溶液(I升)酵母提取物(Yeast) 5g蛋白胨(Typtone)IOg氯化鈉(NaCl)IOg3. 1.2補料培養基溶液(I升)酵母提取物(Yeast)50g蛋白胨(Typtone)IOOg甘油(glycerole)50g3. 2發酵罐的滅菌和種子液的接種往IOL發酵罐中加入6升基礎發酵培養基，蒸汽滅菌，121°C維持20分鐘，冷卻發酵罐溫度到發酵溫度后，再按I : 10接入種子液。發酵條件發酵溫度和時間37°C培養，以200ml/小時的速度添加補料培養基，當0D600為7時，加入IPTG誘導劑，濃度為O. 5mM，繼續發酵培養4小時后，終止發酵培養。培養基總量約7升通氣量保持發酵液中溶氧大于40%攪拌速度250rpm酸堿度6·5-7·0發酵要求整個發酵過程必須無菌操作，發酵完畢，必須清洗發酵罐內壁和攪拌器。(A4)收集菌體發酵終止后，放出菌液，在大型冷凍離心機上以5000rpm/min，4°C離心10分鐘，收集菌體，離心上清液舍棄，將濕菌體稱重，-20°C保存。菌體破碎取濕菌體，用IxPBS緩沖液按I : 10比例懸浮(菌體與緩沖液比例為
I 20)，冰浴條件下用超聲波細胞破碎儀進行破菌，10000rpm/min，4°C離心20分鐘，收集上清即為可溶的卵泡抑素蛋白粗制品溶液。(A5)重組卵泡抑素蛋白的分離純化卵泡抑素蛋白粗制品的制備及初步純化菌體裂解后，10000rpm/min，4°C離心20分鐘，收集上清即為可溶的卵泡抑素粗制品。將卵泡抑素蛋白粗制品通過Ni離子層析柱結合蛋白，再用含有不同濃度咪唑的緩沖液處理，去除大部分雜蛋白，得到初步純化的卵泡抑
素蛋白。卵泡抑素蛋白粗制品的精細純化從此步驟開始，所有配制緩沖溶液所需的水、無機鹽試劑和相關容器需為無熱源或醫用級。將上一步驟得到的初步純化的卵泡抑素蛋白，經過平板超濾系統處理，除去溶液中的鹽分并適當縮小體積，再用Q-Sepharose Fast Flow陰離子交換柱純化，用包含O. 5M NaCl的20mM磷酸鹽緩沖液洗脫，收集卵泡抑素蛋白，此步驟是為了進一步純化目的蛋白并去除蛋白溶液中的內毒素。(A6)超濾濃縮半成品將Q-Sepharose Fast Flow陰離子交換柱洗脫得到的蛋白溶液，用Millipore超濾濃縮系統，去除多余的鹽和水，將蛋白溶液濃縮至合適的體積，力口入1%甘露醇和O. 2%甘氨酸，混合均勻后用O. 22um過濾器過濾，即制成重組卵泡抑素半成
品O(A7)分裝，冷凍干燥將重組卵泡抑素半成品用超純水稀釋到濃度為2mg/ml，分裝于3ml西林瓶中，每瓶Iml液體，隨后在冷凍干燥機上進行凍干處理，整個升溫過程不超過30°C，24小時后凍干結束，進行壓蓋，封口處理，保存于4°C。最終每支針劑含有2mg的重組卵泡抑素凍干粉，其余由20mg甘露醇和4mg甘氨酸組成，使用前用Iml注射用水溶解。分裝,凍干,壓蓋,封口的處理的過程都必須在無菌條件下進行，凍干后的制品水份含量低于3%，同機一次凍干的制品作為一批。根據上述制備方法制得的制劑，以每支計算包含2. 0mg±0. 2mg重組卵泡抑素的凍干粉；1%重量百分比的甘露醇；O. 2%重量百分比的甘氨酸。根據本發明實施例I達到的益處在于得到的重組卵泡抑素純度> 95% ;得到的重組卵泡抑素比活性高，實驗結果表面，比活性大于7000IU/mg ;生產工藝簡單，產物收率高,生產成本低。實施例3:根據實施例I所述的制劑及制備方法的應用例，在該應用例中，所述制備方法具體過程為(Al)菌種庫的建立從_70°C冰箱取出原始菌種，在kan抗性的LB平板上劃線，37°C恒溫箱培養16小時，挑取單克隆菌于LB液體培養基中，37°C搖床振蕩12小時，取菌液和等量30%滅菌甘油混勻，使甘油終濃度為15%。用滅菌后的1.5ml EP管分裝數管，保存于-70°C冰箱。傳代3次后，菌種應重新激活培養保存。每批生產菌種應進行以下鑒定后，鑒定合格后防可投入生產，具體方式為形態特征觀察將上述菌種劃線于kan抗性的LB平板，37°C培養16小時后，觀察菌種克隆是否具有大腸桿菌典型的形狀特征，是否有雜菌生長。表達量檢測挑取單克隆菌，接種于2ml含kan的LB液體培養基，37°C搖床振蕩3小時，檢測0D600為O. 4-0. 6時，加入IPTG誘導，繼續振蕩3_4小時后收菌，經過SDS-PAGE檢測蛋白表達量。質粒檢查抽取質粒DNA，用限制性內切酶雙酶切，檢查酶切圖譜與原始酶切圖譜
是否一致。 (A2)種子液培養從保存的生產菌種，接種于含有kan抗性的LB平板上，37°C培養16小時后，挑取單克隆到LB液體培養基中，在恒溫搖床上培養至0D600為O. 8之間，即可用來接種發酵培養使用。(A3)發酵培養3. I發酵用培養基成份3. I. I基礎發酵培養基溶液(I升)酵母提取物(Yeast) 5g蛋白胨(Typtone)IOg氯化鈉(NaCl)IOg3. 1.2補料培養基溶液(I升)酵母提取物(Yeast)50g蛋白胨(Typtone)IOOg甘油(glycerole)50g3. 2發酵罐的滅菌和種子液的接種往IOL發酵罐中加入6升基礎發酵培養基，蒸汽滅菌，121°C維持20分鐘，冷卻發酵罐溫度到發酵溫度后，再按I : 10接入種子液。發酵條件發酵溫度和時間37°C培養，以200ml/小時的速度添加補料培養基，當0D600為12時，加入IPTG誘導劑，濃度為O. 5mM，繼續發酵培養4小時后，終止發酵培養。培養基總量約7升通氣量保持發酵液中溶氧大于40%攪拌速度250rpm酸堿度6·5-7·0發酵要求整個發酵過程必須無菌操作，發酵完畢，必須清洗發酵罐內壁和攪拌器。(Α4)收集菌體發酵終止后，放出菌液，在大型冷凍離心機上以5000rpm/min，4°C離心10分鐘，收集菌體，離心上清液舍棄，將濕菌體稱重，-20°C保存。菌體破碎取濕菌體，用IxPBS緩沖液按I : 10比例懸浮(菌體與緩沖液比例為I 20)，冰浴條件下用超聲波細胞破碎儀進行破菌，10000rpm/min，4°C離心20分鐘，收集上清即為可溶的卵泡抑素蛋白粗制品溶液。(A5)重組卵泡抑素蛋白的分離純化卵泡抑素蛋白粗制品的制備及初步純化菌體裂解后，10000rpm/min，4°C離心20分鐘，收集上清即為可溶的卵泡抑素粗制品。將卵泡抑素蛋白粗制品通過Ni離子層析柱結合蛋白，再用含有不同濃度咪唑的緩沖液處理，去除大部分雜蛋白，得到初步純化的卵泡抑
素蛋白。卵泡抑素蛋白粗制品的精細純化從此步驟開始，所有配制緩沖溶液所需的水、無機鹽試劑和相關容器需為無熱源或醫用級。將上一步驟得到的初步純化的卵泡抑素蛋白，經過平板超濾系統處理，除去溶液中的鹽分并適當縮小體積，再用Q-Sepharose Fast Flow陰離子交換柱純化，用包含O. 5M NaCl的20mM磷酸鹽緩沖液洗脫，收集卵泡抑素蛋白，此步 驟是為了進一步純化目的蛋白并去除蛋白溶液中的內毒素。(A6)超濾濃縮半成品將Q-Sepharose Fast Flow陰離子交換柱洗脫得到的蛋白溶液，用Millipore超濾濃縮系統，去除多余的鹽和水，將蛋白溶液濃縮至合適的體積，力口入5%甘露醇和I %甘氨酸，混合均勻后用O. 22um過濾器過濾，即制成重組卵泡抑素半成
品O(A7)分裝，冷凍干燥將重組卵泡抑素半成品用超純水稀釋到濃度為2mg/ml，分裝于3ml西林瓶中，每瓶Iml液體，隨后在冷凍干燥機上進行凍干處理，整個升溫過程不超過30°C，24小時后凍干結束，進行壓蓋，封口處理，保存于4°C。最終每支針劑含有2mg的重組卵泡抑素凍干粉，其余由20mg甘露醇和4mg甘氨酸組成，使用前用Iml注射用水溶解。分裝,凍干,壓蓋,封口的處理的過程都必須在無菌條件下進行，凍干后的制品水份含量低于3%，同機一次凍干的制品作為一批。根據上述制備方法制得的制劑，以每支計算包含5. 0mg±0. 2mg重組卵泡抑素的凍干粉；5%重量百分比的甘露醇；I %重量百分比的甘氨酸。上述實施例僅是示例性地給出了時間、轉速、含量等參數的數值，如每支制劑含有的重組卵泡抑素的凍干粉的量為2、5mg，當然還可以是其它處于數值范圍內的數值，如Img0這對于本領域內的技術人員來說，實施效果是可以預料到的，是能夠實現本發明的目的的。
權利要求
1.一種注射用重組卵泡抑素制劑，所述制劑包含 重組卵泡抑素的凍干粉、甘露醇、甘氨酸。
2.根據權利要求I所述的制劑，其特征在于所述制劑以每支計算包含 I.0-5. Omg重組卵泡抑素的凍干粉； 1% _5 %重量百分比的甘露醇； O.2% -I%重量百分比的甘氨酸。
3.根據權利要求I所述的制劑，其特征在于所述制劑以每支計算包含2mg±0.2mg重組卵泡抑素的凍干粉； 1%重量百分比的甘露醇； O.2%重量百分比的甘氨酸。
4.根據權利要求1-3任一所述的制劑的制備方法，所述制備方法包括以下步驟 (Al)建立菌種庫 取出原始菌種，在kan抗性的LB平板上劃線，并在恒溫箱培養，挑取單克隆菌于LB液體培養基中，振蕩若干時間，取菌液和等量滅菌甘油混勻，分裝并保存；傳代若干次后，菌種應重新激活培養保存； (A2)種子液培養；從保存的菌種管子用接種環在kan抗性LB平板上劃線，培養若干時間，挑取單克隆到LB液體培養基中，在恒溫搖床上培養至0D600為O. 4-0. 8之間； (A3)發酵培養； 在發酵培養基中培養，并以一定速度補料，當OD600為7-12時，加入IPTG誘導劑，繼續發酵培養若干時間后，終止培養； (A4)收集和破碎菌體； 收集菌體誘導完的菌液用離心機離心； 破碎菌體將離心后菌體用緩沖液懸浮均勻，使用細胞破碎機進行碎菌，再用離心機離心，收集上清液，即粗制重組卵泡抑素蛋白溶液； (A5)目的蛋白純化 將所述上清液通過鎳離子親和層析柱，用包含不同濃度咪唑的緩沖液進行清洗，洗脫的為重組蛋白粗制品； 再通過陰離子交換柱，用包含不同濃度Nacl的緩沖液進行清洗，洗脫的為重組蛋白精制品; (A6)濃縮半成品 通過過濾系統去除多余的鹽和水，將液體濃縮至合適的體積，加入1-5 %甘露醇和O.2-1 %甘氨酸，混合均勻后過濾，即制成重組卵泡抑素半成品； (A7)冷凍干燥 將所述重組卵泡抑素半成品稀釋，分裝于西林瓶中，在冷凍干燥機上進行凍干處理若干時間，最后進行壓蓋、封口處理。
5.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于所述步驟(Al)進一步包括如下步驟 (BI)菌種進行以下鑒定，鑒定合格后投入生產 形態特征觀察將所述菌種劃線于kan抗性的LB平板，并培養，觀察菌種克隆是否具有大腸桿菌典型的形狀特征，是否有雜菌生長；表達量檢測挑取單克隆菌，接種于l_3ml含kan的LB液體培養基，30-45°C搖床振蕩1-5小時，檢測0D600為O. 4-0. 6時，加入IPTG誘導，繼續振蕩3_4小時后收菌，經過SDS-PAGE檢測蛋白表達量；質粒檢查抽取質粒DNA，用限制性內切酶雙酶切，檢查酶切圖譜與原始酶切圖譜是否—致。
6.根據權利要求4所述的制備方法其特征在于所述步驟(Al)進一步包括以下步驟從_70°C冰箱取出原始菌種，在kan抗性的LB平板上劃線，37°C恒溫箱培養16小時，挑取單克隆菌于LB液體培養基中，37°C搖床振蕩12小時，取菌液和等量30%滅菌甘油混勻，使甘油終濃度為15% ;用滅菌后的I. 5ml EP管分裝數管，保存于_70°C冰箱；傳代3次后，菌種應重新激活培養保存。
7.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于所述步驟(A2)進一步包括以下步驟從保存的菌種管子用接種環在kan抗性LB平板上劃線，在37°C培養16小時，挑取單克隆到LB液體培養基中，在恒溫搖床上培養至0D600為O. 4-0. 8之間，即可用來接種發酵培養使用。
8.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于所述步驟(A3)中，發酵培養基配方為酵母提取物(Yeast) 5g/L蛋白胨(Typtone) 10g/L氯化鈉(NaCl)10g/L補料培養基配方為酵母提取物(Yeast) 50g/L蛋白胨(Typtone) 100g/L甘油(glycerole) 50g/L ；發酵條件37°C培養，以200ml/小時速度補料，當0D600為7_12時，加入IPTG誘導劑，濃度為0. 5mM,繼續發酵培養4小時后，終止培養。
9.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于所述步驟(A4)中，誘導完的菌液用大容量冷凍高速離心機，5000rpm/min，4°C離心10分鐘，收集菌體；破碎菌體將離心后菌體，用lxPBS、pH7. 4緩沖液懸浮均勻，冰浴條件下使用超聲波細胞破碎機進行碎菌，20分鐘后，用大容量冷凍高速離心機，10000rpm/min，4°C離心10分鐘，收集上清即為粗制重組卵泡抑素蛋白溶液。
10.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于所述步驟(A5)中，重組蛋白粗純化將粗制的重組蛋白通過鎳離子親和層析柱，用包含不同濃咪唑的緩沖液進行清洗，最終洗脫的為重組蛋白粗制品；重組蛋白精細純化將重組蛋白粗制品通過Q-Sepharose陰離子交換柱,用包含不同濃度Nacl的緩沖液進行清洗，最終洗脫的為重組蛋白精制品。
11.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于所述步驟(A6)中，超濾濃縮半成品將重組蛋白精制品通過Millipore超濾系統，去除多余的鹽和水，將液體濃縮至合適的體積，加入I %甘露醇和O. 2 %甘氨酸，混合均勻后用O. 22um過濾器過濾，即制成重組卵泡抑素半成品。
12.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于所述步驟(A7)中， 分裝，冷凍干燥將重組卵泡抑素半成品稀釋成合適的濃度，分裝于3ml西林瓶中，每瓶Iml液體，隨后在冷凍干燥機上進行凍干處理，整個升溫過程不超過30°C，24小時后凍干結束，進行壓蓋，封口處理。
全文摘要
本發明公開了注射用重組卵泡抑素制劑配方和制備工藝，每支制劑含a)1.0-5.0mg重組卵泡抑素的凍干粉；b)1％-5％甘露醇；c)0.2％-1％甘氨酸。本發明還公開了上述制劑的制備方法及該制劑的用途。本發明具有表達量高，活性高，純化工藝簡單等優點。
文檔編號A61K47/18GK102920992SQ20121037780
公開日2013年2月13日 申請日期2012年9月28日 優先權日2012年9月28日
發明者楊威威, 雷振松, 劉瑩, 朱振洪, 陳展志 申請人:杭州康邦生物醫藥科技有限公司