專利名稱：：黃芩復合免疫增強劑及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
：本技術屬水產養殖病害防控
技術領域：
，尤其涉及一種養殖甲殼類免疫增強劑的制備和應用方法。
背景技術：
：海水經濟蟹類是我國海水養殖的重要組成部分，我國養殖的海水蟹類主要品種為鋸緣青蟹(^c;^hserrateForskal)和梭子蟹(尸0rto/7"s邵)，屬甲殼綱(fr"Wac朋)、十足目("ec，w/s)、梭子蟹科(尸or^/77jVae)，廣泛分布于我國東部沿海各省及日本、印度、東南亞、澳大利亞、南非等海域，是我國重要的海洋經濟蟹類，也是重要的出口創匯品種。近年來，我國海水蟹類養殖業迅速發展，2006年我國鋸緣青蟹和梭子蟹養殖面積達76，277萬公頃，占海水蟹養殖面積的95%以上，兩者總產量達22萬噸左右。其中鋸緣青蟹產量達到10.85萬噸，占世界總養殖產量的88.14%，是世界第一青蟹養殖大國。此外，我國的凡納濱對虹(&^/e/7aei^ra/M，eie)(俗稱南美白對蝦)和脊尾白蝦(firo/ah/^/cari"ca〃^Holthuis)(又稱小白蟲下)是我國重要的經濟養殖蟲下類，其中南美白對蝦的養殖產量為全部經濟甲殼類養殖之首，脊尾白蝦在沿海養殖中占有重要的地位。隨著海水蟹養殖的規模化發展，病害日益成為養殖發展的主要障礙。近年來，青蟹和梭子蟹先后發生了較為嚴重的疾病，其中養殖青蟹平均發病率為13.77%左右，平均死亡率5.43%，每年造成2億余元的經濟損失。疾病也給養殖梭子蟹造成了極大的經濟損失。目前病害控制上，主要采用藥物為主的控制手段，費用較高，抗菌藥物的大量使用還導致養殖蟹藥物殘留、耐藥菌株產生等一系列問題，極大地影響了養殖蟹蝦的品質。
發明內容為了解決上述的水產養殖中存在的技術問題，本發明的一個目的是提供一種黃芩復合免疫增強劑，其不僅具有良好的殺蟲作用，還可以大幅提高青蟹對弧菌感染的抵抗水平，增強甲殼動物的免疫力。本發明的第二個目的是提供上述的黃芩復合免疫增強劑的制備方法。本發明的第三個目的是提供上述的黃岑復合免疫增強劑制成的新劑型。為了實現上述的第一個目的，本發明采用了以下的技術方案黃芩復合免疫增強劑，該復合免疫增強劑包括黃芩提取物或黃芩苷與左旋咪唑，黃芩提取物或黃芩苷與左旋咪唑的重量份數如下黃芩提取物或黃芩苷24份"左旋咪唑2.55份。作為最優選，黃芩提取物或黃芩苷與左旋咪唑的重量份數如下黃芩提取物或黃芩苷2.5份左旋咪唑3份。上述的黃芩苷(Baicalin)別名黃芩甙，購自國內廠家，產品的黃芩苷含量不低于95%，其余特征符合中國藥典2005版(I部)的要求。上述的黃芩提取物可以采用以下的方法①取炒黃芩，充分粉碎后，加蒸餾水浸泡過夜；②煎煮沸騰30min,補水，再煎煮沸騰30min，用紗布濾去藥渣，取上清液；③補水，同步驟②煎煮和濾去藥渣，再煎煮兩兩次；④將3次煮出的藥液進一步煎煮濃縮，過濾除去顆粒，取澄清濾出液；⑤加入NaOH，再加3倍體積95%乙醇，劇烈振蕩；⑥靜置后，8000r/min離心15min，得褐色沉淀；⑦加入水重新溶解沉淀，離心除去不溶物，再加NaOH及3倍體積95%乙醇，同歩驟，重復兩次，干燥得黃芩提取物制品。當然，黃芩提取物的制備方法應不限于與上述方案，對于現有中藥提取的方法，本發明均可以適用。為了實現上述的第二個目的，本發明的黃芩復合免疫增強劑的制備方法，取黃芩提取物或黃芩苷和左旋咪唑用攪拌機充分混合，陰涼避光處保存。為了實現上述的第三個目的，本發明采用了以下的技術方案一、黃芩復合免疫增強注射劑，該注射劑采用上述任意一個技術方案所述的黃芩復合免疫增強劑，加入蒸餾水溶解，再加入Na2C03溶液助溶，攪拌或振蕩，然后用生理鹽水稀釋，所述的黃芩復合免疫增強劑占總重量百分比濃度為0.5°/。4.0%，優選的濃度為1%4.0%。二、黃芩復合免疫增強飼料，該飼料包括上述任意一個技術方案所述的黃芩復合免疫增強劑和面粉，黃芩復合免疫增強劑采用Na2C03溶液助溶后與面粉或面粉和餌料魚混合，所述的黃芩復合免疫增強劑占總重量百分比為4.5%10.0%;或者，按每噸飼料加入0.2kg1.0kg所述的黃芩復合免疫增強劑的用量制成顆粒伺料。本發明的黃芩復合免疫增強劑用于制備預防或治療養殖甲売類傳染性疾病的藥物或飼料中的應用；或者，本發明的黃芩復合免疫增強劑用于制備提高養殖甲殼類免疫力的藥物或伺料中的應用。作為優選，所述的傳染性疾病為病原性傳染性疾病。優選的病原性疾病為白斑綜合征病毒感染、血卵渦鞭蟲感染以及其他纖毛蟲、弧菌的感染引起的病原性疾病。優選的養殖甲殼類為青蟹、梭子蟹、南美白對蝦或脊尾白蝦。發明人在中草藥免疫增強劑的廣泛篩選基礎上，發現黃芩提取物對青蟹有較好的免疫增強作用，可全面增強青蟹血清主要免疫指標，提高青蟹血清對弧菌的殺滅能力。青蟹體內測定表明黃芩提取物對青蟹血清酚氧化酶、超氧化物歧化酶、堿性磷酸酶等免疫相關酶類有良好的增強作用，可增強青蟹血清的抗弧菌水平，增強青蟹血細胞吞噬率，并可大幅提高青蟹對弧菌感染的抵抗水平。生產性試驗表明黃芩提取物可提高青蟹抗病力，減少秋季和越冬期青蟹發病高峰的青蟹死亡率，通過注射和投喂均可達到較好的效果，其中注射適合于越冬階段青蟹增強免疫力和疾病預防，而添加到飼料中比較適合于養殖過程中發病高峰的疾病控制。考慮到目前大部分地區的海水蟹類養殖多采用自然海區捕獲的魚蝦等鮮活餌料，因此發明者設計分別建立了鮮活餌料和顆粒飼料中添加免疫增強劑的方法。發明人在對黃芩提取物的研究中發現，黃芩提取物的主要成份是黃芩苷，實驗室和生產性應用試驗表明市售黃芩苷對青蟹有同樣的免疫增強作用。研究闡明了黃芩提取物的主要活性成份，并使免疫增強劑的規模化生產和應用成為可能。此外，對蝦白斑綜合征病毒(WSSV)和血卵渦鞭蟲是青蟹、梭子蟹病害的主要病原，而左旋咪唑不但是一種重要的殺蟲藥物，還有增強甲殼動物的免疫力。發明者的研究表明左旋咪唑與黃芩苷在促進酚氧化酶活性方面還有一定的協同作用。發明者確定了黃芩提取物的主要活性成份是黃芩苷，并確定了黃岑苷與左旋咪唑對青蟹的免疫激活劑量，確定了黃芩與左旋咪唑的最佳配比濃度。并根據青蟹養殖生產現狀建立了注射法、拌料法和顆粒飼料加工法等三種免疫增強劑'使用途徑，分別適用于不同養殖時期的青蟹。試驗還表明，該免疫增強劑還可添加到飼料中，應用于南美白對蝦和脊尾白蝦的用于南美白對蝦和脊尾白蝦的疾病預防和控制。本發明的黃芩復合免疫增強劑可用于以下幾個方面的疾病控制1)養殖塘青蟹的疾病預防和控制引起青蟹發病死亡的主要原因有白斑綜合征病毒(WSSV)感染、血卵渦鞭蟲感染以及其他纖毛蟲、弧菌的繼發感染等，疾病高發季節為每年9-10月，這期間水溫適合水體病原菌的繁殖，加上雨水、晝夜氣溫變化等造成青蟹較大的應激反應，自身抵抗力較差。本發明的黃芩復合免疫增強劑對這一時期青蟹疾病有良好的預防和控制作用。由于這一期間養殖青蟹上多投喂鮮活餌料，可采用復合免疫增強劑與鮮活餌料拌勻后投喂方法。在發病高峰前，可以投喂添加復合免疫增強劑的顆粒餌料，連續投喂3-5天，有良好的防病效果。2)越冬期青蟹病害的預防和控制越冬期是青蟹死亡的另一高峰，這一時期青蟹進食較少，在青蟹放養前采用肌肉注射復合免疫增強劑是一個可以考慮的方法。也可在青蟹進越冬池前將復合免疫增強劑添加飼料連續投喂青蟹3-4天，以提高越冬青蟹的抗病力。3)南美白對蝦和脊尾白蝦疾病的預防控制南美白對蝦和脊尾白蝦疾病的主要疾病是白斑綜合征病毒(wssv)和各類弧菌等，水質惡化也可成為疾病發生的誘因。研究表明復合免疫增強劑對南美白對蝦和脊尾白蝦有較好的疾病預防和控制效果，采用復合免疫增強劑添加的顆粒飼料投喂養殖蝦，可取得良好的控制效果。具體實施例方式實施例l一、黃芩提取物從中藥材炒黃芩中提取，具體制備方法如下①從中藥店購買炒黃苓，取炒黃芩100g，充分粉碎后，加蒸餾水500mL4°C浸泡過夜；②將黃芩浸泡物用煎煮沸騰30min，補水250mL，再煎煮沸騰30min，用紗布濾去藥渣，取上清液；③濾出藥渣加水250ml，同②煎煮和濾去藥渣，再煎煮兩次；將3次煮出的藥液合并，進一步煎煮濃縮至100mL，過濾除去顆粒，取澄清濾液；⑤在澄清濾出液中加入O.5MNaOH2mL，再加3倍體積95%乙醇，劇烈振蕩；靜置4h后，8000r/min離心15min，得褐色沉淀；⑦加入50mL水重新溶解沉淀，離心除去不溶物，再加O.5MNaOHlmL及3倍體積95%乙醇，同⑤離心沉淀，重復兩次，干燥得黃芩提取物制品。賣施例2黃芩復合免疫增強劑的制備方法取上實施例l中制備的黃芩提取物干品2.5份，左旋咪唑3份，用攪拌機充分混合，陰涼避光處保存。左旋咪唑為獸用鹽酸左旋咪唑(levamisolehydrochloride),購自國內廠家，其特征符合中國獸藥典2005版(I部)的要求。實施例3鑒于黃芩提取物主要成份為黃芩苷，故也可用黃芩替代黃芩提取物。黃芩復合免疫增強劑的制備方法取黃芩苷2.5份，左旋咪唑3份，用攪拌機充分混合，陰涼避光處保存。黃芩苷(Baicalin)別名黃芩甙，購自國內廠家，產品的黃芩苷含量不低于95%，其余特征符合中國藥典2005版(I部)的要求。實施例4黃芩復合免疫增強劑的制備方法取上實施例l中制備的黃芩提取物干品4.0份，左旋咪唑2份，用攪拌機充分混合，陰涼避光處保存。實施例5黃芩復合免疫增強劑的制備方法取黃芩苷4.0份，左旋咪唑2份，用攪拌機充分混合，陰涼避光處保存。實施例6復合免疫增強劑的肌肉注射對青蟹和其他蟹類的肌肉注射按下述方法進行1)取實施例27制備得到的黃芩復合免疫增強劑12g，用20mL蒸餾水溶解，加入lmL0.1M的Na2C03溶液，攪拌或振蕩至基本溶解，補水至IOOmL;2)將溶解免疫增強劑用0.2"m滅菌過濾器過濾除菌，無菌保存于4"C備用；3)使用前，應將免疫增強劑溶液用25。C水浴預熱，用25'C水浴預熱的生理鹽水將免疫增強劑溶液稀釋5倍；注射劑量按青蟹得蟹的平均體重。按100g青蟹0.2mL劑量注射青蟹步足基部，注射前后注射部分均用酒精棉消毒；4)注射完畢后將青蟹暫養觀察O.5-lh，無異常后可放回養殖池中。實施例7復合免疫增強劑與鮮活餌料拌勻后投喂取實施例27制備得到免疫增強劑50g，用水100mL溶解，加入O.5mL0.1MNa2C03溶液助溶，與餌料魚100kg混合，加入面粉0.51kg充分混勻，投喂青蟹。實施例8復合免疫增強劑顆粒詞料制備方法按每噸飼料添加0.5kg實施例27制備得到免疫增強劑的用量制成顆粒飼料，可根據投喂對象分別采用青蟹、南美白對蝦或脊尾白蝦的基礎飼料，分別用于青蟹、南美白對蝦、脊尾白蟲下的疾病預防中。試驗例l:越冬期鋸緣青蟹的疾病預防控制試驗本實施方案與結果取自發明者越冬試驗數據，試驗方法和結果簡述如下1)試驗設復合黃芩復合免疫增強劑組和對照組，分別注射復合黃芩增強劑10組(實施例2)和生理鹽水，劑量按
發明內容3肌肉注射法進行。根據蟹的體重不同，各組在步足與背面交界處注射免疫多糖O.15—0.3mL，每組注射30只青蟹，注射后將青蟹放養于300cmX200cmX150cm網箱中；試驗期間水溫為10±2°C，鹽度為19.5%。。注射后8、16、24、32d取樣3只，抽取青蟹血淋巴液，測定青蟹血清的相關免疫指標。2)結果表明青蟹注射黃芩復合免疫增強劑后，血清堿性磷酸酶(ALP)和超氧化物歧化酶(SOD)活力均顯著高于對照組，其中ALP水平32d后未見明顯下降，S0D活力可維持16d，血清氧化酶(POD)和酚氧化酶(PO)活力也顯著升高，其中P0比對照提高了176。/。，表明免疫增強劑有顯著的免疫增強作用。統計使用免疫增強劑組和對照組的成活率，結果見表l。由表可見，養殖45d后免疫增強劑組的成活率為82%，對照組為61%，免疫組比對照組有顯著提高。表1免疫增強劑對鋸緣青蟹存活率的影響存活情況(45d)免疫增強劑組對照組~"宛亡個數/只^~~^存活個數/只2518存活率82%61%試驗例2越冬期鋸緣青蟹的疾病預防控制生產性試驗本實施方案與結果取自發明者越冬生產性試驗數據，試驗方法和結果簡述如下試驗在蛇蟠島振華養殖公司進行，該公司為大規模越冬養殖應用試點，采用室內水泥池養殖模式，試驗期間水溫為15±2°C，鹽度為19.5%。。試驗組注射黃芩復合免疫增強劑(實施例2)，對照不注射，養殖注射15d后測定相關免疫指標，統計養殖30d各組青蟹的存活率。結果見表2。表2免疫增強劑在鋸緣青蟹生產性越冬池中的應用結果免疫指標CIS-2對照ALP/U/mL0.420.30PO/U/mL62.7819.80SOD/U,/mL1612.001140.90蛋白含量mg/mL121.60103.10SOD比活U/mgprot13.2611.07抗菌活力/U/mL0.140.14存活率88%59%由表可見，注射黃芩復合免疫增強劑組，15d后血清各免疫指標比對照組有明顯提高，其中以血清中酚氧化酶(PO)、超氧化物歧化酶(SOD)和堿性磷酸酶(ALP)最為明顯，注射30d后免疫增強劑組青蟹存活率88。/。，對照組的存活率僅為59°/。。表明免疫增強劑可顯著提高青蟹越冬的成活率。^驗例3黃芩復合免疫增強劑在青蟹和脊尾白蝦疾病預防控制中的效果本實施結果取自發明者制備免疫增強劑添加顆粒飼料結果。試驗方法和結果簡述如下取黃芩苷2.5份、左旋咪唑3份混合而成的復合免疫增強劑，按每噸飼料0.5kg添加量添加至飼料中，基礎詞料采用南美白對蝦料配方，制備為顆粒飼料。生產使用量為每20畝大小蟹塘發病高峰前投喂飼料20kg，于早上投喂，連續投喂3-5d。調査使用者的效果。結果見表3。表3免疫增強劑詞料在秋季發病高峰青蟹或脊尾白蝦養殖中的應用結果編號養殖種類效果簡述有效性l上市青蟹存活提高SI~"2青蟹、脊尾白蟲下混養白蝦、青蟹發病減少有效3青蟹、脊尾白蝦混養白蝦、青蟹發病減少有效<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>注下午投料。由表可見，投喂黃芩復合免疫增強劑飼料后，7個養殖點的青蟹或脊尾白蝦死亡有明顯減少，捕捉上市青蟹的活力也明顯增強。由于試驗池前期，除一青蟹單養池外，均以投喂魚蟲下等鮮活餌料為主，為增加養殖品種的攝食，要求養殖戶在早上投喂飼料，下午投喂鮮活餌料。其中一個失敗的養殖戶，可能原因為前期己明顯發病，又錯在下午投料，養殖品種不能及時進食免疫增強飼料，反而造成殘餌污染水體，加劇了疾病。由本試驗可以認為，添加免疫增強劑的顆粒飼料可用于青蟹和脊尾白蝦發病高峰時候的疾病預防和控制。4青蟹、脊尾白蝦混養5青蟹、脊尾白蝦混養6青蟹單養7脊尾白蝦為主小計一權利要求1.黃芩復合免疫增強劑，其特征在于該復合免疫增強劑包括黃芩提取物或黃芩苷與左旋咪唑，黃芩提取物或黃芩苷與左旋咪唑的重量份數如下黃芩提取物或黃芩苷2～4份左旋咪唑2.5～5份。2.根據權利要求1所述的黃芩復合免疫增強劑，其特征在于黃芩提取物或黃苓苷與左旋咪唑的重量份數如下黃芩提取物或黃芩苷2.5份左旋咪唑3份。3.根據權利要求1或2所述的黃芩復合免疫增強劑，其特征在于黃苓提取物的'制備方法如下①取炒黃芩，充分粉碎后，加蒸餾水浸泡過夜；②煎煮沸騰30min，補水，再煎煮沸騰30min，用紗布濾去藥渣，取上清液；③補水，同步驟②煎煮和濾去藥渣，再煎煮兩兩次；④將3次煮出的藥液進一步煎煮濃縮，過濾除去顆粒，取澄清濾出液；⑤加入NaOH，再加3倍體積95%乙醇，劇烈振蕩；靜置后，8000r/min離心15min，得褐色沉淀；⑦加入水重新溶解沉淀，離心除去不溶物，再加NaOH及3倍體積95X乙醇，'同步驟⑤離心沉淀，重復兩次，干燥得黃苓提取物制品。4.根據權利要求1或2所述的黃岑復合免疫增強劑的制備方法，其特征在于該方法如下取黃芩提取物或黃芩苷和左旋咪唑用攪拌機充分混合，陰涼避光處保存。5.黃芩復合免疫增強注射劑，其特征在于該注射劑采用權利要求1或2所述的黃岑復合免疫增強劑，加入蒸餾水溶解，再加入Na2C03溶液助溶，攪拌或振蕩，然后用生理鹽水稀釋，所述的黃芩復合免疫增強劑占總重量百分比濃度為0.5%4.0%。6.黃芩復合免疫增強飼料，其特征在于該詞料包括權利要求1或2所述的黃芩復合免疫增強劑和面粉或面粉、餌料魚，黃芩復合免疫增強劑采用Na2C03溶液助溶后與面粉或面粉、餌料魚混合，所述的黃芩復合免疫增強劑占總重量百分比為4.5%10.0%;或者，按每噸飼料加入0.2kgL0kg權利要求1或2或3所述的黃芩復合免疫增強劑的用量制成顆粒詞料。7.根據權利要求1或2所述的黃芩復合免疫增強劑用于制備預防或治療養殖甲殼類傳染性疾病的藥物或飼料中的應用。8.根據權利要求7所述的黃芩復合免疫增強劑用于制備預防或治療養殖甲殼類病原性疾病的藥物或飼料中的應用，其特征在于所述的傳染性疾病為病原性傳染性疾病。9.根據權利要求7所述的黃芩復合免疫增強劑用于制備預防或治療養殖甲殼類病原性疾病的藥物或飼料中的應用，其特征在于所述的傳染性疾病為白斑綜合征病毒感染、血卵渦鞭蟲感染以及其他纖毛蟲、弧菌的感染引起的病原性疾病。10.根據權利要求7所述的黃芩復合免疫增強劑用于制備預防或治療養殖甲殼類傳染性疾病的藥物或飼料中的應用，其特征在于所述的養殖甲殼類為青蟹、梭子蟹、南美白對蝦或脊尾白蝦。全文摘要本技術屬水產養殖病害防控
技術領域：
，尤其涉及一種養殖甲殼類免疫增強劑的制備和應用方法。黃芩復合免疫增強劑，該復合免疫增強劑包括2～4份黃芩提取物或黃芩苷與2.5～5份左旋咪唑。該復合免疫增強劑可有效增強養殖青蟹非特異性免疫力，提高青蟹血清酚氧化酶、超氧化物歧化酶和堿性磷酸酶活力，提高青蟹對白斑綜合征病毒、弧菌和血卵渦鞭蟲等常見病原的抗病力。本復合免疫增強劑可通過注射或添加到青蟹鮮活餌料、顆粒飼料中應用于青蟹養殖中，用于青蟹發病高峰期的疾病預防和控制，降低青蟹發病率和死亡率。本免疫增強劑添加到飼料中用于南美白對蝦和脊尾白蝦的疾病預防和控制。文檔編號A61K36/539GK101642488SQ20091010157公開日2010年2月10日申請日期2009年8月17日優先權日2009年8月17日發明者問劉,潘清清,邱慶連,冬錢申請人:浙江省淡水水產研究所