專利名稱：一種雞胚多糖的片劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及藥物制劑領域，具體涉及一種從雞胚中提取出的多糖的片劑。
背景技術：
世界衛生組織報告顯示，2008年全世界約有1270萬癌癥新增患者，760萬死于癌癥，尤其在發展中國家，癌癥新增例數達56%，據推測到2020年前，全球癌癥發病率將增加50%，即每年將新增1500萬癌癥患者。不僅如此，癌癥的死亡人數也在全球迅猛上升，2030年這個數字可能會增至1320萬。因此，癌癥治療藥物的研究關系到肝癌患者和全社會切身利益，一直是醫藥行業的·研究熱點，具有重要的社會意義。從治療手段上來說，癌癥的治療主要是外科治療、放射、化療、生物與綜合治療等。癌癥外科主要是癌切除、局部栓塞治療等。切除和栓塞的治療方法適用于界限清楚、遠離大血管的腫瘤，而且手術切除的預后差、五年存活率低。移植需要解決的主要問題在于免疫排斥反應，后者往往成為患者和社會重大的經濟負擔，成功率也只有50%左右，5年存活率也很低。放療和化療對正常細胞也有殺傷作用，其特點是專一性差、副作用巨大，在殺傷腫瘤細胞的同時也極大地干擾機體的正常功能，不利于長期用藥。正由于癌癥缺乏有效控制方法，患者的預后極差。平均5年存活率低。因此，尋找腫瘤細胞特異性的藥物是科學界始終關注的焦點。腫瘤免疫治療的方法有非特異性免疫治療和特異性免疫治療。過去，人們在腫瘤免疫研究中過于強調特異性抗原和特異性免疫系統，免疫學的進展加深了人們對免疫系統抗腫瘤功能及免疫治療作用重要性的認識。近年的研究表明，非特異性免疫系統的重要性開始得到了認同。現在，人們認識到，與不能對自身組織產生良好免疫應答的特異性免疫系統形成鮮明對照的是，非特異性免疫系統具有很強的能力來消除單個畸變的自身細胞。這意味著非特異性免疫系統具有在單個細胞水平消除可能發展成為腫瘤細胞的早期遺傳變異的潛能。迪威立克抗腫瘤作用主要是通過對單核巨噬細胞系統強大而持久的刺激，引起巨噬細胞(Mcp)增生、活化、吞噬功能增強、誘導分泌腫瘤壞死因子(TNF-a)、干擾素(IFN-y)、白細胞介素(IL-2)、活性氧(H202、N0)等癌細胞殺傷因子及增強NK細胞殺傷活性，達到抑制和殺傷腫瘤細胞及病原微生物的目的，且可通過促進造血多能干細胞分化為單核巨噬細胞，進一步調動機體免疫系統蘊藏抗癌、殺菌潛力。由于免疫調節的全身作用強，副作用少且輕特異性強的特點，適用范圍逐漸增加，安全性較其他類別的藥物具備明顯的提聞。本發明研制的雞胚尿囊液和雞胚提取的多糖屬于免疫調節類產品。免疫調節是指在免疫反應中，各種免疫細胞及其亞群間，細胞與各種細胞因子間存在著的刺激與抑制，或正相與負相兩方面作用構成的互相制約的調節網絡，完成對抗原的識別和反應。這種調節作用對維護機體免疫功能的穩定和動態平衡十分重要。本發明的申請人申請了一種抗腫瘤生物多糖(申請號201310093593.6)，公開了雞胚多糖的制備方法，為了使雞胚多糖更好的應用于臨床，并最大限度保持多糖的生物活性，本發明公開了一種雞胚多糖的片劑及其片劑的制備方法。

發明內容
本發明為使雞胚多糖滿足臨床應用和大規模生產的需要，公開了一種雞胚多糖的片劑，及其制備方法，通過所述方法可以得到方便服用、劑量準確、質量穩定的片劑。本發明是通過以下技術方案實現的，雞胚多糖片劑，主要由下列重量份的原料配制而成，活性成分:雞胚多糖1-2份，輔料:微晶纖維素或低取代羥丙基纖維素15-30份，硬質酸鈉10-30份，碳酸鈉50-70 份。本發明所述的雞胚多糖片劑，主要由下列重量份的原料配制而成，活性成分:雞胚多糖1.5份，輔料:微晶纖維素或低取代羥丙基纖維素15份，硬質酸鈉23.5份，碳酸鈉60份。本發 明所述的雞胚多糖片劑，由下述重量份的原料制成咀嚼片，活性成分:雞胚多糖1-2份，輔料:微晶纖維素或低取代羥丙基纖維素15-30份，硬質酸鈉10-30份，碳酸鈉50-70份，乳糖或蔗糖或糖粉5-10份，山梨醇或甘露醇10-15份。本發明雞胚多糖片劑的制備方法，包括以下步驟:步驟一雞胚多糖的提取:I)將SPF雞胚在溫度為36_38°C的恒溫條件下培養9_13天。2)收獲后的雞胚燈檢，標記尿囊腔的位置，在溫度為4°C _18°C的環境下，放置8-48小時，然后提取活雞胚的(死雞胚顏色變黑，活雞胚顏色發紅)尿囊液或雞胚培養物。3)將上一步得到的尿囊液或雞胚培養物使用如下的純化工藝提取:A)尿囊液或雞胚培養物的澄清處理:使用20mM IOOmM磷酸鹽緩沖液稀釋尿囊液或雞胚培養物混合均勻，其中磷酸鹽緩沖液與尿囊液或雞胚培養物的體積比為
2-10: l，8000g-12000g，18°C以下，離心10-60分鐘，收集上清液，棄去沉淀;B)上清液的進一步澄清處理:用0.22um的微孔濾膜過濾上清液；C)向濾膜濾過的上清液中添加固體硫酸氨，上清:固體硫酸氨的質量比為5-20: I，混勻后放置于4°C _18°C儲存，時間不低于6小時；D) 8000g-12000g, 18°C 以下，離心 10-60 分鐘，取上清液；E)用10-30KD的超濾膜以0.1-0.5mol的NaCl對上清液進行超濾，取濾過液；F)用IKD的超濾膜進行過濾，取截流液；G)取F)步得到的截流液，于36_38°C干燥。步驟二各組分原料粉碎、混勻、壓片:取各組分原料，分別粉碎，過篩60目，得到的均勻粉末分別置潔凈容器中，按重量比取各組分混分，取混勻的樣品檢測雞胚多糖含量的測定，干法壓片即得雞胚多糖的片劑。上述雞胚多糖含量的測定是通過葸酮法測定，其原理是糖類遇濃硫酸脫水生成糖醛或其衍生物，糠醛或羥甲基糠醛進一步與蒽酮試劑縮合產生藍綠色物質，其在可見光區6200nm波長處有最大吸收，且其光吸收值在一定范圍內與糖的含量成正比關系。此法可用于單糖、寡糖和多糖的含量測定，操作方法如下:
I)樣品準備:精確量取Iml的供試品于試管中，平行測定2份，立即加入蒽酮試劑
4.0ml，迅速浸于冰水浴中冷卻，混勻，80°C水浴30分鐘，管口加蓋，防止蒸發。水浴結束后取出試管置于冰水中冷卻至室溫，波長620nm處測定吸光度。標準曲線2)標準曲線制備:精確量取標準葡萄糖溶液(lOOyg/mlhCK空白對照)、0.1、0.2,0.3,0.4,0.6,0.8ml分別置于試管中，補純化水至1.0ml，其余操作同供試品。以標準葡萄糖濃度為橫坐標(X)，以相應濃度的吸收度為縱坐標(Y)作圖，建立標準曲線。3)結果計算:(I)將供試品OD值代入回歸方程中，計算出稀釋后供試品的多糖含量；(2)根據供試品的稀釋倍數計算出供試品的多糖含量；多糖含量(ug/ml)=供試品稀釋倍數X稀釋供試品多糖濃度。上述雞胚多糖的含量測定還可以通過高效液相法測定。本發明制備的片劑，一天服用1-2片，即可達到治療劑量含雞胚多糖2mg的要求。本發明具有以下優點及有益效果:1、雞胚多糖的臨床用藥提供了方便的片劑劑型。2、本發明雞胚多糖的提取使用鹽析和膜技術相結合的方法來提取生物多糖，大幅度提高雞胚尿囊液和 雞胚多糖中具備生物活性的多糖分離純化后的純度和回收率。3、本發明雞胚多糖的提取過程中，沒有使用有機溶劑，不存在生物危害性，更有利于環保。4、本發明公開的雞胚多糖片劑的制備方法獲得的片劑，具有劑量準確、質量穩定、純度高，服用方便等優點。
具體實施例方式通過參閱下述實施例可以更容易地了解本發明的內容，這些實施例只是為進一步說明本發明，并不意味著限定本發明的范圍。實施例1雞胚多糖內服片的制備片劑規格:0.1g/片，配制數量10000片；稱取雞胚多糖IOg,微晶纖維素300g,硬質酸鈉190g,碳酸鈉500g。制備方法如下:步驟一雞胚多糖的提取:I)將SPF雞胚在溫度為36_38°C的恒溫條件下培養9_13天。2)收獲后的雞胚燈檢，標記尿囊腔的位置，在溫度為4°C的環境下，放置16小時，然后提取活雞胚的(死雞胚顏色變黑，活雞胚顏色發紅)尿囊液或雞胚培養物。3)將第2)步得到的尿囊液或雞胚培養物使用如下的純化工藝提取:A)尿囊液或雞胚培養物的澄清處理:使用40mM磷酸鹽緩沖液稀釋尿囊液或雞胚培養物混合均勻，其中磷酸鹽緩沖液與尿囊液或雞胚培養物的體積比為5: l，12000g，18°C以下，離心10分鐘，收集上清液，棄去沉淀；B)上清液的進一步澄清處理:用0.22um的微孔濾膜過濾上清液；C)向濾膜濾過的上清液中添加固體硫酸氨，比例為10: I (上清:固體硫酸氨)，混勻后放置于4°C儲存，時間不低于6小時；D) 12000g, 18°C以下，離心10分鐘，取上清液；E)用10-30KD的超濾膜以0.2mol的NaCl對上清液進行超濾，取濾過液；F)用IKD的超濾膜進行過濾，取截流液；G)取F)步得到的截流液，于36_38°C干燥。步驟二雞胚多糖內服片的制備:I)取各雞胚多糖，微晶纖維素，硬質酸鈉，碳酸鈉，分別粉碎，過篩60目；2)將上一步得到的均勻粉末置于混合機中混勻20min分鐘；3)用葸酮法抽樣測定樣品檢測雞胚多糖的含量:A、樣品準備:精確量取Iml的供試品于試管中，平行測定2份，立即加入蒽酮試劑4.0ml，迅速浸于冰水浴中冷卻，混勻，80°C水浴30分鐘，管口加蓋，防止蒸發。水浴結束后取出試管置于冰水中冷卻至室溫，波長620nm處測定吸光度。標準曲線B、標準曲線制備:精確量取標準葡萄糖溶液(100iig/ml)，0(空白對照)、0.1、0.2,0.3,0.4,0.6,0.8ml分別置于試管中，補純化水至1.0ml，其余操作同供試品。以標準葡萄糖濃度為橫坐標(X)，以相應濃度的吸收度為縱坐標(Y)作圖，建立標準曲線。C、結果計算:將供試品OD值代入回歸方程中，計算出稀釋后供試品的多糖含量；根據供試品的稀釋倍數計算出供試品`的多糖含量；多糖含量(ug/ml)=供試品稀釋倍數X稀釋供試品多糖濃度。4)計算應壓片質量，干法壓片即得雞胚多糖片劑。實施例2雞胚多糖內服片的制備:片劑規格:0.1g/片，配制數量10000片；稱取雞胚多糖15g,微晶纖維素150g,硬質酸鈉235g,碳酸鈉600g。制備方法如下:步驟一雞胚多糖的提取:I)將SPF雞胚在溫度為36_38°C的恒溫條件下培養12天。2)收獲后的雞胚燈檢，標記尿囊腔的位置，在溫度為4°C的環境下，放置18小時，然后提取活雞胚的(死雞胚顏色變黑，活雞胚顏色發紅)尿囊液或雞胚培養物。3)將第2)步得到的尿囊液或雞胚培養物使用如下的純化工藝提取:A)尿囊液或雞胚培養物的澄清處理:使用30mM磷酸鹽緩沖液稀釋尿囊液或雞胚培養物混合均勻，其中磷酸鹽緩沖液與尿囊液或雞胚培養物的體積比為5: l，12000g，4°C，離心10分鐘，收集上清液，棄去沉淀；B)上清液的進一步澄清處理:用0.22um的微孔濾膜過濾上清液；C)向濾膜濾過的上清液中添加固體硫酸氨，比例為8:1 (上清:固體硫酸氨)，混勻后放置于4°C儲存，時間不低于6小時；D) 12000g, 18°C以下，離心10分鐘，取上清液；E)用10-30KD的超濾膜以0.2mol的NaCl對上清液進行超濾，取濾過液；F)用IKD的超濾膜進行過濾，取截流液；G)取F)步得到的截流液，于36_38°C干燥。
步驟二雞胚多糖內服片的制備:I)取各雞胚多糖，微晶纖維素，硬質酸鈉，碳酸鈉，分別粉碎，過篩60目；2)將上一步得到的均勻粉末置于混合機中混勻15min分鐘；3)用葸酮法抽樣測定樣品檢測雞胚多糖的含量:A、樣品準備:精確量取Iml的供試品于試管中，平行測定2份，立即加入蒽酮試劑
4.0ml，迅速浸于冰水浴中冷卻，混勻，80°C水浴30分鐘，管口加蓋，防止蒸發。水浴結束后取出試管置于冰水中冷卻至室溫，波長620nm處測定吸光度。標準曲線B、標準曲線制備:精確量取標準葡萄糖溶液(100iig/ml)，0(空白對照)、0.1、
0.2,0.3,0.4,0.6,0.8ml分別置于試管中，補純化水至1.0ml，其余操作同供試品。以標準葡萄糖濃度為橫坐標(X)，以相應濃度的吸收度為縱坐標(Y)作圖，建立標準曲線。C、結果計算:將供試品OD值代入回歸方程中，計算出稀釋后供試品的多糖含量；根據供試品的稀釋倍數計算出供試品的多糖含量；多糖含量(ug/ml)=供試品稀釋倍數X稀釋供試品多糖濃度。4)計算應壓片質量，干法壓片即得雞胚多糖片劑。實施例3雞胚多糖咀嚼片的制備片劑規格:0.1g/片，配制數量10000片；稱取雞胚多糖20g， 低取代羥丙基纖維素150g，硬質酸鈉130g，碳酸鈉500g，蔗糖IOOg,山梨醇 IOOgo步驟一雞胚多糖的提取:I)將SPF雞胚在溫度為36_38°C的恒溫條件下培養12天。2)收獲后的雞胚燈檢，標記尿囊腔的位置，在溫度為4°C的環境下，放置18小時，然后提取活雞胚的(死雞胚顏色變黑，活雞胚顏色發紅)尿囊液或雞胚培養物。3)將第2)步得到的尿囊液或雞胚培養物使用如下的純化工藝提取:A)尿囊液或雞胚培養物的澄清處理:使用20mM磷酸鹽緩沖液稀釋尿囊液或雞胚培養物混合均勻，其中磷酸鹽緩沖液與尿囊液或雞胚培養物的體積比為5: l，12000g，4°C，離心10分鐘，收集上清液，棄去沉淀；B)上清液的進一步澄清處理:用0.22um的微孔濾膜過濾上清液；C)向濾膜濾過的上清液中添加固體硫酸氨，比例為10: I (上清:固體硫酸氨)，混勻后放置于4°C儲存，時間不低于6小時；D) 12000g，18°C以下，離心10分鐘，取上清液；E)用10-30KD的超濾膜以0.2mol的NaCl對上清液進行超濾，取濾過液；F)用IKD的超濾膜進行過濾，取截流液；G)取F)步得到的截流液，于36_38°C干燥。步驟二雞胚多糖內服片的制備:I)雞胚多糖、低取代羥丙基纖維素、硬質酸鈉、碳酸鈉、蔗糖、山梨醇，分別粉碎，過篩60目；2)將上一步得到的均勻粉末置于混合機中混勻25min分鐘；3)用葸酮法抽樣測定樣品檢測雞胚多糖的含量，方法同實施例3。
權利要求
1.一種雞胚多糖的片劑，主要由下列重量份的原料制成， 活性成分:雞胚多糖1-2份， 輔料:微晶纖維素或低取代羥丙基纖維素15-30份，硬質酸鈉10-30份，碳酸鈉50-70份。
2.根據權利要求1所述的多糖片劑，主要由下列重量份的原料制成， 活性成分:雞胚多糖1.5份， 輔料:微晶纖維素或低取代羥丙基纖維素15份，硬質酸鈉23.5份，碳酸鈉60份。
3.根據權利要求1所述的雞胚多糖片劑，還包括下述重量份的原料制成咀嚼片，輔料:乳糖或蔗糖或糖粉5-10份，山梨醇或甘露醇10-15份。
4.一種制備如權利要求1所述的雞胚多糖片劑的方法，包括以下步驟: 步驟一雞胚多糖的提取: 1)將SPF雞胚在溫度為36-38°C的恒溫條件下培養9-13天。
2)收獲后的雞胚燈檢，標記尿囊腔的位置，在溫度為4°C_18°C的環境下，放置8-48小時，然后提取活雞胚的(死雞胚顏色變黑，活雞胚顏色發紅)尿囊液或雞胚培養物。
3)將上一步得到的尿囊液或雞胚培養物使用如下的純化工藝提取: A)尿囊液或雞胚培養物的澄清處理:使用20mM IOOmM磷酸鹽緩沖液稀釋尿囊液或雞胚培養物混合均勻，其中磷酸鹽緩沖液與尿囊液或雞胚培養物的體積比為2-10: 1，8000g-12000g, 18°C以下，離心10-60分鐘，收集上清液，棄去沉淀； B)上清液的進一步澄清處理:用0.22 ii m的微孔濾膜過濾上清液； C)向濾膜濾過的上清液中添加固體硫酸氨，比例為5-20: 1(上清:固體硫酸氨)，混勻后放置于4°C _18°C儲存，時間不低于6小時； D)8000g-12000g, 18°C以下，離心10-60分鐘，取上清液； E)用10-30KD的超濾膜以0.1-0.5mol的NaCl對上清液進行超濾，取濾過液； F)用IKD的超濾膜進行過濾，取截流液； G)取F)步得到的截流液，于36-38°C干燥。
步驟二各組分原料粉碎、混勻、壓片: 取各組分原料，分別粉碎，過篩60目，得到的均勻粉末分別置潔凈容器中，按重量比取各組分混勻，取混勻的樣品檢測雞胚多糖含量的測定，干法壓片即得雞胚多糖的片劑。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述的雞胚多糖含量的測定具體方法為: 1)樣品準備:精確量取Iml的供試品于試管中，平行測定2份，立即加入蒽酮試劑·4.0ml，迅速浸于冰水浴中冷卻，混勻，80°C水浴30分鐘，管口加蓋，防止蒸發。水浴結束后取出試管置于冰水中冷卻至室溫，波長620nm處測定吸光度。
標準曲線 2)標準曲線制備:精確量取標準葡萄糖溶液(10011§/1111)，0(空白對照)、0.1、0.2、·0.3,0.4,0.6,0.8ml分別置于試管中，補純化水至1.0ml，其余操作同供試品。以標準葡萄糖濃度為橫坐標(X)，以相應濃度的吸收度為縱坐標(Y)作圖，建立標準曲線。
3)結果計算: (1)將供試品OD值代入回歸方程中，計算出稀釋后供試品的多糖含量； (2)根據供試品的稀釋倍數計算出供試品的多糖含量；多糖含量(ug/ml)=供 試品稀釋倍數X稀釋供試品多糖濃度。
全文摘要
本發明涉及一種雞胚多糖的片劑，所述的片劑主要由下列重量份的原料配制而成，活性成分雞胚多糖1-2份；輔料微晶纖維素或低取代羥丙基纖維素15-30份，硬質酸鈉10-30份，碳酸鈉50-70份。本發明還公開了上述多糖片劑的制備方法，通過本發明所述的方法制備的雞胚多糖片劑，具有劑量準確、質量穩定、純度高，服用方便等優點。
文檔編號A61P35/00GK103142528SQ20131010376
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月28日 優先權日2013年3月28日
發明者喬民, 金蓮英 申請人:喬民, 金蓮英