專利名稱：一種鐘花報春花提取物及其制備方法和用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種鐘花報春花提取物，屬藥物領域。
背景技術：
自由基，是外層電子軌道上含有不配對電子的原子、原子團和分子的總稱，包括 (1)氧自由基，如超氧陰離子自由基、羥基自由基；O)脂性自由基，它是由氧自由基和多價不飽和脂肪酸作用后生成的中間代謝產物，如烷自由基、烷氧自由基和烷過氧自由基等； ⑶其他自由基，如氯自由基、甲基自由基和NO。自由基具有強氧化性，可損害機體的組織和細胞，進而引起慢性疾病及衰老反應。研究表明，炎癥、腫瘤、衰老、血液病、以及心、肝、 肺、皮膚等各方面疑難疾病的發生機理與體內自由基產生過多或清除自由基能力下降有著密切的關系。因此，降低體內自由基的損害顯得尤為重要。目前，多使用自由基清除劑(又稱抗氧化劑)來降低體內自由基含量。自由基清除劑是具有清除自由基作用的物質，常見的有抗氧化酶SOD、維生素E、C、硒、輔酶Q、谷胱甘肽等單體活性物質。同時，研究人員也發現，中藥在清除自由基中也發揮著重要作用，如人參、 三七、丹參、女貞子、黃精、首烏、靈芝、麥冬、虎杖等單味中藥材，以及生脈飲等中藥復方，均具是優異的自由基清除劑。鐘花報春(Primula sikkmensis Hook)是一種常見的藏藥材，屬于報春花科報春花屬植物，以花入藥，是藏藥“相相直吾”其中的一種原植物。花黃色，鐘狀，聚生于花葶頂端，主產于西藏東部及南部、青海東南部、四川西部、云南西北部；生于海拔3750-4500米的林緣濕草地、水溝邊；分布于尼泊爾、錫金、不丹、緬甸。具有清熱解毒，瀉肝膽火、止血等作用，還能用于心脈瘀阻、血脈不暢，療效確切，在甘孜藏族地區廣泛使用，資源十分豐富。邱建平等利用正交試驗研究了從鐘花報春的花中提取總黃酮的優選工藝，指出以 60%乙醇，20倍溶媒用量，回流提取3次，每次1小時，提取得到的總黃酮含量較高，提取物中總黃酮含量可達到7%左右。(邱建平，等，正交設計優化鐘花報春花總黃酮提取工藝，成都醫學院學報，2009年4卷4期)。目前，還未見將鐘花報春花總黃酮的用于清除自由基的報道。

發明內容
本發明的目的在于提供一種鐘花報春花提取物。本發明的另一目的是提供該提取物的制備方法和用途。本發明提供了一種鐘花報春花提取物，該提取物中總黃酮的含量以蘆丁計不得低于 50% w/w。其中，所述的鐘花報春花提取物來源于報春花科報春花屬植物鐘花報春!Simula sikkimensis Hook的花的提取物。進一步地，該提取物中總黃酮的含量以蘆丁計為50-60% w/w。更進一步地，該提取物中總黃酮的含量以蘆丁計為50-55% Wi
本發明還提供了一種制備上述提取物的方法，它包括如下步驟(1)取鐘花報春花，以50-95% V/V乙醇提取，合并提取液備用；(2)將步驟(1)中的提取液回收乙醇后，用正丁醇萃取，將正丁醇層回收正丁醇后，上大孔吸附樹脂，先用水洗脫至不發生三氯化鐵反應和鹽酸鎂粉反應，再用30% -95% 的乙醇洗脫，收集洗脫液，回收溶劑后，干燥，即得鐘花報春花提取物。進一步地，步驟(1)中采用50-70% V/V乙醇提取；步驟O)中選用30-40% V/V 乙醇進行洗脫。進一步優選地，步驟⑴中采用60% V/V乙醇提取；步驟⑵中選用30% V/V乙醇進行洗脫。更進一步優選地，步驟⑴中采用60% V/V乙醇提取3次。步驟⑵中選用30% V/V乙醇進行洗脫，洗脫至不發生三氯化鐵反應和鹽酸鎂粉反應。本發明還提供了上述鐘花報春花提取物在制備自由基清除劑中的用途。進一步地，所述自由基清除劑為超氧陰離子自由基清除劑、羥基自由基清除劑、 DPPH自由基清除劑。本發明還提供了一種抗氧化的保健品或/和藥物組合物，它是由上述的鐘花報春花提取物為活性成分，加上藥學上常用的輔料或輔助性成分制備而成的制劑。本發明鐘花報春花提取物對超氧陰離子自由基、羥自由基、DPPH自由基均具有良好的清除能力，表明鐘花報春花提取物具有良好的抗氧化作用，為抗氧化的保健品或/和藥物提供了一種新的選擇。
具體實施例方式實施例1本發明鐘花報春花提取物的制備取干燥的鐘花報春花粗粉，加入20倍量60%乙醇浸泡后，加熱回流提取3次，每次 lh，趁熱抽濾，合并濾液，減壓回收至無醇味后，加入適量蒸餾水后，用正丁醇萃取，減壓回收正丁醇溶液至無正丁醇味后，加入適量蒸餾水溶解，過濾后，濾液上經預處理的DlOl大孔吸附樹脂，先用蒸餾水洗脫至不發生三氯化鐵反應和鹽酸鎂粉反應，然后用30%乙醇洗脫，收集洗脫液，直至不發生三氯化鐵反應和鹽酸鎂粉反應，合并洗脫液，回收溶劑后，干燥即得鐘花報春花提取物，其中，總黃酮以蘆丁計含量為52. 5%。本發明鐘花報春花提取物的制備方法不限于實施例中所述的方式，現有的黃酮提取方法均能用于對鐘花報春花提取物的提取，如堿水提取等；對總黃酮的精制也可采用其他型號的大孔吸附樹脂進行精制，洗脫溶劑除采用乙醇以外，也可以采用弱堿溶液進行洗脫，也可提高黃酮含量。實施例2鐘花報春花提取物制備方法的篩選1.總黃酮含量測定方法1.1對照品溶液的制備取蘆丁對照品0. 01006g，置于50ml容量瓶中，加60 %乙醇定容至刻度，制得濃度為0. 2012mg/ml的對照品溶液，備用。1.2樣品溶液的制備按照各制備方法制備得到的浸膏轉移至IOOml容量瓶中，并定容至刻度，從此溶液中精密移取IOml于IOOml容量瓶中，并用60%乙醇定容至刻度，即制得樣品溶液，備用。1.3測定波長的確定精密移取對照品溶液7ml和供試品溶液2ml，分別置于2支25ml容量瓶中，均加入 60 %乙醇稀釋至7ml，混勻，加5 %亞硝酸鈉溶液Iml，搖勻，放置6min，再加10 %硝酸鋁溶液 lml，搖勻，放置6min，加氫氧化鈉溶液10ml，再加60%乙醇至刻度，搖勻，放置15min，以相應試劑為空白，照紫外可見分光光度法(《藥典》05年版附錄VA)，在200-800nm進行掃描， 測得對照品溶液和樣品溶液的最大吸收波長分別為506. 5Inm和498. 67nm。兩者的最大吸收波長接近，因此確定506nm為測定波長。1.4標準曲線的制備精密量取對照品溶液(0.2012mg/ml) 0. 0ml, 1. Oml，2. Oml，3. Oml，4. Oml，5. Oml，
6.Oml，7. Oml，分別置于25ml容量瓶中，各加60 %乙醇至7. Oml，加5 %亞硝酸鈉溶液 (0. 050g/ml) 1. 0ml，搖勻，放置 6min，再加 10%硝酸鋁溶液(0. 09972g/ml) 1. 0ml，搖勻，放置6min.加氫氧化鈉試液(0. 04308g/ml) 10ml，再加60%乙醇至刻度，搖勻，放置15min,以相應試劑為空白，找紫外可見分光光度法(《藥典》05版附錄VA)，在506nm波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線。求得的標準曲線方程為Y = 12. 785X-0. 001 R2 = 0. 9992。1.5樣品液的測定從供試品溶液中精密移取細1于1支25ml容量瓶中，然后用60%乙醇溶液稀釋至
7.0ml，然后按照對照品溶液的顯色方法顯色。精密量取60%乙醇細1，作為空白對照，后續顯色處理同上述對照品。在506nm處測定吸光度A，由標準曲線的回歸方程計算總黃酮含量。2、本發明鐘花報春花提取物的提取方法考察2. 1單因素方法考察本實驗以不同乙醇濃度為考察因素，以鐘花報春中總黃酮得率為考察指標，篩選鐘花報春中總黃酮的最佳提取工藝條件。2. 1. 1儀器與材料(1)儀器與試藥UV-2500 型紫外-可見分光光度計 PerkinElmer Lambda 35UV/VISSpectrometer ； 熱回流裝置，超聲儀，R-201旋轉蒸發器(上海申順生物科技有限公司)，DZF-6021型真空干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司)，瑞士 PAG-160A電子天平，FAl 104電子天平(上海精天電子儀器廠)，電子恒溫不銹鋼水浴鍋(上海宏興機械儀器實業制造公司)，DGG-9140B電熱恒溫鼓風干燥箱(上海森信實驗儀器有限公司)，SHE-III循環水真空泵(上海亞榮生化儀器廠)，蘆丁對照品(中國藥品生物制品檢定所，供含量測定用，批號為10080-200707)， 95 %乙醇，90 %乙醇，80 %乙醇，70 %乙醇，60 %乙醇，5 %亞硝酸鈉溶液；10 %硝酸鋁溶液； 4. 3%氫氧化鈉溶液以上試劑均為分析純。實驗用水系重蒸水。(2)實驗藥材鐘花報春花由重慶中藥研究所涂永勤博士鑒定為鐘花報春!Simula sikkimensis Hook 的干燥花。2. 1. 2方法與結果
(1)總黃酮的提取取I號內鐘花報春花適量于托盤內鋪開，同時取II號內鐘花報春花適量于另一托盤內鋪開，一起放入烘箱中，30°C干燥過夜。將烘干的藥材快速地用打粉機打成粗粉，然后平鋪于托盤中，置于烘箱中30°C干燥一定時間(約2小時)然后用袋子封裝好置于干燥器中保存備用。分別精密稱取I號藥材粉末5. 000g, 4. 998g，4. 998g，4. 996g，4. 997g，置于5 支250ml潔凈的圓底燒瓶中，分別加入IOOml的95%，90%，80%，70%，60%乙醇浸泡藥材 30分鐘。分別精密稱取II號藥材粉末4. 997g，5. 000g, 4. 998g，4. 999g，5. 002g，置于5支 250ml潔凈的圓底燒瓶中，然后同I號藥材粉末一樣處理。將I號和II號中每兩個所用乙醇濃度相同的樣品置于同一水浴鍋中回流提取2小時，60 %，70 %，80 %，90 %，95 %乙醇的水浴溫度分別為86°C，85°C，84. 5°C，83. 5°C，82. 5°C，然后分別趁熱抽濾，濾渣再加IOOml 同第一次提取的溶劑回流提取2次，每次1小時，然后合并濾液備用。(配制不同濃度乙醇溫度為18°C )。洗10個大小基本一致的蒸發皿，置減壓干燥箱中減壓60°C干燥過夜備用。 蒸發皿減壓干燥后分別精密稱重，重量如下所示表1不同乙濃度干燥后的重量
I 95% I 90% I 80%I 70% I 60%1195% 1190% II80% 1170% 1160%蒸發皿重(g)41. 991 38. 164 45.574 43. 516 41,.417 40. 902 45. 957 43. 518 45. 933 45. 178將各自合并的濾液分別減壓濃縮(旋轉蒸發儀濃縮是的水浴溫度為50°C )到一定程度，然后轉移至相應的蒸發皿中，60°C水浴揮干，然后將含浸膏的蒸發皿置減壓干燥器中 60°C減壓干燥過夜。含浸膏的蒸發皿經壓干燥后，精密稱定各含膏蒸發皿總重，結果如下表所示表 2
I 95%I 90%I 80%I 70%I 60%1195%1190%II80%1190%II60%蒸發皿重41.99138.16445.57443.51641.14740.90245.95743.51845.93345.178(g)含膏蒸發43.24239.60747.22945.20443.05842.45847.70145.46248.01747.302皿重(g)浸膏重(g)1.2511.4431.6551.6881.6411.5561.7441.9442.0842.124由上表數據經處理得“不同濃度乙醇提取浸膏情況”，結果表明60%乙醇提取的浸
膏量最多。各浸膏用各自的提取溶劑溶解并定容于IOOml容量瓶中，并超聲處理，使其全部溶解，放冷至室溫，備用。2. 1.3樣品液的測定分別從供試品溶液I 95%,90%,80%, 70%,60%, 1195%,90%,80%, 70%,60% 中精密移取7ml, 5ml, 4ml, 4ml, 7ml, 5ml, 5ml, 4ml, 4ml于10支25ml容量瓶中，然后分別用各自相應濃度的乙醇溶液稀釋至7ml，然后按照對照品溶液的顯色方法顯色。然后以各自試劑為空白對照，分別在500nm和506nm處測定吸光度A，結果如下表所示
表3各樣品吸光度情況
權利要求
1.一種鐘花報春花提取物，其特征在于該提取物中總黃酮的含量以蘆丁計不得低于 50% w/w。
2.根據權利要求1所述的提取物，其特征在于該提取物中總黃酮的含量以蘆丁計為 50-60% w/w。
3.根據權利要求2所述的提取物，其特征在于該提取物中總黃酮的含量以蘆丁計為 50-55% w/w。
4.根據權利要求1-3任意一項所述的提取物，其特征在于所述的鐘花報春花提取物來源于報春花科報春花屬植物鐘花報春!Simula sikkimensis Hook的花的提取物。
5.一種制備權利要求1-4任意一項所述的提取物的方法，它包括如下步驟(1)取鐘花報春花，以50-95%V/V乙醇提取，合并提取液備用；(2)將步驟(1)中的提取液回收乙醇后，用正丁醇萃取，將正丁醇層回收正丁醇后，上大孔吸附樹脂，先用水洗脫至不發生三氯化鐵反應和鹽酸鎂粉反應，再用30% -95%的乙醇洗脫，收集洗脫液，回收溶劑后，干燥，即得鐘花報春花提取物。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于步驟⑴中采用50-70%V/V乙醇提取； 步驟O)中選用30-40% V/V乙醇進行洗脫。
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于步驟⑴中采用60%V/V乙醇提取；步驟 ⑵中選用30% V/V乙醇進行洗脫。
8.權利要求1-4任意一項所述的鐘花報春花提取物在制備自由基清除劑中的用途。
9.根據權利要求8所述的用途，其特征在于所述自由基清除劑為超氧陰離子自由基清除劑、羥基自由基清除劑、DPPH自由基清除劑。
10.一種抗氧化的保健品或/和藥物組合物，其特征在于它是由權利要求1-4任意一項所述的鐘花報春花提取物為活性成分，加上藥學上常用的輔料或輔助性成分制備而成的制劑。
全文摘要
本發明提供了一種鐘花報春花提取物，該提取物中總黃酮的含量以蘆丁計不得低于50％w/w。本發明鐘花報春花提取物對超氧陰離子自由基、羥自由基、DPPH自由基均具有良好的清除能力，表明鐘花報春花提取物具有良好的抗氧化作用，為抗氧化的保健品或/和藥物提供了一種新的選擇。
文檔編號A61P39/06GK102423324SQ20111042861
公開日2012年4月25日 申請日期2011年12月20日 優先權日2010年12月20日
發明者張旭, 彭騰, 李鴻翔, 賀鋼民, 鄧赟, 邱建平 申請人:成都中醫藥大學