專利名稱：盆底補(bǔ)片復(fù)合生物材料的制備方法及其產(chǎn)品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及材料領(lǐng)域，特別涉及盆底補(bǔ)片復(fù)合生物材料的制備方法，還涉及由該方法制得的產(chǎn)品。
背景技術(shù)：
女性盆腔臟器脫垂是一種常見病，國內(nèi)發(fā)病率約為40%并且逐年增加，已成為嚴(yán)重影響中老年婦女健康和生活質(zhì)量的主要婦科問題。臨床目前廣泛使用的聚丙烯合成材料作為婦科盆底補(bǔ)片，該補(bǔ)片雖然療效確切，但具有順應(yīng)性差、組織侵蝕性強(qiáng)、感染率高等缺點(diǎn)，并易導(dǎo)致性交痛等相關(guān)并發(fā)癥。經(jīng)研究表明豬脫細(xì)胞膀胱基質(zhì)材料具有較好的生物相 容性和一定的抗菌性，是一種理想的婦科盆底補(bǔ)片。但是豬脫細(xì)胞膀胱基質(zhì)材料在體內(nèi)降解較快，不能滿足盆底補(bǔ)片的力學(xué)要求。利用夾心法制作的脫細(xì)胞膀胱基質(zhì)/聚丙烯/脫細(xì)胞膀胱基質(zhì)復(fù)合生物材料，將聚丙烯材料夾在兩層脫細(xì)胞膀胱基質(zhì)材料中間，可以降低由聚丙烯材料引起的炎癥反應(yīng)，同時還可以增加脫細(xì)胞膀胱基質(zhì)材料的力學(xué)特性。脫細(xì)胞膀胱基質(zhì)/聚丙烯/脫細(xì)胞膀胱基質(zhì)復(fù)合生物材料與單純聚丙烯材料相比，炎癥反應(yīng)雖有所降低，但復(fù)合材料體積相對較大，脫細(xì)胞膀胱基質(zhì)與聚丙烯材料結(jié)合不緊密，不利于操作和臨床使用。目前，利用交聯(lián)劑制備有機(jī)/無機(jī)復(fù)合生物材料雖在一定程度上能綜合二者之長，但交聯(lián)劑難以完全清除，殘余物在一定程度上會影響復(fù)合生物材料的生物學(xué)性能并引起一系列的臨床副作用。因此，急需一種盆底補(bǔ)片復(fù)合生物材料的制備方法，該方法不使用化學(xué)交聯(lián)劑，制得的復(fù)合生物材料具有聚丙烯材料相似的力學(xué)特性，同時能降低聚丙烯材料引起的炎癥反應(yīng)，還具有體積小，利于使用的優(yōu)點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供盆底補(bǔ)片復(fù)合生物材料的制備方法，其制備方法簡單，不使用化學(xué)交聯(lián)劑。為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，技術(shù)方案為
盆底補(bǔ)片復(fù)合生物材料的制備方法，將脫細(xì)胞基質(zhì)凝膠與聚丙烯材料在壓強(qiáng)至少為IOOMPa條件下處理至少5分鐘，得盆底補(bǔ)片復(fù)合生物材料；
所述脫細(xì)胞基質(zhì)凝膠是將脫細(xì)胞基質(zhì)溶于醋酸溶液中，經(jīng)滅酶、離心、超濾、透析所得。
本發(fā)明中的脫細(xì)胞基質(zhì)是指異體組織經(jīng)細(xì)胞滅活處理后，制備成無活體細(xì)胞存在的細(xì)胞外基質(zhì)成分和結(jié)構(gòu)，主要包括膠原、彈性蛋白、氨基葡糖糖、結(jié)構(gòu)蛋白等。因其無抗原性，以及良好的生物相容性，成為組織工程支架材料的選擇之一。本發(fā)明中使用的脫細(xì)胞基質(zhì)凝膠是將脫細(xì)胞基質(zhì)溶于醋酸溶液中制得，醋酸溶液可以為任意濃度，為了便于下一步操作，最優(yōu)為溶解在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為O. 5%的醋酸溶液中。本發(fā)明中脫細(xì)胞基質(zhì)凝膠與聚丙烯材料可以按任意比例混合，以脫細(xì)胞基質(zhì)凝膠浸沒聚丙烯材料為宜，優(yōu)選為將脫細(xì)胞基質(zhì)凝膠與聚丙烯材料按質(zhì)量比為1-10:1混合，在壓強(qiáng)至少為100-200MPa條件下處理5_15分鐘。優(yōu)選的，所述脫細(xì)胞基質(zhì)的制備方法具體為，將脫細(xì)胞基質(zhì)按Ig脫細(xì)胞基質(zhì)加IOOmL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為O. 5%醋酸溶液；在溫度為4°C條件下用NaOH將pH調(diào)至7-7. 4滅活酶，然后在溫度為4°C、轉(zhuǎn)速為SOOOrpm條件下，離心15分鐘，收集沉淀；再將收集的沉淀以10 12 mg/ mL溶解在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為O. 5%的醋酸中,用孔徑為O .45 μ m的濾膜過濾,然后在4°C條件下用濃度為O .001 mol/ L醋酸溶液透析2次，每次24小時，得脫細(xì)胞基質(zhì)凝膠。
本發(fā)明中脫細(xì)胞基質(zhì)可以按照現(xiàn)有技術(shù)中公開的制備方法制備，也可以按照本發(fā)明公開的方法制備，優(yōu)選為，所述脫細(xì)胞基質(zhì)的制備方法，具體步驟如下取動物組織，清洗干凈；剪成塊，用水沖洗后進(jìn)行消毒，然后進(jìn)行脫脂，再浸入醋酸溶液中溶脹，最后進(jìn)行勻漿，得勻漿液；將所得勻漿液用胃蛋白酶酶解；然后用氯化鈉鹽析，經(jīng)離心后收集沉淀，得脫細(xì)胞基質(zhì)。更優(yōu)選的，所述消毒是用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為O. 1%的新潔爾滅，消毒至少15分鐘；
所述脫脂為將動物組織浸入脫脂液中，在溫度為4°C，攪拌至少16小時；所述脫脂液是乙醇異丙醇水體積比為7 4 89的混合物；
所述溶脹是加入相當(dāng)于動物組織1-10倍的醋酸溶液，在溫度為4°C條件下，浸泡24小
時；
所述酶解是加入相當(dāng)于勻漿液體積10倍的醋酸溶液和相當(dāng)于勻漿液重量1%的胃蛋白酶，在溫度為4°C條件下，處理48小時；
所述鹽析中氯化鈉的終濃度為2mol/L，鹽析時間為2小時。更優(yōu)選的，所述醋酸溶液是質(zhì)量分?jǐn)?shù)為O. 5%的醋酸水溶液。優(yōu)選的，所述動物組織為豬去粘膜層膀胱或豬去皮下組織皮膚。本發(fā)明目的之二在于提供由上述制備方法制得的盆底補(bǔ)片復(fù)合生物材料，其炎癥反應(yīng)小，組織相容性好。為實現(xiàn)上述技術(shù)目的，技術(shù)方案為
所述方法制備的盆底補(bǔ)片復(fù)合生物材料。本發(fā)明有益效果在于本發(fā)明公開了盆底補(bǔ)片復(fù)合生物材料的制備方法，其制備方法簡單，采用物理方法，利用高壓使脫細(xì)胞基質(zhì)凝膠和聚丙烯材料牢固的交聯(lián)在一起，不需要使用化學(xué)交聯(lián)劑，因此無化學(xué)試劑殘留，同時交聯(lián)后能夠結(jié)合脫細(xì)胞基質(zhì)凝膠和聚丙烯的性質(zhì)，使制得的盆底補(bǔ)片復(fù)合生物材即具有聚丙烯材料的力學(xué)性質(zhì)，又與組織的相容性好，使用后無炎癥反應(yīng)；可以用于治療盆腔臟器脫垂，治療效果好，無副作用。
具體實施例方式以下將結(jié)合實施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的描述。優(yōu)選實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件。實施例I
盆底補(bǔ)片復(fù)合生物材料的制備方法，具體包括以下步驟
A.制備脫細(xì)胞基質(zhì)凝膠
取豬的新鮮膀胱，用自來水清洗干凈，然后去表面粘膜層，得豬去粘膜層膀胱；
將所得豬去粘膜層膀胱用剪刀剪成小塊，用純水沖洗3遍，然后用消毒液浸泡15分鐘進(jìn)行消毒，其中消毒液為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為O. 1%新潔爾滅；
將消毒的膀胱組織浸入脫脂液中，置于溫度為4°c條件下，磁力攪拌16小時進(jìn)行脫脂，得脫脂膀胱組織；其中脫脂液為乙醇異丙醇水按7 4 89混合(體積比)；
將所得脫脂膀胱組織用超純水反復(fù)清洗5次，用相當(dāng)于豬去粘膜層膀胱重量I倍的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為O. 5%醋酸溶液溶脹脫脂膀胱組織，在溫度為4°C條件下，浸泡24小時，得溶脹膀胱組織；
將所得溶脹膀胱組織用勻漿機(jī)勻漿，得勻漿液；
將所得勻漿液加入相當(dāng)于豬去粘膜層膀胱重量10倍的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為O. 5%的醋酸溶液和相當(dāng)于豬去粘膜層膀胱重量1%的胃蛋白酶，在溫度為4°C條件下，酶解48小時，得酶解液；將所得酶解液過濾，收集濾液，向濾液中加入氯化鈉至氯化鈉終濃度為2mol/L，鹽析2小時；將鹽析液，在溫度為4°C、轉(zhuǎn)速為8000rpm條件下，離心15分鐘，收集沉淀，得脫細(xì)胞
基質(zhì);
最后將所得脫細(xì)胞基質(zhì)按Ig脫細(xì)胞基質(zhì)加IOOmL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為O. 5%醋酸溶液；在溫度為4°C條件下用NaOH將pH調(diào)至7. 4滅活酶，然后在溫度為4°C、轉(zhuǎn)速為SOOOrpm條件下，離心15分鐘，收集沉淀；再將收集的沉淀以10 mg/ mL再溶解在O. 5%的醋酸中，用孔徑為O.45 μ m的濾膜過濾，然后在4°C條件下用濃度為O .001 mol/ L醋酸溶液透析2次，每次24小時，最后得脫細(xì)胞基質(zhì)凝膠。B.制備復(fù)合生物材料
取聚丙烯材料和步驟A所得脫細(xì)胞基質(zhì)凝膠按重量比為1:1加入鋁箔袋內(nèi)，排除空氣進(jìn)行密封；在壓強(qiáng)為100 MPa條件下處理15分鐘；處理的鋁膜袋在超凈臺內(nèi)，用無菌生理鹽水洗脫3次，去除未交聯(lián)的材料，干燥，得盆底補(bǔ)片復(fù)合生物材料；其中100 MPa壓強(qiáng)由HPP. L3-600/0. 6超高壓設(shè)備提供(天津市華泰森淼生物工程技術(shù)有限公司)。
盆底補(bǔ)片復(fù)合生物材料體內(nèi)植入評價
選取雌性大鼠20只，平均分成兩組，分別將聚丙烯材料和制得的盆底補(bǔ)片復(fù)合生物材料分別植入大鼠陰道粘膜下層。植入后1、2、3、4周，觀察小鼠陰道局部反應(yīng)，并分別取材料和周圍組織進(jìn)行免疫組化染色，染色指標(biāo)分別為，染色指標(biāo)分別為免疫因子CD4、免疫因子⑶8、趨化因子受體CCR4和CXC趨化因子受體3CXCR3，結(jié)果如表I所示。表I.免疫組化染色結(jié)果
權(quán)利要求
1.盆底補(bǔ)片復(fù)合生物材料的制備方法，其特征在于將脫細(xì)胞基質(zhì)凝膠與聚丙烯材料在壓強(qiáng)至少為IOOMPa條件下處理至少5分鐘，得盆底補(bǔ)片復(fù)合生物材料； 所述脫細(xì)胞基質(zhì)凝膠是將脫細(xì)胞基質(zhì)溶于醋酸溶液中，經(jīng)滅酶、離心、超濾、透析所得。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述盆底補(bǔ)片復(fù)合生物材料的制備方法，其特征在于將脫細(xì)胞基質(zhì)凝膠與聚丙烯材料按重量比為1-10:1混合，在壓強(qiáng)為100-200MPa條件下處理5-15分鐘。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述盆底補(bǔ)片復(fù)合生物材料的制備方法，其特征在于所述脫細(xì)胞基質(zhì)凝膠的制備方法，具體為，將脫細(xì)胞基質(zhì)按Ig脫細(xì)胞基質(zhì)加IOOmL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為O.5%醋酸溶液；在溫度為4°C條件下將pH調(diào)至7-7. 4滅活酶，然后離心，收集沉淀；再將收集的沉淀以10 12 mg/ mL溶解在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為O. 5%的醋酸中，用孔徑為O . 45 μ m的濾膜過濾，然后在4°C條件下用濃度為O .001 mol/ L醋酸溶液透析2次，每次24小時，得脫細(xì)胞基質(zhì)凝膠。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述盆底補(bǔ)片復(fù)合生物材料的制備方法，其特征在于所述脫細(xì)胞基質(zhì)的制備方法，具體步驟如下 取動物組織，剪成塊，用水沖洗后進(jìn)行消毒，然后進(jìn)行脫脂，再浸入醋酸溶液中溶脹，最后進(jìn)行勻漿，得勻漿液；將所得勻漿液用胃蛋白酶酶解；然后用氯化鈉鹽析，經(jīng)離心后收集沉淀，得脫細(xì)胞基質(zhì)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述盆底補(bǔ)片復(fù)合生物材料的制備方法，其特征在于所述消毒是用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為O. 1%的新潔爾滅，消毒至少15分鐘； 所述脫脂為將動物組織浸入脫脂液中，在溫度為4°C，攪拌至少16小時；所述脫脂液是乙醇異丙醇水體積比為7 4 89的混合物； 所述溶脹是加入相當(dāng)于動物組織1-10倍重量的醋酸溶液，在溫度為4°C條件下，浸泡24小時； 所述酶解是加入相當(dāng)于勻漿液體積10倍的醋酸溶液和相當(dāng)于勻漿液重量1%的胃蛋白酶，在溫度為4°C條件下，處理48小時； 所述鹽析中氯化鈉的終濃度為2mol/L，鹽析時間為2小時。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述盆底補(bǔ)片復(fù)合生物材料的制備方法，其特征在于所述醋酸溶液是質(zhì)量分?jǐn)?shù)為O. 5%的醋酸溶液。
7.根據(jù)權(quán)利要求4-6任一項所述盆底補(bǔ)片復(fù)合生物材料的制備方法，其特征在于所述動物組織為豬去粘膜層膀胱或豬去皮下組織皮膚。
8.權(quán)利要求1-7任一項所述方法制備的盆底補(bǔ)片復(fù)合生物材料。
全文摘要
本發(fā)明公開了盆底補(bǔ)片復(fù)合生物材料的制備方法，具體為，將脫細(xì)胞基質(zhì)凝膠與聚丙烯材料在壓強(qiáng)至少為100MPa條件下處理至少5分鐘；其制備方法簡單，使脫細(xì)胞基質(zhì)凝膠與聚丙烯材料結(jié)合牢固，交聯(lián)過程中未使用化學(xué)交聯(lián)劑，無化學(xué)物質(zhì)殘留；還公開由該方法制得的盆底補(bǔ)片復(fù)合生物材料及其應(yīng)用，經(jīng)動物實驗驗證，具有組織相容性好，無炎癥反應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)，能夠用于治療盆腔臟器脫垂。
文檔編號A61L27/16GK102631708SQ201210153430
公開日2012年8月15日 申請日期2012年5月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月17日
發(fā)明者劉祿斌, 張曉春, 葛良鵬, 黃萍 申請人:重慶市婦幼保健院, 重慶市畜牧科學(xué)院