專利名稱：防止蛋白質c降解的方法
技術領域：
本發明涉及酶學，特別是涉及防止被活化的蛋白質C降解的方法。
蛋白質C是絲氨酸蛋白酶和天然存在的抗凝劑，它在調節止血中通過激活凝血級聯中的因子Ⅴa和Ⅷa而發揮作用。人類蛋白質C是作為有461個氨基酸的單一多肽在體內主要在肝臟中產生的。該前體分子受到多重轉譯后修飾，包括1)裂解42氨基酸信號序列;2)從一鏈酶原上蛋白水解除去155位上的賴氨酸殘基和156位上的精氨酸殘基以得到二鏈形式的分子(即155個氨基酸殘基的輕鏈通過二硫橋鍵連接到含絲氨酸蛋白酶的262個氨基酸殘基的重鏈上);3)群集在輕鏈前42個氨基酸殘基中的9個谷氨酸殘基經維生素K依賴性羧化作用，產生9個γ-羧基谷氨酸殘基;4)在4個位點上連接糖(1個在輕鏈中，3個在重鏈中)。重鏈含有已明確證實的有Asp257、His 211和Ser360三位組合的絲氨酸蛋白酶。最后，在鈣離子存在下，在體內于磷脂表面由凝血酶激活循環的2鏈酶原。由于除去重鏈N末端的十二肽而導致的活化作用，產生具有酶促活性的被激活的蛋白質C(aPC)。
在用大量和高濃度aPC進行的工作中，觀察到在重鏈308位賴氨酸處的蛋白水解剪切部分。該剪切所產生的N末端序列以Glu-Ala-Lys開始，并從重鏈的C末端產生稱為“EAK片段”的111氨基酸片段。EAK片段沒有通過二硫鍵共價連接到輕鏈上或重鏈上的N末端部分上。EAK片段還含有絲氨酸蛋白酶的活性位點絲氨酸，但沒有Asp或His殘基。因此，發現帶有EAK片段的蛋白質C制劑已改變了抗凝血劑活性。本發明包括通過在變性劑中，或在極端鹽濃度中于降低的pH下保存分子以防止或減少蛋白質C分子降解的方法。
為描述本發明的目的，對本文中使用的術語定義如下。
aPC-活化的人蛋白質C。
APTT-活化的部分組織促凝血酶原激酶時間。
AU-酰胺水解單位。
BME-β-巰基乙醇。
CHES-2[N-環己基氨基]乙烷磺酸。
EAK片段-在蛋白質C重鏈的308位剪切而產生的111氨基酸片段。
EDTA-乙二胺四乙酸。
HEPES-N-2-羥乙基哌嗪-N′-2-乙烷磺酸。
HPC-人蛋白質C酶原。
MEA-2-氨基乙醇。
MES-2-(N-嗎啉代)-乙烷磺酸。
新生蛋白質-在mRNA轉錄本轉譯后產生的，進行任何轉譯后修飾之前的多肽。但例如谷氨酸殘基的β羧化和天冬氨酸殘基的羥化等轉譯后修飾作用可能在從mRNA轉錄本完全轉譯成蛋白質之前開始出現。
蛋白質C活性-負責蛋白質水解、酰胺水解、酯水解和生物學(抗凝血或血纖維蛋白溶解)活性的人蛋白質C的任何性質。試驗蛋白質C抗凝血和酰胺水解活性的方法是本領域中已知的(參見Grinnellet al.，1987，Bio/Technology51189-1192)。
rHPC-重組產生的人蛋白質C酶原。
酶原-蛋白水解酶的酶學無活性前體。本文所說的蛋白質C酶原是指一鏈或二鏈的，分泌的、無活性形式的蛋白質C。
本說明書中所用的所有氨基酸縮寫都是如37 C.F.R.§1.822(b)(2)(1990)中所列的被美國專利與商標局接受的氨基酸縮寫詞。
本發明涉及防止或最大限度減少活化的蛋白質C自發降解的方法。本發明是通過在低pH下，例如，在大約pH6.3至pH7.0條件下完成活化的蛋白質C的加工、純化和/或儲存而給出最佳實例的。也可在3M尿素中保溫aPC(在除去變性劑后得以完全回收aPC活性)，或在極端鹽濃度的存在下保溫aPC來盡可能地減少aPC的自發降解。為本公開的目的，極端鹽濃度是指鹽濃度在大約0.4摩爾以上或大約0.05摩爾以下。本發明也包括使aPC保持在低pH，在變性劑中，或在極端鹽濃度下的aPC配制品。
蛋白質C在維持止血中的作用，已激發了對使用該化合物作為多種血管病的治療劑的很大興趣。在工業規模上生產高水平和高濃度的人蛋白質C已暴露出這樣一個事實，即該分子可發生自發降解而導致抗凝血活性的降低。aPC的自發降解導致從重鏈的C末端形成一個稱為“EAK片段”的111氨基酸片段。EAK片段沒有通過二硫鍵共價連接到輕鏈上或重鏈的N末端部分上。EAK片段還包括絲氨酸蛋白酶的活性位點絲氨酸殘基，但沒有Asp或His殘基。因此，由于存在蛋白水解修剪，帶有EAK片段的蛋白質C制劑已改變了抗凝血活性。
為了最大限度地減少或防止導致形成EAK片段的自發降解，可將完整的被活化的蛋白質C分子保存在大約6.3至7.0之間的pH條件下。在整個純化和活化過程中，以及在最終的配制溶液中，均可使分子保持在這一范圍的pH條件下。可使用許多不同的緩沖液體系來維持溶液的pH。有代表性的緩沖液體系包括Tris-乙酸鹽、檸檬酸鈉、檸檬酸鹽-甘氨酸和磷酸鈉。熟練的技術人員將會理解到，可以利用其他許多也可用于本發明方法中的緩沖液體系。
本發明的另一方面涉及將活化的蛋白質C分子保存在具有極端鹽濃度的溶液中，以防止或減少EAK片段的形成。例如，在pH7.0的磷酸鈉緩沖液中，當緩沖液中沒有鹽時EAK片段生成最少。但在pH7.0的磷酸鈉緩沖液中，當緩沖液內存在濃度約0.4M的氯化鈉時EAK片段生成也最少。在這兩個鹽濃度之間，EAK片段以可變的速度形成;但熟練的技術人員將會理解到，鹽濃度保持在0.05M以下或0.4M以上時，將最容易防止或減少EAK片段的形成。雖然當溶液的pH保持在大約pH7.0，且不向溶液中加鹽時可得到最好的醫藥配制品，但使用低于0.05M的其他鹽濃度(如0.01M或0.005M)也是可取的。熟練的技術人員可以理解到，在藥物加工和配制中可以使用許多不同的鹽。可用于本發明的有代表性的鹽包括氯化鉀、氯化鈉，以及最優選的氯化鈉。
本發明的再一個方面涉及通過在變性劑存在下進行純化和/或配制來防止或盡可能減少活化的蛋白質C自發降解。可使用許多不同的變性劑，但最優選的變性劑是濃度為大約3M的尿素。
本發明不只限于生產被活化的蛋白質C的方法。雖然最有效的是使用重組DNA技術生產活化的蛋白質C，但最近大規模純化技術的進展已允許從人血清中分離顯著量的活化的蛋白質C。得到如此大量的蛋白質C，即可一次加工高濃度的活化的蛋白質C。如上所述，發明人發現活化的蛋白質C的濃度在每毫升約50毫克以上時，證明有伴隨抗凝血劑活性降低的活化的蛋白質C分子的自動降解，最重要的是，自動降解的速率隨著溶液中活化的蛋白質C的濃度增加而增加。然而在工業水平上，不能以很低的蛋白質濃度有效地進行大規模純化處理。
從活化的蛋白質C生產的工業和醫藥實用性角度看，必須在遠超過50毫克的濃度下加工該分子，本發明即可使熟練的技術人員在沒有明顯丟失產品活性的情況下大量生產該產品。另外，本發明的配方允許以比現有技術已知配制品更長的時間穩定地儲存活化的蛋白質C溶液。
熟練的技術人員將會理解到，本發明的方法將會使實踐本發明的人能夠以比以前可達到的濃度更高的濃度制得更大體積的活化的蛋白質C，而不必害怕因自動降解造成產品丟失。另外，可以按照Toylor，Jr.等人的美國專利5，009，889號中所述方法很容易地使用本發明的穩定的藥物配制品治療患有身體病癥的病人。
下列實施例是為舉例說明本發明而提供的，它們并不構成對本發明的限制。
實施例1人蛋白質C的生產可按照本領域技術人員已知的，例如美國專利4，981，952號(Yan)中所述的技術(該文獻全文列為本文參考文獻)，在人腎293細胞中生產重組人蛋白質C(rHPC)。Bang等人在美國專利4，775，624號(其全文列為本文參考文獻)中公開要求保護了編碼人蛋白質C的基因。用于在293細胞中表達人蛋白質C的質粒是Bang等人在美國專利4，992，373中公開的質粒pLPC。歐洲專利申請0445939號中，以及Grinnell等人在Bio/Technology 5∶1189-1192(其內容也列為本文參考文獻)中也描述了質粒pLPC的構建。簡單地說，將質粒轉染到293細胞中，然后鑒定穩定的轉化體，再培養并使之生長在無血清培養基中。發酵后，經微過濾得到無細胞培養基。
按照美國專利4，981，952號中公開的Yan的技術從培養液中分離出人蛋白質C。澄清的培養基配制到濃度達4mM的EDTA中后，使其吸附到陰離子交換樹脂(Fast-Flow Q，Pharmacia)上。用4倍柱體積的20mM Tris、200mM NaCl(pH7.4)和2倍柱體積的20mM Tris、150mM NaCl(pH7.4)洗柱后，用20mM Tris、150mM NaCl、10mM CaCl2(pH7.4)洗脫結合的重組人蛋白質C酶原。洗脫后用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法判斷，洗脫的蛋白質純度大于95%。
為進一步純化該蛋白質，將蛋白質溶在濃度達3M的NaCl中后，吸附到在20mM Tris、3M NaCl、10mM CaCl2，pH7.4中平衡的疏水相互作用樹脂(Toyopearl Phenyl 650M，TosoHaas)上。用2倍柱體積沒有CaCl2的平衡緩沖液洗柱后，用20mM Tris，pH7.4洗脫重組人蛋白質C。制備洗脫的蛋白質，以通過除去殘留的鈣而使之活化。使重組人蛋白質C通過金屬親和柱(Chelex-100，Bio-Rad)以除去鈣并再次結合到陰離子交換劑(Fast-Flow Q，Pharmacia)上。這兩個柱串聯排列并在20mM Tris、150mM NaCl、5mM EDTA，pH7.4中平衡。蛋白質上柱后，用1倍柱體積的同一緩沖液洗Chelex-100柱，然后從串聯系列上將其斷開。用3倍柱體積的平衡緩沖液洗陰離子交換柱后，用0.4M NaCl、20mM Tris-乙酸鹽，pH6.5洗脫蛋白質。通過在UV 280nm的消光值上測定重組人蛋白質C和重組活化的蛋白C溶液的蛋白質濃度(E0.1%分別為1.85或1.95)。
實施例2重組人蛋白質C的激活在50mM HEPES、pH7.5存在下，于4℃將牛凝血酶偶聯到活化的CH-Sepharose 4B(Pharmacia)上。偶聯反應在已裝入柱中的樹脂上進行，每毫升樹脂約使用5000單位凝血酶。凝血酶溶液通過柱約循環3小時后，加入MEA達到每升循環溶液0.6ml的濃度。使含有MEA的溶液繼續循環10-12小時，以確保完全封閉樹脂上未反應的胺。封閉后，用10倍柱體積的1MNaCl、20mM Tris、pH6.5洗偶聯了凝血酶的樹脂，以除去所有非特異性結合的蛋白質，并在激活緩沖液中平衡后用于活化反應。
將純化的rHPC加于EDTA中使濃度達5mM(以螯合任何殘留的鈣)，并用20mM Tris、pH7.4或20mMTris-乙酸鹽、pH6.5將蛋白質稀釋到2mg/ml的濃度，使該材料通過37℃用50mM NaCl和20mM Tris(pH7.4)或20mM Tris-乙酸鹽(pH6.5)平衡的凝血酶柱。調整流速以使rHPC與凝血酶樹脂之間的接觸時間約為20分鐘。收集流出液并立即進行酰胺水解活性分析。如果該材料沒有與已確定的aPC標準品差不多的比活性(酰胺水解活性)，則使之再次通過凝血酶柱循環，以完全激活rHPC。然后用20mM上述pH為7.4或6.5的緩沖液以1∶1比例稀釋該材料以使aPC保持在低濃度，同時等待進行下一加工步驟。
將aPC結合到已在含150mM NaCl的活化緩沖液(20mM Tris，pH7.4或20mMTris-乙酸鹽，pH6.5)中平衡的陰離子交換樹脂(Fast-FlowQ，Pharmacia)上，以從aPC材料中除去濾出的凝血酶。在這些條件下凝血酶不與陰離子交換樹脂作用，但可通過柱進入流出液中。一旦aPC上柱后，即用2-6倍柱體積的20mM平衡緩沖液洗柱，然后用加在5mM Tris-乙酸鹽，pH6.5或20mM Tris，pH7.4中的0.4MNaCl洗脫結合的aPC。用較大體積緩沖液洗柱有利于更充分地除掉十二肽。將從該柱洗脫的材料以冷凍溶液(-20℃)形式或作為凍干粉末儲存。
使用Beckman DU-7400二極管陣列分光光度計檢測從合成底物H-D-Phe-Pip-Arg-對位硝基酰苯胺(S-2238)(購自Kabi Vitrum)釋放的對位硝基苯胺，以確定aPC的酰胺水解活性(AU)。1單位激活的蛋白質C定義為使用9620M-1cm-1的對位硝基苯胺在405nm處的消光系數，在1分鐘內釋放1μmol對位硝基苯胺(25℃，pH7.4)所需酶的量。
在激活的部分組織促凝血酶原激酶時間(APTT)凝血試驗中，檢測凝血時間的延長以確定被激活的蛋白質C的抗凝血活性。在稀釋緩沖液(1mg/ml放射免疫試驗級BSA、20mM Tris，pH7.4，150mM NaCl，0.02% NaN3)中制備蛋白質C濃度范圍為125-1000ng/ml的標準曲線，同時在該濃度范圍內以幾個稀釋度制備樣品。向各樣品容器內加入50μl冷馬血清和50μl重新配制的激活的部分組織促凝血酶原激酶時間試劑(APTT Reagent，Sigma)，并于37℃保溫5分鐘。保溫后，向各小瓶內加入50μl適當的標準樣品。用稀釋緩沖液代替樣品或標準品以確定基礎凝血時間。在向各樣品或標準品中加入50μl的30mM CaCl2(37℃)后，立即開始纖凝計(fibrometer)(CoA Screener Hemostasis Analyzer，American Labor)的計時。根據標準曲線的線性回歸方程計算樣品中的激活的蛋白質C濃度。這里所報告的凝血時間是包括標準曲線樣品在內的這次重復之最小值的平均數。
為了制備用于比較研究的樣品，于25℃保溫44小時后或者于4℃在陰離子交換樹脂(FFQ，Pharmacia)(pH7.4)上濃縮后，使aPC(7.3mg/ml，在20mMTris、150mM NaCl中)完全自動降解。對樣品進行酰胺水解活性分析、HPLC分析、N末端序列測定和SDS-PAGE分析，以進一步證實和確定自動降解的量，以及氨基酸序列上的裂解位點。
實施例3激活的蛋白質C穩定性試驗監測AU以檢查pH對aPC活性的影響。以使用各50mM MES(pH5.5-7)、HEPES(pH6.8-8.2)和CHES(pH8.6-10)的三個緩沖系統確立范圍為6-9.3的pH條件(以0.3pH單位逐漸增加)。用適當的pH緩沖液將aPC稀釋到0.4mg/ml的終濃度，并在此濃度保溫，然后檢測活性。使用在保溫pH下進行的酰胺水解試驗，于保溫開始時和4℃保溫30小時后分析各樣品。這些檢測結果顯示出酰胺水解活性對pH的鐘形pH依賴性曲線。結果示于下列表Ⅰ中。
表1酰胺水解速率(IU/mgaPC)pH0小時30小時6.01.631.586.64.004.637.29.166.687.811.269.268.47.055.169.03.533.53
pH7.4時顯示aPC有最大活性，而在6和9.3的極端pH時則顯示出大大降低的活性。雖然在極端pH時aPC似乎保留某些酰胺水解活性，但這一數據揭示可通過避免使aPC有最大活性的pH條件來減少自發降解。
為了確定是否aPC的酰胺水解活性對pH的依賴性是EAK片段形成的函數，于pH6.0、7.5和9.0條件下，將1.5mg/ml的aPC樣品于4℃保溫18小時。對EAKHPLC峰下面積進行積分，并定量觀察SDS-PAGE上的EAK帶來檢測所形成的EAK的量。這些數據顯示，在pH6.0條件下保溫過程中EAK產生量沒有增加，而在pH7.5時約增加30%，且在pH9.0時增加50%，盡管在pH7.5和9.0樣品中有提高的EAK片段水平，但當在pH7.4條件下檢測時，該制劑仍有高的AU活性。因此，EAK片段的產生為一定與酰胺水解活性相關。確切地說，EAK片段必須一直保持與aPC重鏈之其余部分的足夠聯系，以維持絲氨酸蛋白酶功能性。如果有所區別的話，較高EAK片段含量是與較高酰胺水解活性相關聯的。
EAK片段含有催化三元組(包括見于重鏈N末端部分中的His 211和Asp 257)的活性位點絲氨酸(殘基360)。因此，如果EAK片段沒有共價連接到重鏈的其余部分上，則該蛋白水解剪切就可能導致酶促活性降低。為了探討不同量的EAK對抗凝血活性的影響，按照實施例1和2中所述方法制備不同的幾批aPC。用濃度范圍為22-198μM的底物(＃S-2238)，濃度范圍為1.6-3.3nM(75-150ng/ml，在20mM Tris，pH7.4，150mM NaCl中)的aPC進行酰胺水解試驗。結果示于下列表Ⅱ中。
表Ⅱ百分EAK含量與比活性(酰胺水解和抗凝活性)的關系比活性樣品序號%EAKAU/mgAPTT/mg131.132.112191.351.73351.521.374511.641.005671.680.78利用降解的pH依賴性產生含不同量EAK的aPC樣品，按上文實施例1和2中所述方法制備這些樣品，將有不同含量EAK片段的樣品與完整的aPC(＜3%EAK片段)相比較。以三個不同的酶濃度檢測各批樣品的酰胺水解動力學參數，包括Km、Kcat和Vmax值。結果總結于表Ⅲ中。
表Ⅲ動力學數據樣品序號[aPC]KmVmaxKcat(% EAK)ng/ml(mM)(umol/ml/分)(1/秒)1(20%)1500.129102711130.1286346.61750.1987136.72(67%)1500.18106728.221130.1897297.52750.1899307.63(100%)1500.161314210.131130.1423371.83750.183160.2在實驗變量內，三個aPC樣品的Km值看來是相同的，并且顯示0.16mM底物平均值。這一結果提示，在被降解的aPC中對S-2238底物的親和性沒有被破壞。令人驚奇的是，降解的材料仍然具有基本上與完整aPC相似的AU活性。
既使有高EAK片段含量，被活性的蛋白質C亦可能對三肽底物(＃S-2238)有完整的酰胺水解功能。可在APTT試驗中檢測體外抗凝活性。
意想不到的是，高AU活性與抗凝活性無相互關聯。雖然AU活性隨著EAK含量的增加而增加，但APTT活性卻隨著EAK含量增加而降低。
在不同的pH水平和鹽濃度下保溫被活化的蛋白質C的樣品，然后每小時檢測EAK片段形成的百分數，以研究鹽濃度對EAK片段形成和被活化的蛋白質C穩定性的影響。檢測中所用蛋白質C濃度為每毫升4-5毫克。所有檢測實驗均在5-20mM磷酸鹽緩沖液中進行。使用的鹽(當存在鹽時)是氯化鈉，并且所有檢測都在25℃下完成。用HPLC積分法測定每小時形成的EAK片段的百分量。結果示于下列表Ⅳ中。
表Ⅳ鹽濃度對EAK片段形成的影響pH鹽濃度形成的EAK百分量/小時6.4400nM0.0947.0400mM0.1456.450mM0.2927.050mM0.3656.400.0387.000.09權利要求
1.最大限度減少活化的蛋白質C降解的方法，該方法包括將所說的活化的蛋白質C保存在pH約為6.3至7.0溶液中。
2.根據權利要求2的方法，其中所說的溶液具有低于約0.050M或高于約0.40M的鹽濃度。
3.根據權利要求2的方法，其中所說的溶液具有低于約0.050M的鹽濃度。
4.根據權利要求2的方法，其中所說的溶液具有低于約0.010M的鹽濃度。
5.根據權利要求2的方法，其中溶液中的鹽是氯化鈉。
6.最大限度減少活化的蛋白質C降解的方法，該方法包括將所說的活化的蛋白質C保存在含有變性劑的溶液中。
7.穩定的藥物配制品，其包含加在pH約為6.3至7.0的溶液中的活化的蛋白質。
8.根據權利要求7的藥物配制品，其進一步包含濃度低于約0.050M或高于約0.4M的鹽。
9.根據權利要求8的藥物配制品，其中鹽濃度低于約0.05M。
10.根據權利要求7的藥物配制品，其中緩沖液選自Tris-乙酸鹽、檸檬酸鈉、檸檬酸鹽-甘氨酸和磷酸鈉。
全文摘要
本發明涉及阻止或最大限度減少被活化的蛋白質C自發降解的方法。作為最佳實例，本發明是在低pH下，例如pH約6.3至6.5條件下加工、純化和/或儲存被活化的蛋白質C而完成的。也可以在3M尿素中保溫aPC(除去變性劑后完全回收aPC活性)，或在極端鹽濃度存在下保溫aPC而最大限度地減少aPC的自發降解。本發明還包括將aPC保存在低pH條件下的、變性劑中的或極端鹽濃度下的aPC配制品。
文檔編號A61K47/02GK1109891SQ95101130
公開日1995年10月11日 申請日期1995年1月4日 優先權日1994年1月5日
發明者小·W·F·普勞蒂, J·塞克尼克 申請人:伊萊利利公司