專利名稱：杠板歸提取物在制備抗肝纖維化藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于中醫藥領域,涉及以杠板歸polygonum perfolatum L.的全草為原料，制備杠板歸提取物，以及該提取物在制備抗肝纖維化藥物中的應用。
背景技術：
肝纖維化并不是獨立的疾病，而是肝臟受到炎癥損害的一種表現狀態，是由肝炎發展為肝硬化的必經階段。因此阻斷肝纖維化的發生和發展，對防治肝硬化和肝癌具有重要意義。肝纖維化的治療方法有很多，比如西藥，雖然西藥治療肝纖維化的速度快，但是容易給肝臟造成負擔，治標不治本。近年來，國內外大量研究表明中藥在治療肝纖維化方面顯示出顯著療效，因此采用從中藥中提取開發抗肝纖維化的藥物具有重要意義。中藥杠板歸系寥科寥屬植物杠板歸polygonum perfolatum L.的全草，又名貫葉寥、河白草、蛇見退等，全國均有分布。據古代中草藥和民間藥方記載，杠板歸用途十分廣泛，常用來治療癤腫、乳腺炎、百日咳、灣痢、黃疸、腎炎水腫、跌打腫痛、吐血便血、慢性濕疹、毒蛇咬傷等疾病。現代藥理學研究表明，杠板歸具有抗菌、抗病毒、抗誘變、降血壓、抗腫瘤、止血等作用。至今，已公開的與杠板歸有關的文章有60多篇，但以中藥杠板歸提取物在制備抗肝纖維化的藥物中的應用，以及對該藥物進行抗肝纖維化動物實驗的方法和結果，則未見報道。

發明內容
本發明的目的是提供中藥杠板歸提取物在抗肝纖維化藥物中的應用。實現本發明目的的技術方案是一種杠板歸提取物的新用途，用于抗肝纖維化，即是將從杠板歸中提取出的杠板歸提取物制成片劑、顆粒劑或口服液等劑型以治療肝纖維化疾病，其使用劑量為以60kg成人計，杠板歸提取物每日總攝取量不少于0. 36g。本發明所述的杠板歸提取物通過采用現有制備工藝制備將杠板歸全草陰干粉碎，得到粗粉，用70 % 85%乙醇水溶液回流提取2次，合并醇提液，濾過，濃縮至無醇味的濾液，過AB-8大孔樹脂柱，靜置吸附，用70 %乙醇洗脫，收集流出液，減壓濃縮至稀膏或稠
膏即可。本發明的積極效果是提供一種高效低毒、副作用小、藥源廣的治療肝纖維化疾病的新藥。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明內容作進一步的說明，但不是對本發明的限定。實施例一、杠板歸提取物的制備I、將新鮮采集的杠板歸全草陰干粉碎，得到杠板歸粗粉，用20倍量70%乙醇水溶液回流提取2次，每次I. 5小時，合并醇提液，濾過，濃縮至無醇味的濾液，過AB-8大孔樹脂柱，靜置吸附12h，用70%乙醇洗脫，收集流出液，減壓濃縮至稀膏。稀膏中藥材濃縮液=3:1，ff/Vo2、將新鮮采集的杠板歸全草陰干粉碎，得到杠板歸粗粉，用20倍量85%乙醇水溶液回流提取2次，每次I. 5小時，合并醇提液，濾過，濃縮至無醇味的濾液，過AB-8大孔樹脂柱，靜置吸附12h，用70 %乙醇洗脫，收集流出液，減壓濃縮至稠膏，稠膏烘干，打成80目細粉。稠膏中藥材濃縮液=5:1,W/V。二、將杠板歸提取物制成片劑、顆粒劑或口服液劑型
I、按杠板歸提取物的得率計算，取相當于IOOOg杠板歸提取物干膏細粉，約重24g，加淀粉至總量133g，制粒，壓成片劑，素片重0. 5g，每片含杠板歸提取物0. 09g。成人每天I次，一次4片。所述片劑藥物中每片杠板歸提取物百分含量為0. 18%，余量為藥劑成型輔料。2、按杠板歸提取物的得率計算，取相當于IOOOg杠板歸提取物干膏細粉，約重24g,加鹿糖粉與糊精的混合物至總量330g,制粒,得顆粒劑,分裝,每小包5g,每小包含杠板歸提取物0. 36g。成人每天I次，一次I包。所述顆粒劑藥物中每粒杠板歸提取物百分含量為0. 072%，余量為藥劑成型輔料。3、按杠板歸提取物的得率計算，取相當于IOOOg杠板歸提取物稀膏，體積335ml，加白砂糖300g,食用白酒50mL,加熱溶解,最后加水到660ml,過濾,得口服液,分裝，每支10ml，每支含杠板歸提取物0. 36g。成人每天I次，一次I支。所述口服液藥物中每支杠板歸提取物百分含量0. 036%，余量為藥劑成型輔料。三、本發明的杠板歸提取物抗肝纖維化藥效學實驗。I、材料I. I 動物SPF級SD大鼠80只，體重175_225g，雌雄各半，由桂林醫學院SPF實驗動物中心提供(許可證號SCXK2007-0001)。I. 2藥品與試劑取5000g杠板歸藥材，加20倍量70%乙醇回流提取2次，濃縮提取液，加水溶解，SAB-S大孔樹脂柱，得供試藥品，得率2. 40%，由桂林醫學院藥物研究所提供；質酸(HA)、層黏連蛋白(LN)、III型前膠原(PCIII)、IV型膠原(IV-C)試劑盒購于北京北方生物技術研究所；二甲基亞硝胺(DMN，純度99%)，購于天津市化學試劑研究所；秋水仙堿粉劑，serva公司產品；兔抗鼠TGF- P :多克隆抗體(1:100稀釋)，購于武漢博士德有限公司。I. 3 儀器TLL-C臺式冷凍離心機，北京四環科學儀器廠；TSN_695B型放免測量儀，上海日環儀器一廠；AU600全自動生化檢測儀,奧林巴斯生產；752型分光光度計,上海第三分析儀器廠；01ymPus BX51顯微鏡,奧林巴斯生產；BS1105電子天平,德國sartorius公司。2、方法2. I分組和給藥80只SD大鼠隨機分為正常組、模型組、杠板歸高劑量組、中、低劑量組和秋水仙堿組共6組，每組15只，雌雄各半。除正常對照組以外，其余各組大鼠均以0. 5% DMN溶液(I. 6mL. kg—1)腹腔注射，每周連續3天，每天I次，第I周用2/3劑量，以后用全量。秋水仙堿組劑量為0. lmg. kg'杠板歸高、中、低劑量組分別為7. 5，5. 0，2. 5g. kg_\除空白對照組和模型組給予等體積生理鹽水外，各組均灌胃給藥，I次/d，連續4周。4周末摘大鼠眼球取血，酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測血清透明質酸(HA)、層黏連蛋白(LN)、III型前膠原(PCIII)、IV型膠原(IV-C);免疫組化檢測轉化生長因子(TGF-^1)02. 2檢測指標嚴格按照試劑盒的要求規范操作，酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測血清透明質酸(HA)、層黏連蛋白(LN)、III型前膠原(PCIII)、IV型膠原(IV-C);取肝組織，做病理切片，HE染色，觀察HF的形成；免疫組化檢測轉化生長因子P 以大鼠肝組織TG F-P1陽性表達密度(面積)計算。依據2000年西安全國肝病會議通過的標準，將肝炎病變依纖維化程度分為4期，見表I。表I纖維化程度分期標準
Im 纖維化程度
b0無
SI匯管區纖維化擴大，限局竇周及小葉內纖維化S2匯管區周圍纖維化，纖維間隔形成，小葉結構保留
53纖維間隔伴小葉結構紊亂，無肝硬化
54早期肝硬化2. 3數據處理各組實驗數據均以T 土 s表示，采用統計軟件SPSS 13. 0進行方差分析，P < 0. 05有統計學意義。3、結果3. I藥物對肝纖維化大鼠血清HA，LN, PC III，IV -C含量的影響模型組大鼠血清中HA，LN, PC III，IV -C水平明顯高于正常組，具有顯著性差異(均p〈0. 01)，說明造模成功；杠板歸高、中劑量組和秋水仙堿組大鼠血清中HA，LN, PCIII，IV -C水平均明顯低于模型組，具有顯著性差異(P〈0. 05或p〈0. 01);杠板歸低劑量組大鼠血清中HA, PC III，IV -C水平與模型組比較，無顯著性差異(p>0. 05)，見表2。表2杠板歸對DMN誘導的肝纖維化大鼠血清HA，LN, PC III，IV -C含量的影響(7士s)組別 N 劑量/呵.kg '~HA/ng, L—1LNTTgT1PCIII/ u g, L—1 IV-C/ u g. L—1 ~
正常 15二97.55 + 12.89^ 70.99±77. W 50.23+15.35n 31.66+6.1121
模型 8- 389.37. ±1UU 0 281.25土45. 17 72.14±27.98 138.00±22. 38
75. 30 + 22. 87
IRIl 10 0.1 192. 35±98. 31 =) 128. 65± 87 . 792 ) 52. 13± 12. 11
2、
高劑量 11 7500 165. 69±81.01 —’ 123. M±44. 35 2; 53. 91±22. Ol2' 70. 54±65. 33中劑量 11 5000 188.96±65.25 :) 120.68±13.2,i58. 20±46.31° 80. 12±23.39::)低劑量 9 2500 368. 12±55.64 151. 29土 11. 35” 70. 56±61.54 118. 20土 17. 31注與模型組比較DpCO. 05，2)p〈0. 01。3. 2病理形態學觀察(HE染色)與正常組相比，模型組肝小葉結構紊亂，小葉內肝細胞廣泛水腫，可見大量脂質空泡形成；匯管區可見大量炎性細胞浸潤，成纖維細胞大量增生，膠原纖維形成，形成粗大的纖維間隔，并將增生的肝細胞團分隔成大小不等的假小葉，提示造模成功。與模型組比較，杠板歸高、中劑量組、秋水仙堿組大鼠肝臟炎癥程度和纖維化程度均明顯降低，尤其杠板歸高、中劑量組肝組織病變改善效果更為明顯，肝小葉結構基本完整，極少有假小葉形成，膠原沉積明顯減少。3. 3肝組織TGF- ^ :表達正常組僅見于匯管區、肝竇內皮細胞、中央靜脈周圍細胞且著色較淺，范圍較窄；模型組中主要表達于匯管區周圍細胞、竇內皮細胞、中央靜脈周圍細胞、部分肝細胞及纖維間隔內，呈棕黃色顆粒狀，范圍廣；杠板歸高、中劑量組、秋水仙堿組陽性表達明顯下降，多見于中央靜脈周圍細胞、肝竇內皮細胞、匯管周圍細胞；杠板歸低劑量組中表達于匯管區周圍細胞、肝竇內皮細胞、中央靜脈周圍細胞、部分肝細胞及纖維間隔內，呈棕黃色顆粒狀，范圍廣(p〈0. 05或p〈0. 01);杠板歸低劑量組TGF-P丨表達無統計學意義(P>0. 05)。見表3。表3杠板歸對大鼠肝纖維化模型TGF- ^ :表達的影響SDN 劑量/mg. kg'TGF-1面密度
正常組15二0.025 ±0.004 ~
模型組8-0.201 ±0.083
秋水仙堿組100. I0.059±0.0172)
杠板歸高劑量組1175000. 055±30. 068
杠板歸中劑量組1150000.088±0.052 a 杠板歸低劑量組925000. 151 ±0.092注與模型組比較DpCO. 05,2)p<0. 01。將大鼠肝組織病理結果分級，經秩和檢驗，與模型對照組比較，秋水仙堿組和杠板歸高、中劑量組均存在統計學意義(P < 0. 05或P < 0. 01)，見表4。表4肝纖維化大鼠病理檢查結果
組別(n)劑量/mg. kg 1 b b^Fi5
正常(15)115~0 0 0 0 <0.01 ~
模型(8)-0 0 1 3 4 -
r^co1 秋水仙堿(10) 0. I2 7 I 0 0 <0.01
L0053」
杠扳歸(11)7o0018200<0.01
CiI J5000154 I0<0.01
(y)250000234>0.05 綜上所述，本發明首次對杠板歸提取物進行了抗肝纖維化的研究，通過動物實驗表明，杠板歸提取物具有較好的的抗肝纖維化的藥理作用，作用機制與杠板歸通過保肝，降低TGF-P i表達從而抑制肝纖維化的啟動密切相關。可用于制備片劑、口服液、顆粒劑等劑型的治療肝纖維化的中藥制劑。
權利要求
1.杠板歸提取物在制備抗肝纖維化藥物中的應用，其特征是所述杠板歸提取物是通過將杠板歸全草陰干粉碎，得到粗粉，用70% 85%乙醇水溶液回流提取2次，合并醇提液，濾過，濃縮至無醇味的濾液，過AB-8大孔樹脂柱，靜置吸附，用70%乙醇洗脫，收集流出液，減壓濃縮至稀膏或稠膏制備得到。
2.根據權利要求I所述的應用，其特征是將杠板歸提取物制成片劑、顆粒劑或口服液劑型。
全文摘要
本發明公開了杠板歸提取物在制備抗肝纖維化藥物中的應用，通過動物實驗表明，杠板歸提取物具有較好的抗肝纖維化的藥理作用，作用機制與杠板歸通過保肝，降低TGF-β1表達從而抑制肝纖維化的啟動密切相關，對肝纖維化有很好的抑制作用。本藥高效低毒，副作用小，藥源廣，開發成本低。
文檔編號A61P1/16GK102764306SQ20121029015
公開日2012年11月7日 申請日期2012年8月15日 優先權日2012年8月15日
發明者張可鋒, 段小群, 高雅 申請人:桂林醫學院