專利名稱：山奈酚及其衍生物用于制備防治心腦血管疾病藥物的用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及醫藥技術領域，是山奈酚及其衍生物用于制備防治心腦血管疾病藥物的用途。
本發明用作藥理和藥效試驗的化合物有山奈酚、6-羥基山奈酚、山奈酚-3-葡萄糖苷、山奈酚-3-蕓香糖苷、6-羥基山奈酚-3-葡萄糖苷、6-羥基山奈酚-3，6-二葡萄糖苷、6-羥基山奈酚-3，6，7-三葡萄糖苷等，都取得了良好的效果。這些化合物均含有母環山奈酚結構，其他山奈酚衍生物也含有母環山奈酚結構，它們的化學結構通式為 其中R1，R2，R3，R4和R5分別代表R1H，甲基，乙?；?，羥乙基，葡萄糖基，鼠李糖基，鼠李葡糖基，葡糖鼠李糖基；R2H，甲基，乙?；?，羥乙基，葡萄糖基，鼠李糖基，鼠李葡糖基，葡糖鼠李糖基，半乳糖基，葡糖醛(苷)酸基，阿拉伯糖基，木糖基，3，4，5-三羥苯甲酰葡萄糖基，香豆酰阿拉伯糖基，阿魏酰阿拉伯糖基；R3H，甲基，乙?；?，羥乙基；R4H，OH，甲氧基，-O-葡萄糖，-O-葡萄糖基，-O-鼠李糖基，-O-鼠李葡糖基，-O-葡糖鼠李糖基，-O-半乳糖基，-O-葡糖醛(苷)酸基，-O-阿拉伯糖基；R5H，甲基，乙酰基，羥乙基，葡萄糖基，鼠李糖基，鼠李葡糖基，葡糖鼠李糖基。
山奈酚及其部分衍生物化學結構式已經確定，其母環上各R基團見表1
表1山奈酚及其部分衍生物化學結構式母環上各R基團

其中，編號為4的化合物山奈酚-3-蕓香糖苷本發明人已另案申請專利(專利申請號為01131942.9，申請日2001.10.22)可選用紅花、五加、銀杏、燈盞花、風仙花等植物作為制備山奈酚及其衍生物的原料，但由于以往所用的原料單體含量較低，故不能制備到足夠的單一化合物。本發明則選用合肥紅花、毫州紅花為原料，其山奈酚及其衍生物的含量高，因而單體得率高。制備方法通常為按常規將原料用極性溶劑提取，制備植物提取液的濃縮液，將濃縮液進行多種柱層析，然后以不同極性溶劑依次洗脫，分別收集各化合物的洗脫液，經純化后進行濃縮干燥或重結晶，即可獲得所需化合物。
1、將乙醚萃取物進行硅膠柱層析，按常規以石油醚-乙酸乙酯(30∶1-1∶1)及氯仿-甲醇(10∶1-1∶1，下同)溶劑系統洗脫，分別收集氯仿-甲醇8∶1和5∶1的洗脫液，并各用Sephadex LH-20柱純化，再濃縮和重結晶，分別得山奈酚120mg，6-羥基山奈酚100mg；2、將正丁醇萃取物過大孔樹脂柱，依次以水、20％、50％、70％、95％乙醇洗脫，棄水洗脫液，分別收集不同濃度乙醇洗脫液。
①將20％乙醇洗脫液進行硅膠柱層析，以氯仿-甲醇溶劑系統洗脫，分別收集氯仿-甲醇6∶1和4∶1洗脫液，并各用Sephadex LH-20柱純化，再濃縮和重結晶，分別得山奈酚-3-葡萄糖苷1360mg，山奈酚-3-蕓香糖苷2600mg；②將50％乙醇洗脫液進行硅膠柱層析，以氯仿-甲醇溶劑系統洗脫，分別收集氯仿-甲醇5∶1、3∶1和2∶1洗脫液，各用Sephadex LH-20柱純化，濃縮和重結晶，分別得6-羥基山奈酚-3-葡萄糖苷407mg；6-羥基山奈酚-3，6-二葡萄糖苷299mg；6-羥基山奈酚-3，6，7-三葡萄糖苷260mg。
藥理、藥效實驗根據治療缺血性中風(缺血性腦血管病)中藥新藥研制的藥效學要求(中華人民共和國藥政局中藥新藥研究指南，第66～67頁，準印證號京準字94-0198)，設計實驗方法。上述各化合物藥理或藥效學實驗的方法基本相同，以山奈酚-3-葡萄糖苷(FNL)、6-羥基山奈酚-3-葡萄糖苷(LNS)為例詳述如下一、FNL、LNS對大鼠局灶性腦缺血的治療作用1、試驗材料1.1、實驗儀器SW-30射頻雙極凝固器(上海市檢測技術所檢測儀器廠生產)，307-6臺式牙鉆車(上海齒科醫械廠生產)，SXP-1B手術顯微鏡(上海醫用光學儀器廠生產)，恒溫水浴。1.2、供試樣品FNL，LNS，純度均大于93.2％。
配制臨用前將FNL、LNS溶于乙醇∶吐溫-80∶H2O為1∶1∶8的溶劑中待用。2、試驗動物品系Wistar大鼠性別雄性體重260～290克來源中科院上海動物中心(下同)動物合格證滬動合證字005號飼養恒溫凈化通風動物房，自由進食與飲水，25±2℃。3、試驗方法取健康雄性Wistar大鼠，共72只，隨機分成8組第1組為陰性對照組(注射等體積溶劑)，第2、3、4組為FNL組，給藥劑量分別為每公斤體重5mg、10mg、20mg(以下用mg/kg表示)，第5、6、7組為LNS組，給藥劑量分別為5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg，第8組為陽性對照組(尼莫地平)，給藥劑量1.2mg/kg。給藥時間為缺血后立即尾靜脈注射，給藥體積為1ml。
按Tamura的方法(Tumura A，et alJ Cereb Blood Flow and Metab，1981，153)制備腦缺血模型，并于術后24小時進行行為學評分，評分采用單盲法，在大鼠右側大腦中動脈阻斷24小時，斷頭取腦，在顯微鏡下進一步確證右側大腦中動脈已在嗅束與大腦下靜脈之間燒斷且腦實質無損害者，將其進行切片染色，分別稱壞死區及大腦右半球重量。4、統計學處理所有的數據均用X±SD表示，統計學分析用t檢驗(詳見金丕煥主編醫用統計方法學，上海醫科大學出版社，1993年2月第1版，第36～40頁)。5、實驗結果見表2
表2 FNL、LNS對中動脈結扎大鼠的組織學和行為學影響劑量 行為學評分大腦右半球重壞死區重 壞死百分率組別 藥物動物數(mg/Kg) (24h) (g) (g)(％)1溶劑 9 7.67±1.58 0.758±0.0230.134±0.062 17.65±7.912FNL 5.0 9 7.67±2.50 0.784±0.0230.139±0.047 16.82±7.313FNL 10.09 5.21±1.83*0.781±0.0260.073±0.022*9.37±4.31*4FNL 20.09 4.83±1.83*0.789±0.0450.053±0.025*6.73±3.29**5LNS 5.0 9 7.17±2.30 0.791±0.0270.139±0.041 17.57±6.916LNS 10.09 4.91±1.81*0.762±0.0300.071±0.019*9.31±4.14*7LNS 20.09 4.63±1.53*0.794±0.0270.048±0.038*6.05±3.22**8尼莫地平 1.2 9 6.21±1.83*0.771±0.0260.081±0.022*10.51±3.91*與陰性對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01從表2可以看出，與陰性對照組相比，FNL、LNS在10～20mg/kg劑量時，能明顯改善局部性腦缺血大鼠的神經行為學缺陷(P＜0.05)，顯著縮小局部性腦缺血大鼠的壞死腦組織重量(P＜0.05)，減少局部性腦缺血大鼠的腦梗死重量占腦半球重量的百分比(P＜0.01)。6、結論從本實驗結果可以看出，FNL和LNS于缺血后立即靜脈注射給藥能明顯改善局部性腦缺血大鼠的神經行為學缺陷，顯著縮小局部性腦缺血大鼠的壞死腦組織重量，減少局部性腦缺血大鼠的腦梗死重量占腦半球重量的百分比。表明FNL和LNS對急性局部性腦缺血能發揮很好的治療作用。二、FNL、LNS對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護作用1、試驗材料(1)激光多普勒血流測定儀(瑞典Perimed公司生產的Periflux4001型)、SXP-1B手術顯微鏡(上海醫用光學儀器廠)，SW-30射頻雙極電凝器(上海市檢測技術所檢測儀器廠生產)。
試驗樣品FNL和LNS，配制方法同上。
(2)陽性對照尼莫通注射液(德國拜耳公司生產，批號CBNXS1)。維腦路通注射液(華北制藥集團太原有限責任公司生產，批號20001062)。
2、試驗動物品系SD大鼠性別雄性體重230～270克3、試驗方法；取雄性SD大鼠共64只，隨機分成8組，每組8只，第1組為假手術組，第2組為溶劑組(注射等體積溶劑)，第3、4組為FNL組，給藥劑量分別為10mg/Kg、20mg/Kg，第5、6組為LNS組，給藥劑量分別為10mg/Kg、20mg/Kg，第7組為尼莫通組，給藥劑量2mg/Kg，第8組為維腦路通組，給藥劑量30mg/Kg。給藥時間為缺血后立即股靜脈注射，給藥體積為1ml。
參照Longa EZ報道的線栓模型制備腦缺血再灌注損傷模型(Longa EZ，et alReversablemiddle cerebral artery occlusion without craniectomy in rat.Stroke，1989，2084)。缺血2小時再灌注24小時后進行行為學評分，斷頭取腦，TTC染色，留取樣本進行腦梗塞體積測定(詳見張均田主編現代藥理實驗方法學，第1241頁，北京醫科大學中國協和醫科大學聯合出版社，1998年10月第1版)。4、所有數據均采用X±SD表示，統計學分析采用t檢驗。5、實驗結果見表3表3 FNL、LNS對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護作用(n＝10，X±SD)劑量 腦水腫 梗塞面積組別 藥物行為評分(mg/Kg) (％) (％)1假手術組 0.00 78.01±0.81 0.002溶劑組 1.50±0.71 80.49±0.77 37.68±8.983FNL 10.0 0.50±0.53*78.78±0.78*15.21±4.74*4FNL 20.0 0.40±0.52*78.32±0.74**11.52±5.32**5LNS 10.0 0.50±0.53*78.93±0.71*14.93±4.67*6LNS 20.0 0.40±0.43*78.34±0.69**10.64±5.72**7尼莫通 2.00.80±0.71 78.99±0.68*17.47±7.17*8維腦路通30.0 0.80±0.71 79.19±0.68*22.67±6.87**P＜0.05，**P＜0.01與模型組比較從表3可以看出，FNL、LNS以10.0～20.0mg/Kg給藥，可顯著降低大鼠行為評分，劑量依賴性地縮小腦梗死面積，減輕缺血側腦半球水腫程度。表明FNL、LNS對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷有較強保護作用。三、FNL對家兔血液流變性的影響1、動物家兔，體重約2Kg，20只，雌雄各半，分成4組，每組5只。
2、儀器德國全自動LBY-N6A自清洗旋轉式粘度計及其自帶的流變學軟件平臺。
3、實驗方法家兔分別耳靜脈取血4ml，置于肝素干管中，按常規于LBY-N6A自清洗旋轉式粘度計測量家兔全血粘度、血漿粘度、全血還原粘度、紅細胞壓積，并通過粘度計自帶的流變學軟件平臺分析血沉、紅細胞聚集指數、剛性指數、變形指數、電泳指數等。給藥途徑耳靜脈注射。給藥0.5小時后，再次取血測量家兔上述各種指標，觀察給藥前后上述各指標的變化。FNL分兩個劑量組，給藥劑量分別10mg/Kg、20mg/Kg，陰性對照為溶劑組(注射等體積溶劑)，陽性對照為紅花注射液，給藥劑量為2.5ml/Kg。給藥次數均單次給藥。
4、結果見表4表4 FNL對家兔血液流變性的影響

表4結果表明，FNL以10～20mg/kg劑量給藥，能劑量依賴性地顯著降低家兔全血粘度和全血還原粘度(P＜0.01)，并能顯著降低紅細胞聚集指數(P＜0.01)。血粘度是血液流變學的重要指標，因此，FNL通過顯著降低全血粘度、全血還原粘度和紅細胞聚集指數，而有利于防治血栓形成。四、對凝血系統的影響1、動物 家兔5只，購自第二軍醫大學動物房，實驗前飼養1個月，體重(2.5±0.3)kg。
2、儀器與試劑 ST4Bio型半自動血液凝固測定儀(法國Diagnostica STAGO產品)，抗肝素鈣凝血活酶，部分凝血活酶(上海貝特生物技術有限公司)，氯化鈣、檸檬酸鈉、戊巴比妥鈉皆為分析純國產試劑。
3、藥品FNL，紅花注射液(太原華衛藥業有限公司生產)。
4、方法家兔給藥前及給藥后0.5小時分別耳靜脈取血4ml，給藥途徑耳靜脈注射，給藥劑量FNL組10mg/Kg，陰性對照(溶劑組)2.5ml/Kg，陽性對照(紅花注射液)，2.5ml/Kg。按常規觀察給藥前與給藥后凝血酶原和部分凝血活酶時間的變化。給藥次數單次給藥。
5、結果見表5
表5FNL對家兔凝血系統的影響

***P＜0.001與給藥前比較由表5看出，FNL能明顯延長凝血酶原時間和部分凝血活酶時間，有利于防治血栓形成。五、急性毒性試驗實驗一單次灌胃對小鼠的急性毒性1、受試藥物FNL，配制方法臨用前用0.5％羧甲基纖維素鈉碾磨均勻，配成濃度為0.1g/ml的懸浮液。2、試驗動物種屬遠交系ICR小鼠性別雌雄各半年齡6～8周體重18～22克數量30只，雌雄各半3、試驗方法給藥途徑給小鼠單次灌胃，劑量1.0g/Kg、2.0g/Kg、4.0g/Kg給藥。4、結果小鼠單次灌胃給予FNL 1.0g/Kg、2.0g/Kg、4.0g/Kg后，小鼠的一般行為活動、飲食、皮毛、糞便及其它情況均無異常，未見明顯毒性反應。在給藥后14天內，未引起小鼠死亡。14天后解剖給藥小鼠，肉眼觀察未見明顯病變。結果表明FNL口服具有較高的安全性。實驗二靜脈注射對小鼠的急性毒性試驗1、受試藥物FNL，配制方法臨用前將FNL溶于丙二醇∶土溫-80∶水為1∶1∶8的溶劑中待用。2、試驗動物種屬遠交系ICR小鼠性別雌雄各半年齡6～8周體重18～22克數量60只，雌雄分別隨機分組，共分6組，每組10只，雌雄各半。3、試驗方法給藥途徑小鼠尾靜脈注射，容量20ml/kg；組別第1、2、3、4、5組為FNL組，給藥劑量分別為0.9g/kg、1.06g/kg、1.25g/kg、1.45g/kg、2.00g/kg，組距0.85，第6組為溶劑組(注射等體積溶劑)觀察指標觀察給藥后14天內小鼠的中毒及死亡情況，未死亡小鼠于第14天稱重后處死，解剖，檢查各臟器是否有病變。用Bliss法計算靜脈注射給予復腦素對ICR小鼠的LD50及其95％可信限。4、結果死亡小鼠經尸檢，肉眼檢查各臟器，未見明顯病變。未死亡小鼠于給藥后第14天斷頸處死，解剖，肉眼檢查各臟器未見明顯異常。根據試驗結果，計算得出靜脈注射給予FNL對小鼠的LD50為1.203g/kg，其95％可信限為1.041～1.363。相當于推薦人臨床劑量3mg/kg的400倍。說明FNL靜脈注射具有較高的安全性。
權利要求
1.山奈酚及其衍生物，化學結構通式為 其中R1，R2，R3，R4和R5基團分別代表R1H，甲基，乙?；?，羥乙基，葡萄糖基，鼠李糖基，鼠李葡糖基，葡糖鼠李糖基；R2H，甲基，乙?；?，羥乙基，葡萄糖基，鼠李糖基，鼠李葡糖基，葡糖鼠李糖基，半乳糖基，葡糖醛(苷)酸基，阿拉伯糖基，木糖基，3，4，5-三羥苯甲酰葡萄糖基，香豆酰阿拉伯糖基，阿魏酰阿拉伯糖基；R3H，甲基，乙?；u乙基；R4H，OH，甲氧基，-O-葡萄糖，-O-葡萄糖基，-O-鼠李糖基，-O-鼠李葡糖基，-O-葡糖鼠李糖基，-O-半乳糖基，-O-葡糖醛(苷)酸基，-O-阿拉伯糖基；R5H，甲基，乙?；?，羥乙基，葡萄糖基，鼠李糖基，鼠李葡糖基，葡糖鼠李糖基；其用于制備防治心腦血管疾病藥物的用途。
2.按權利要求1所述的山奈酚及其衍生物，是指山奈酚；6-羥基山奈酚；山奈酚-3-葡萄糖苷；山奈酚-3-葡糖鼠李糖苷；6-羥基山奈酚-3-葡萄糖苷；6-羥基山奈酚-3，6-二葡萄糖苷；6-羥基山奈酚-3，6，7-三葡萄糖苷；山奈酚-3，7-二鼠李糖苷；7-鼠李糖山奈酚-3-葡萄糖苷；7-葡萄糖山奈酚-3-鼠李糖苷；山奈酚-3-甲基醚；山奈酚-4’-葡萄糖苷；3-乙?；侥畏?7-葡萄糖苷；山奈酚-7-葡萄糖苷；4’-乙酰基山奈酚-7-葡萄糖苷；3-羥乙基山奈酚-7-鼠李糖苷；山奈酚-7，4’-二鼠李糖葡糖苷；山奈酚-5-甲基醚，7-葡萄糖苷；山奈酚-3-鼠李糖苷；山奈酚-3-阿拉伯糖苷；山奈酚-3-半乳糖糖苷；山奈酚-3-木糖苷；山奈酚-3-葡萄糖醛酸酯；山奈酚-3-香豆酰阿拉伯糖苷；山奈酚-3-阿魏酰阿拉伯糖苷；4’-羥乙基山奈酚；7-羥乙基山奈酚；7，4’-二羥乙基-山奈酚-3-蕓香糖苷；7-乙酰山奈酚；5-乙酰山奈酚；4’-甲基山奈酚-7-葡萄糖苷；山奈酚-5，4’-二葡萄糖苷；山奈酚-3-(3，4，5-三羥)苯甲酰葡萄糖苷。
全文摘要
本發明涉及醫藥技術領域，是山奈酚及其衍生物用于制備防治心腦血管疾病藥物的用途。紅花、燈盞花、銀杏葉等植物的花、葉已被用于防治心腦血管疾病，它們都含有山奈酚及其衍生物，但未見用這些化合物制備防治心腦血管疾病藥物的報道。本發明經系統藥理和藥效試驗，證明山奈酚及其衍生物單體有防治心腦血管疾病的作用，故可用于制備防治心腦血管疾病的藥物。
文檔編號A61K31/325GK1403080SQ02137548
公開日2003年3月19日 申請日期2002年10月21日 優先權日2002年10月21日
發明者郭美麗, 張戈 申請人:中國人民解放軍第二軍醫大學