專利名稱：用于免疫調節和佐劑治療的藥物組合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種用于免疫調節和佐劑治療及預防免疫體系減弱的藥物制品。
目前用于治療各種免疫缺陷、自身免疫病及惡性病的免疫調節組合物可根據它們的組成和起源分為幾組。這些組合物的重要一組例如通胸腺激素形成，此胸腺激素可從動物組織提取產生，并在指定的Thymus V—fraction(Hoffmann LaRoche)、Thymodulin和Leu-cotropina(Ellem)、Thymunox(Cilag)或TFX(Poffa)范圍內分布。另一組特別是在基礎醫學研究領域頗受注意的免疫調節化合物是細胞因子，細胞因子是在細胞水平控制免疫應答的主要化合物。基因工程技術使重組蛋白質易于制備，它們是免疫調節組合物中活性成份，例如，Roferon(干擾素α2)、(Hoffmann LaRoche)、或血小板生成因子G—CSF(Hoffman LaRoche)分布在指定的Neupogen范圍內。在感染的免疫療法會議上(Berlin，1993年5月4—7日)使用IL—2的經典療法已經討論了，特別討論了在部分患者失敗的觀點。白細胞的透析液也是很流行的免疫調節劑。在捷克共和國，它們被稱為轉移因子(Sevac)。依賴于選擇的抗原的佐劑活性的化合物屬于最古老的和仍常用的試劑，此抗原源于細菌細胞膜的成份，例如，Stava(Sevac)、Olimostimulin(Medical Faculty of the Palacky Uniuersity，Olo-mouc，)。東方醫藥，特別是中國醫藥，以古老的傳統為基礎，注重于植物起源的免疫刺激化合物，及根據本歐洲研究(感激的免疫療法，Berlin，1993年5月4—7日)水平它們的活性機制。
來自希臘專利說明書72440(dr.T.H.Alivizatos)的已知組合物為包含D—核糖、DL—丙氨酸、尼克酸和維生素C的混合物，此混合物也被認為是一種組合物，此組合物有重要的免疫調節活性，能重建代謝平衡，增強機體的免疫力。
根據免疫調節療法的現代概念，進行機體免疫力的靶向作用，而且必須限定功能區及任何藥物制品的功能特性。如此定義在仍最常用的免疫調節化合物存在情況下，是非常復雜和非常困難的。所有這些困難存在的原因一方面是從生物資源(因此，定義所有它們可能的生物活性是困難的)獲得一些免疫調節化合物，另一方面，所有這些化合物有許多生物活性，使在調節免疫體系的范圍方面其功能的定位不可能。基于單個細胞因子使用的療法根據現代經驗是復雜的，經許多危害，它們是細胞因子受體的自身調節機制的相關結果，而且繼而免疫體系的效率降低了。也知道，經外源性細胞因子激活免疫體系不是有充分價值的，而其它天然成份是丟失的。因此有希望制備一種免疫調節制品，它能活化在“生理水平上”的體系，意味著在天然調節相關和控制的范圍之內。
本發明的目的在于用于免疫調節和佐劑療法的藥物組合物，此組合物包括代謝增強劑。根據關于免疫應答的調節及通過代謝增強劑可能影響此應答的已知信息，本發明拓寬了上述希臘專利說明書的知識范圍。代謝增強劑是一種天然非毒性化合物，在此情況下D—單糖的脫氧衍生物可影響細胞因子的生產，這意味著它是細胞水平免疫應答的真正調節劑。
本發明的目的是用于免疫調節和佐劑療法的藥物組合物，此組合物包括D—核酸 10—35g2—脫氧—D—核糖(代謝增強劑)10—35gDL—α—丙氨酸 2—12g尼克酸 2—10gL—抗壞血酸 7—20g硫胺0.2—2g谷氨酰胺0.01—15g將這些成份溶于1000ml生理鹽水中。
D—單糖脫氧衍生物的存在使其能對免疫體系產生靶向作用，而且能用于治療較寬范圍免疫缺陷及免疫系統疾病，特別是自身免疫疾病及和上述希臘專利說明書比較的腫瘤疾病的藥物制品的應用。
本發明實施例實施例1根據實施例A的藥物制品的組合物10g D—核糖10g 2—脫氧—D—核糖2g DL—α—丙氨酸2g尼克酸7g抗壞血酸溶于1000ml生理鹽水中。
實施例2生產特異性抗體的實施例1的制品的活性。
用C3H小鼠血清免疫7天后，通過卵蛋白，用ELISA測定特異性抗體。根據實施例A重復給定了制品，5次0.2mli.p.。結果見下表組 抗體x對照(％)對照672，8±55，62 100試驗組 1055，3±387，6156，8X(平均數±標準差)從表1給定的值清楚地看出，根據此實施例的藥物制品顯著地促進了特異性抗體的生產。
實施例3通過促細胞分裂劑誘導的脾細胞增殖及混合淋巴細胞反應方面，根據實施例A(實施例1)的制品的活性。
使用懸浮小滴方法進行試驗。根據實施例A，給定制品的量為3×0.2ml。腹腔注射于C3H小鼠。在緊接著用藥的最后一天，切除脾，并進行試驗。使用了促細胞分裂劑ConcavallinA(CONA)、Phyto-haemagglutinine(PHA)及脂多糖(LPS)。在試驗對混合淋巴細胞(MLR)培養時，使用了來自于DBA/1小鼠的脾細胞作為同種抗原。
下列表中給出了此實施結果從結果中看出，根據此實施例，本發明的制品不能刺激由CONA、PHA和LPS誘導的淋巴細胞的增殖，甚至可以看到抑制此增殖。組 dpm±SE 對照(％)CON A對照組834，8±175，0100試驗組490，7＝70，9 58，8PHA對照組1065，4±306，0 100試驗組593，7±125，955，7LPS對照組1068，9±274，4 100試驗組521，8±96，7 44，8MLR對照組494，2±49，6 100試驗組477，3±97，2 96，6實施例4根據本發明實施例B藥物制品的定量構成35g D—核糖35g 2—脫氧—D—核糖12g DL—α—丙氨酸10g尼克酸20g抗壞血酸溶于1000ml生理鹽水中。
實施例5根據實施例B，生產特異性抗體的藥物制品的活性。
用C3H小鼠的血清，在免疫第7天用卵蛋白給ELISA測定特異性抗體。根據實施例B，重復給定了制品，5次0.2ml，腹腔注射。結果見下表。
組 抗體x對照(％)對照組672，8±55，62100試驗組592，4±95，4 88x數±標準差從結果看出，根據實施例B的藥物制品不能刺激特異性抗體的產生。
實施例6通過促細胞分裂劑誘導的脾細胞的增殖及混合淋巴細胞反應，根據實施例B的制品的活性。
使用懸浮小滴方法進行試驗。根據實施例B，使用制品的量為3×0.2ml，腹腔注射于C3H小鼠。在接著用藥的最后一天除去脾，進行試驗。使用了促細胞分裂劑ConcavallinA(CONA)、Phytchaemagglu-tinine(PHA)和脂多糖(LPS)。在進行混合淋巴細胞培養(MLR)試驗時，來自DBA/1小鼠的脾細胞用作同種抗原。
組 dpm±SE 對照(％)
CON A對照組834，8±175，0 100試驗組 1109，4±225，3 132，9PHA對照組1065，4±306，0 100試驗組1475，6±213，4 138，5LPS對照組1068，9±274，4 100試驗組1500，6±258，2 140，4MLR對照組494，2±49，6 100試驗組411，0±47，7 83，2從結果中看出，根據實施例B的藥物制品不能顯著地刺激由CONA、PHA和LPS誘導的脾細胞的增殖。說明在試驗中沒有使用通用的標準品，因為WHO還沒有建立合適的而且一般有效的免疫調節制品，這種制品與其它或新制品可進行比較(免疫調節制品特性的定義問題已于有關現有技術情況的段落中討論了)。
實施例7根據實施例B，培養小鼠黑色素瘤B16，藥物制品的活性。
將小鼠黑色素瘤經右側皮內接種于20個小鼠，C57B16細胞株。吸入移植液后，使用藥物制品，根據Grossmann V.，JarkovskaI.，KvetinaJ.Farmacie9，1988400—404用于體表人/小鼠量的改變。這意味著，根據實施例B每只鼠總是有0.04ml制品進入尾靜脈。每使用5次，間隔兩天，二十八天使用二十次制品。對照組鼠獲得同等量的生理鹽水(10個鼠移植了B16黑色素瘤)。每三天觀察腫瘤一次，使用Slide calliper估計腫瘤大小。同時估計生長曲線和鼠的重量。根據實施例B在治療期間通過使用藥物制品可證實在腫瘤的實驗組和對照組之間腫瘤大小的顯著差異。治療之后，此差異已不顯著。顯然有必要找出一種合適的藥物使用期，論述此制品活性之間及在開始此療法前腫瘤塊之間的相關性。
曲線1、2、3分別給定了小鼠的重量改變、相對體積和腫瘤的相對表面指數。
實施例8根據實施例B，大鼠白血病過程中藥物制品的活性在定向試驗中，細胞株SD/IPCV，大鼠白血病過程之后估計了體重、大鼠的存活及血象值。血象值對個別類型細胞，在使用本制品前，根據實施例B，如下紅細胞 8050 000白細胞 12300血小板 826 000分化胚胎因子4髓細胞 0晚幼粒細胞 6柱細胞 0片段25嗜酸性細胞 0單核細胞4淋巴細胞56
X—細胞9使用制品進入尾靜脈，根據人/鼠體表(見實施例7)的比率敘述使用的量。
第5次給藥后，血象值改變如下紅細胞 7350 000白細胞 10900血小板 982000分化胚胎因子4髓細胞 0晚幼粒細胞 3柱細胞 0片段46嗜酸性細胞 0單核細胞3淋巴細胞35X—細胞 9每周估計類似的值。治療結束，獲得下列值紅細胞 6310 000白細胞 9300血小板 1162000分化胚胎因子0髓細胞 0
晚幼粒細胞 0柱細胞 2片段39嗜酸性細胞 0單核細胞6淋巴細胞51治療結束，將動物再飼養4周，在此期間末獲得下列值紅細胞 8700 000白細胞 8400血小板 778000分化胚胎因子0髓細胞 0晚幼粒細胞 0柱細胞 1片段22嗜酸性細胞 1單核細胞4淋巴細胞72X—細胞 0在整個試驗過程中估計了動物的體重。此值在8周的過程中沒有明顯改變，動物的臨床狀況也沒有明顯改變。從此結果看出，根據實施例B，經此療法，通過使用藥物制品，可能使接受治療的動物血象“正常化”。
在此實施例中獲得的結果，將作為用于靶試驗的起始物，此試驗與藥物制品的活性有關。此藥物制品在設定的用于治療腫瘤疾病的條件下，用于血液腫瘤病，也用于骨質疏松癥。
實施例9根據實施例B在小鼠和大鼠經靜脈和腹腔單一注射制品后的急性毒性限制試驗。
為了進行試驗，使用了正常飼養，鼠齡6周的MMRI鼠。雄性體重為31—37g，雌性重量為27.5—32g，這用于在靜脈注射的情況下。在用于腹腔注射的情況下，雄性重量為32—37g，而雌性重量為28—33.5g。
根據實施例B，在兩個應用模型中，使用制品的量為2ml/100g。靜脈應用經尾靜脈進行，腹腔應用經腹腔左下四分之一處進行。動物飼養于帶有空調的室內，控制生活制度(照光時間12小時，不照光時間12小時，溫度為23—25℃，相當濕度為50—70％)，動物飼養于聚丙烯鼠籠中(Type T3 Velaz)，在雌性情況下，每組5個動物。由于其對聚丙烯鼠籠(Type T2 Velaz)的侵犯性，雄性動物單獨飼養，在鼠籠中灑下消毒的木屑。在整個試驗過程中任意給動物ST1飼料(Velaz)和飲用水。
使用制品后21天期間每天觀察動物的臨床健康狀況及行為，每周估計動物體重一次。在此期末，動物經宏觀病理觀察。
根據國際上有價值的OECD規則，為研究急性毒性，進行試驗。
臨床研究靜注應用后，觀察到規律地深深地吹微風(使用后立即出現直到使用后30分鐘)，然后，直至此期結束，繼續觀察動物，不可能看到臨床毒性癥狀。生長曲線也未能顯出任何明顯的改變，以證實使用的藥物制品的有選擇的毒性作用。經腹腔注射應用后，又觀察到了有規律地深深地吹微風，以及痙攣性行走及“書寫”痙攣癥狀。30分鐘后，通過所有接著的時期，動物沒有出現任何臨床毒性癥狀。在上述實驗期間，不可能觀察到任何動物頻臨死亡，即不是在靜注后，也不是在腹腔注射后。21天的時間結束后，經寵觀病理觀察，觀察動物。靜注應用后，證明沒有相駁于正常狀況的病理改變既沒有雄性，也沒有雌性，在腹腔器官和胸腔器官中。而且在代替應用中，沒有觀察到病理改變。在腹腔注射應用情況下，觀察結果一致。能觀察到脾表面有白色包被，脾部分或全部與胃相接觸，腎臟有點輕。
根據上述結果，在國際有價值的OECD規則下，關于藥物制品的急性毒性研究的急性毒性限制試驗，對劑量為20ml/kg，靜注或腹腔使用后，兩性別小鼠，不能證實有任何毒性癥狀，而且也不可能證實小鼠的瀕臨死亡。
為了進一步試驗，使用了，鼠齡為6周的Wistar大鼠(常規飼養)。雄性體重為194—209g，雌性體重為159—170g，這指在靜脈使用的情況下。在腹腔使用的情況下，雄性體重為190至215g，雌性為161—175g。
根據實施例B，在兩種應用類型使用制品的量為2ml/100g，靜注應用經尾靜脈進行，腹腔應用經腹腔左上四分之一處進行。動物飼養于帶空調的房間，控制生活制度(12小時照光時間，12小時非照光時間，溫度為23—25℃，濕度為50—70％)于聚丙烯鼠籠中(TypT4 Velaz)，每組為同一性別，5個動物，并灑消毒木屑。在整個試驗期動物任意飼用標準顆粒狀飼料ST1(Velaz)和飲用水。
使用制品21天期間，每天觀察動物的臨床健康狀況及行為，每周估計動物體重一次。在此期末，動物接受肉眼病理觀察。
根據國際上有價值的OECD規則，為研究急性毒性，進行試驗。
臨床研究腹腔注射后，也是在靜注后觀察到有規律的深吹微風，及輕微的跛行，直至用后5小時都可見到。在全部維持期內，動物沒出現任何臨床癥狀，生長曲線也不能顯示任何顯著改變，以證實使用藥物制品的選擇性毒性作用。在試驗期間，在靜注后或制品的腹腔注射后，沒有動物死亡。
在21天結束，觀察動物，使動物接著肉眼病理觀察。靜注使用后，證明沒有相駁于正常狀態的病理改變，既不在雄性，也不在雌性，在腹腔和胸腔器官中，而且在取代應用中，仍沒有任何病理改變。只有腎臟略輕，腹腔注射后，雄性和雌性觀察結果是一致的觀察到在脾的表面有白色包被，脾部分或全部和胃相附，肝小葉連在一起，并有白色包被，腎臟略輕。
組織學研究，在超出要求研究范圍，通過OECD規則進行了。在肝臟不可能觀察到局部慢性增殖性肝炎，肝實質無病理改變。肝臟發現結果在正常范圍之內。在肝皮質的一些上皮細胞內發現了透明樣沉積物。
根據上述結果，急性毒性的限制試驗在OECD規則下進行，以測定藥物組合物的急性毒性。根據實施例B，用藥量為20ml/kg靜注或腹腔注射，在兩種性別的大鼠不產生任何顯著的毒性癥狀。在試驗期內無動物死亡。
權利要求
1.用于免疫調節和佐劑治療的藥物組合物，其特征在于此組合物含有溶于1000ml生理鹽水中的D—核糖 10至35g2—脫氧—D—核糖10至35g(代謝增強劑)DL—α—丙氨酸 2至12g尼克酸 2至10gL—抗壞血酸 7至20g硫胺0.2至2g谷氨酰胺0.01至15g
2.根據權利要求1的藥物組合物，其特征在于，它是靜脈應用的合適形式。
3.根據權利要求1的藥物組合物，其特征在于，它是腹腔應用的合適形式。
4. 2—脫氧—D—核糖用于制造權利要求1至3藥物組合物以用于免疫調節和佐劑治療的用途。
全文摘要
用于免疫調節和佐劑療法的藥物組合物，它包括代謝增強劑、2-脫氧-D-核糖和其它活性成分，即，核糖、DL-丙氨酸、尼克酸、L-抗壞血酸、維生素、硫胺和谷氨酸酰胺。此藥物組合物用于免疫調節和佐劑療法及預防免疫體系的減弱。
文檔編號A61K31/70GK1128948SQ94193037
公開日1996年8月14日 申請日期1994年7月12日 優先權日1993年7月12日
發明者O·庫福達基 申請人:阿拉喬斯醫藥公司